Abstract
Formation osseuse d'ostéoblastes interagissent avec les ostéoclastes résorbent l'os afin de coordonner la rotation de la matrice osseuse, et pour contrôler l'homéostasie du squelette. Medaka et larves de poisson zèbre sont largement utilisés pour analyser le comportement des cellules osseuses lors de la formation osseuse, la dégénérescence et la réparation. Leur limpidité optique permet la visualisation de cellules marquées par fluorescence des os et des colorants fluorescents liés à la matrice osseuse minéralisée. Notre laboratoire a généré medaka transgénique poissons qui expriment le facteur de ostéoclastes induisant Activator Receptor du nucléaire facteur kB Ligand (RANKL) sous le contrôle d'un promoteur de choc inductible chaleur. L' expression ectopique des résultats de RANKL dans l'excès de la formation des ostéoclastes activés, qui peuvent être visualisés dans des lignées rapporteuses d'expression nlGFP sous le contrôle de la cathepsine K (ctsk) promoteur. induction de RANKL et la formation des ostéoclastes ectopique conduit à de graves phénotypes de l'ostéoporose comme. Composé transgénique médaka linda qui expriment ctsk: nlGFP dans les ostéoclastes, ainsi que mCherry sous le contrôle de l'osterix (osx) promoteur dans les ostéoblastes prématurés, peuvent être utilisés pour étudier l'interaction des deux types de cellules. Ceci facilite l'observation in vivo du comportement cellulaire dans des conditions de dégénérescence osseuse et la réparation. Ici, nous décrivons l'utilisation de ce système pour tester un médicament couramment utilisé dans le traitement de l'ostéoporose humaine et décrivent un protocole d'imagerie en temps réel. Le modèle de medaka complète les études de culture et de souris cellulaire, et offre un nouveau système pour l'analyse in vivo de l' action de la drogue dans le système squelettique.
Introduction
Le squelette vertébré fournit un support structurel et de protection des organes, permet la mobilité, et sert de source de calcium. Tout au long de la vie, la matrice osseuse extracellulaire est continuellement remis à maintenir la stabilité et la rigidité osseuse. Ce processus nécessite l'activité étroitement coordonnée et interaction des ostéoblastes osseuses formant et ostéoclastes résorption osseuse. Les ostéoblastes sont dérivées de progéniteurs mésenchymateuses multipotentes et produisent du collagène pour former le ostéoïde, la partie protéique de la matrice osseuse 10. Ostéoblastes interagissent avec les ostéoclastes pour parvenir à une activité équilibrée des deux types de cellules, ce qui est nécessaire pour contrôler l' homéostasie osseuse 7. Du fait de ces interactions régulatrices complexes, les réponses au traitement de la toxicomanie et de l' homéostasie osseuse ne peuvent être complètement examinés à l' aide des études in vitro. Par conséquent, il existe une forte demande pour des modèles animaux. En comparaison avec les paramètres de culture cellulaire, des modèles in vivo peut fournirdes informations précieuses sur les réseaux multicellulaires au sein de l'environnement de l'os.
De nombreux modèles de souris existent pour une variété de troubles osseux humains , y compris l' ostéoporose 16. Toutefois, la taille et l'accessibilité des embryons de souris représentent des limitations significatives pour l'imagerie en temps réel des processus squelettiques. Les petits poissons téléostéens, d'autre part, de servir comme une alternative intéressante pour l' imagerie in vivo. Zebrafish (Danio rerio) et medaka (Oryzias latipes) sont devenus des modèles animaux populaires pour la recherche du squelette au cours des deux dernières décennies 17, 19, 22, 24. Os dans les poissons téléostéens et chez les mammifères est très similaire, à la fois sur une structure et sur le plan physiologique, et la plupart des gènes régulateurs clés et les voies de signalisation sont conservés 3. Comme chez les mammifères, les poissons téléostéens réguler soigneusement l'activité des ostéoblastes et les ostéoclastes pour équilibrer la formation osseuse et la résorption 26. Plus important encore, la clarté optique de fiLes larves sh permet l'utilisation de rapporteurs fluorescents pour marquer les cellules osseuses et la matrice calcifiée squelettique 8, 9, 12, 21, 23, ce qui facilite l'observation des processus cellulaires chez l'animal vivant. En outre, une série d'outils génétiques a été généré pour faciliter la recherche biomédicale pertinente dans le poisson. Pour medaka en particulier, les méthodes pour la mutation du gène ciblé par CRISPR / cas9 2, cellule-lignage traçage 6, et transgénèse 14 ont été récemment mis en place et sont maintenant largement utilisées 15 spécifique au site.
Les larves de petite téléostéens ont été utilisés avec succès pour les écrans chimiques, qui ont conduit à la découverte de plusieurs médicaments pharmacologiquement pertinentes 1, 18.
Les larves de poissons sont tolérantes à de faibles concentrations de DMSO et sont capables d'absorber des composés à partir de leur environnement aquatique, que ce soit à travers la peau ou dans le tractus gastro - intestinal 1, 5. Notre laboratoire précédemment repdes lignes de medaka transgéniques qui expriment SOUTENUS reporters fluorescents dans les cellules osseuses sous le contrôle de divers osteoblast- et des promoteurs spécifiques des ostéoclastes. Ceux - ci comprennent les ostéoblastes prématurés (collagène 10a1, col10a1; osterix, osx) 20, 21, ostéoblastes matures (ostéocalcine, osc) 27, et les ostéoclastes (cathepsine K, ctsk) 24. Nous avons également généré une lignée transgénique qui exprime le facteur d'ostéoclastes induisant Activator Receptor du nucléaire facteur kB Ligand (RANKL) sous le contrôle d'un choc promoteur inductible de chaleur 24.
L'induction de RANKL dans ce système conduit à la formation ectopique des ostéoclastes actifs. Cela conduit à une augmentation de la résorption osseuse et un phénotype de l'ostéoporose comme sévère, avec considérablement réduit la minéralisation dans les corps vertébraux. Nous avons récemment montré que l'activité des ostéoclastes dans ce modèle peut être bloqué par le bisphosphonates étidronate et l'alendronate, two les médicaments couramment utilisés dans le traitement de l' ostéoporose humaine, validant ainsi médaka comme système de modèle approprié pour l' ostéoporose 27.
En raison de leur grande taille de la couvée, le développement rapide, et la petite taille des embryons, larves de medaka transgéniques sont particulièrement adaptés pour le criblage à grande échelle de médicaments contre l'ostéoporose et pour l'analyse in vivo du comportement des cellules osseuses. Des études en medaka peuvent donc compléter efficacement les expériences dans des cultures cellulaires et chez les souris qui sont destinées à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles thérapies pour les troubles osseux humains.
Dans la présente étude, nous décrivons un protocole pour traiter medaka larves os reporter du médicament contre l'ostéoporose commune, alendronate. Nous décrivons également en détail comment les larves traitées sont montés et préparés pour l'imagerie en direct de la matrice osseuse et les cellules osseuses. Ces protocoles peuvent être facilement adaptés à d'autres petits composés chimiques qui travaillent soit comme anabolisant de l'os ou de la drogue antirésorptifs. </ P>
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Protocol
Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux protocoles de l'Université nationale de Singapour (R14-293) Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC) approuvés.
1. Les poissons Elevage et la collecte d'embryons
- Soulever WT, ctsk: nlGFP 24, RANKL: HSE: CFP 24 et osx: mCherry 21 simple ou medaka poisson composé transgénique à 26 ° C sous un cycle de lumière contrôlée (14 h de lumière, 10 h foncé) pour induire la ponte.
- frai Daily a lieu pendant les 30 premières minutes après le feu est allumé. Les œufs collent ensemble à travers des filaments et attachent à l'abdomen de la femelle pendant plusieurs heures. Utilisez un filet à mailles fines pour attraper un adulte de sexe féminin portant une grappe d'oeufs. Que le poisson se reposer brièvement dans le filet, puis masser doucement le ventre du poisson pour enlever soigneusement la grappe de l'ovule fécondé de l'abdomen de la femelle.
NOTE: Une femme saine medakapeut produire 10 - 20 oeufs par jour pendant environ 5 mois. - Placez les oeufs dans une boîte de Petri en plastique de 60 mm. Utiliser une pipette en plastique pour rincer les embryons avec 5 - Solution (poisson de milieu de 10 ml de 0,3 x Danieau; mM de NaCl 19,3 mM , KCl 0,23, 0,13 mM MgSO4, mM de Ca 0,2 (NO 3) 2 et 1,7 mM d' HEPES, pH 7.0). Ajouter 1 ml de 0,25% (p / v) de bleu de méthylène solution mère à 2,5 L de milieu de poissons pour empêcher la croissance fongique.
- Roulez doucement amas d'oeufs pour former un noeud de filaments de fixation. Utilisez une pince pour retirer soigneusement les filaments de fixation des grappes d'oeufs fertilisés pour obtenir des embryons individuels (Figure 1A).
- Stade , les embryons selon Iwamatsu 2004 13.
- Culture 20 - 30 embryons par 60 mm en plastique boîte de Pétri dans un incubateur à 28 °. Changer le support quotidien pour assurer le développement normal des embryons.
NOTE: Le temps autour de la scène de l'éclosion (8-9 d post-fécondation,DPF) est particulièrement critique pour la survie. Retirer chorions flottant librement à maintenir le milieu propre et pour assurer un bon taux de survie des larves.
2. Transgenic Embryo Screening
- Utilisez un stéréomicroscope équipé d'une lampe à mercure pour l'imagerie de fluorescence et la GFP, RFP, et les filtres de la PCP pour dépister les embryons transgéniques pour l'expression de rapporteur fluorescent en utilisant un grossissement de 40X.
- Visuellement identifier osx: mCherry embryons par mCherry journaliste expression au début de formation des os crâniens, comme le cleithrum, sur les deux côtés de la tête postérieure (figure 1B, flèche), et le parasphénoïde, dans une position centrale dans le crâne ventral ( Figure 1B, flèche).
NOTE: expression Reporter commence à partir de 5 DPF partir 21. - Identifier ctsk: nlGFP embryons par expression nlGFP forte dans la tête (figure 1C, flèche) et la queue (figure 1C, flèche), à partir de6 DPF.
NOTE: les ostéoclastes endogènes forment seulement après 21 DPF. cellules à ce stade précoce (6 DPF) nlGFP exprimant ne sont pas ostéoclastes , mais d' autres, jusqu'à présent non caractérisé, CTSK cellules -positifs 24. - Identifier RANKL: HSE: PCP embryons transgéniques par l' expression omniprésente PCP après un traitement à court choc thermique pendant 20 min à 39 ° C, menée à 2 DPF ou tard à des fins de dépistage.
NOTE: Le RANKL et CFP transgènes sont sous le contrôle du même bidirectionnel Element choc thermique (HSE). Expression PCP indique RANKL réussie induction 24. - Effectuer un 1,5 - traitement de choc thermique de 2 h à 9 DPF ou tard pour induire un grand nombre d'ostéoclastes ectopiques dans la région du tronc, ce qui entraîne par conséquent dans un phénotype de l' ostéoporose comme 24.
NOTE: L'expression de RANKL Transgenic induite à 9 résultats DPF dans une activation ectopique de cellules ostéoclastes progénitrices dormantes, qui ne se déclenche pas de façon endogèneavant le 21 DPF. Utilisez un bain d'eau pour obtenir la stabilité 39 ° C conditions. Laissez les embryons de medaka boîte de Pétri contenant flottent à la surface de l'eau. Assurez-vous que le couvercle de la boîte de Pétri est sec pour éviter le naufrage du plat. - Embryons d'écran à partir des lignes de composés, tels que RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP double transgénique et osx: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP triple transgénique, selon le modèle d'expression de chaque transgène individuel.
NOTE: Les embryons transgéniques hémizygotes et homozygotes ont été distingués par différents niveaux du transgène rapporteur de fluorescence. les embryons homozygotes avaient une intensité de fluorescence qui a été à peu près doublée par rapport à celle des plantes transgéniques hémizygotes. Lignes de composés qui étaient homozygotes pour les deux RANKL: HSE: PCP et ctsk: nlGFP ont été obtenus par incrossing répétée sur plusieurs générations. Pour triple transgénique osx: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP poissons, RANKL homozygote: HSE: CFP / ctsk: poissons nlGFP ont été croisés avec osx homozygote: transporteurs mCherry. La descendance triple transgénique hétérozygote résultant ont été soulevées et incrossed pour obtenir des embryons homozygotes pour RANKL: HSE: CFP. Le RANKL: HSE: CFP transgène doit être homozygote pour obtenir l'induction efficace des ostéoclastes ectopiques.
Figure 1: WT et Transgenic Medaka Embryons à 7 D post - fécondation (DPF). A. WT embryons observés avec un éclairage en fond clair. B. Embryons transgéniques montrant osx: mCherry expression autour de la cleithrum (flèche) et parasphénoïde (flèche). C. Embryons transgéniques montrant ctsk: expression nlGFP dans la tête (flèche) et la queue (flèche). Barres d'échelle: 500 um.025 / 55025fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
3. Traitement des bisphosphonates Medaka Larves
- Préparer des solutions contenant différentes concentrations de bisphosphonates (BPS) pour des études dose-réponse.
NOTE: Le BP exemplaire utilisé dans ce protocole est alendronate.- Dissoudre l'alendronate dans le milieu de poisson à une concentration de 100 pg / mL pour préparer une solution de stock.
- Utilisez un mélangeur vortex pour assurer la dissolution complète. Conserver la solution mère à 4 ° C.
- Préparer des solutions différentes de travail en diluant la solution mère avec le milieu de poisson à une série de concentrations ( par exemple, 25, 37,5, 50, 62,5 et 75 ug / ml).
REMARQUE: Différents médicaments peuvent avoir différentes absorption, distribution, métabolisme et excrétion (ADME) les paramètres qui doivent être pris en compte lors des essais en utilisant ce système de larves de medaka. En outre, la solubilité et la stabilité médicaments peuvent varier quandappliqué sous forme de solution aqueuse. des composés solubles dans l'eau peuvent avoir besoin de moins d'abord être dissous dans des solvants organiques tels que le DMSO. Dans ce cas, une solution mère est préparée dans du DMSO, qui est ensuite diluée dans un milieu de poisson. Notez que les solutions de travail dans (milieu de poissons) de l'eau peuvent être stockés dans le réfrigérateur pendant plusieurs semaines. Cependant, les solutions contenant du DMSO doivent être stockés à température ambiante pour empêcher la cristallisation.
- Transfert medaka larves dans des plaques à six puits (six larves / puits) pour BP (alendronate) traitement ultérieur.
- Retirez le support de poissons soigneusement à l'aide d'une pipette en plastique propre et ajouter un petit volume (env. 0,5 mL) de solution alendronate à chaque puits.
- Évitez milieu de restes de poisson, comme la solution BP ajoutée pourrait être diluée, ce qui est particulièrement critique pour les solutions de alendronate moins concentrées.
- Retirer un petit volume de solution d'alendronate (jusqu'à 0,5 ml) de chaque puits avec une pipette en plastique propre et le remplacer par un plus grand volumoi (4 ml) de solution alendronate.
- Changer le milieu tous les jours pour assurer le développement d'embryons normaux.
4. Coloration en direct de la matrice minéralisée-os
- Dissoudre 0,5 g d'Alizarine complexone (ALC, l'acide 3-Alizarine-méthyliminodiacétique), soit 0,05 g de calcéine dans 50 ml de milieu de poisson pour préparer 1% et 0,1% des solutions mères, respectivement. Utilisez un mélangeur vortex pour assurer la dissolution complète.
REMARQUE: moyenne du poisson sans l'addition de bleu de méthylène est utilisé dans la présente et les étapes suivantes pour réduire l'autofluorescence dans les larves. - Utilisez un filtre de seringue et à usage unique (0,2 um) pour filtrer la solution de coloration. Conserver la solution filtrée dans l'obscurité à la température ambiante.
NOTE: La couleur de la solution filtrée de coloration ALC clair est jaune foncé à l'orange. La couleur de la solution de calcéine claire filtrée est jaune vif. Les solutions peuvent être utilisées pendant plusieurs mois. - Diluer la solution ALC ou calcéine stocks filtré 1:10 en milieu de poissonet incuber les larves de medaka pendant 1,5 - 2 h (solution ALC 0,1%) ou 2 - 2,5 heures (solution de calcéine 0,01%) dans un incubateur à 28 ° si les larves entre 9 et 17 DPF sont utilisés. Gardez les échantillons dans l'obscurité.
- Transfert des larves à un milieu de poisson frais à l'aide d'une pipette en plastique propre.
- Retirez le support de poisson avec une pipette en plastique propre et ajouter du milieu de poisson frais. Répétez cette étape pour 3 - 4 fois jusqu'à ce qu'aucune solution rouge- ou jaune teinté (ALC ou calcéine, respectivement) qui reste. Laisser les larves de poisson dans le milieu pendant 30 - 60 minutes avant de les monter pour l'imagerie afin d'éviter épifluorescence du milieu.
NOTE: 0,1% solution de coloration ALC est nocif pour les larves de medaka pour des temps d'exposition prolongée. Des temps d'incubation de plus de 2 h affectent la survie des larves. La concentration et le temps de coloration doivent donc être optimisés pour les différentes étapes pour atteindre la survie de l'embryon et de coloration des résultats optimaux.
5. direct Fluorescence Imaging p>
- Anesthetize les larves de medaka avec 0,01% Tricaine (éthyl méthanesulfonate 3-aminobenzoate) en milieu de poisson.
NOTE: anesthésiés larves deviennent immobilisées au bout de 5 - 10 min dans une solution Tricaine et habituellement sont couchés soit sur leurs côtés ou le dos. - Utiliser un microloader plastique pour orienter les larves en fonction de la région d'intérêt. L'orientation des larves utilisées dans ce protocole est latéral.
- Utilisez un stéréomicroscope avec fluorescence illumination pour l'imagerie. Utilisez un grossissement élevé lors de la prise d'images, en se concentrant sur les différentes parties des larves (tête, tronc antérieur, tronc postérieur, et la queue). Assemblez les images individuelles ensemble au chevauchement des régions en utilisant un logiciel de traitement d' image approprié (empiècements de la figure 3G).
NOTE: Cela contribue à améliorer la qualité d'image de toutes les parties du corps concernées dans le plan focal correct. - Retour les larves au milieu de poissons pour la récupération après l'imagerie.
- Anesthetize les larves avec 0,01% Tricaine en milieu de poisson pendant 5 - 10 min jusqu'à ce qu'ils deviennent immobilisés.
- Dissoudre l'agarose à faible point de fusion à 1,5% dans un milieu de poisson en le chauffant dans un four à micro-ondes. Refroidir cette solution à environ 30 ° C.
- Ajouter 0,5 - 1 ml de liquide de 1,5% à faible point de fusion d'agarose en milieu de poisson à une boîte de Pétri à fond de verre. Transférer les larves anesthésiés dans la solution à l'aide d'une pipette en plastique propre.
REMARQUE: Prenez des précautions particulières que la température du liquide à faible point de fusion d'agarose est suffisamment faible pour ne pas nuire aux larves. - Avant la solidification d'agarose, en utilisant une microloader plastique pour pousser les larves au fond de la boîte de Petri et orienter les larves en fonction de la région d'intérêt. L'orientation des larves utilisées dans ce protocole est latéral.
NOTE: Les échantillons sont prêts pour l'imagerie confocale en direct après l'agarose se solidifie complètement. - Utilisez un microscope confocal à Acqimages UIRE.
- Utilisez une ligne de laser 543 nm pour les analyses mCherry et ALC coloration. Utilisez une ligne laser à 488 nm pour nlGFP et analyse calcéine coloration.
- Après l'imagerie, ajouter du milieu de poisson à la boîte de Pétri et d'utiliser une paire de fines aiguilles de seringues (27 G x 1½ ") pour retirer soigneusement les larves de l'agarose. Transférer les larves avec résiduellement fixé agarose à une boîte de Pétri avec un milieu de poissons pour récupérer .
- Traiter les images à l' aide d' un logiciel d'analyse d'images 27.
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Representative Results
nombre d'œufs abondantes, ainsi que la petite taille des larves, font medaka un excellent modèle pour le dépistage des drogues. Une plaque à six puits unique a été utilisé pour la culture jusqu'à 36 larves, ce qui est suffisant pour fournir des données statistiquement significatives. Un autre grand avantage de l'utilisation du poisson pour l'analyse du squelette est la possibilité de faire l'imagerie en direct. La transparence des larves de poisson permet d'utiliser des protéines fluorescentes pour marquer les cellules osseuses, ainsi que l'utilisation de colorants qui se lient à la matrice osseuse afin de visualiser la minéralisation. Les larves de poissons sont faciles à manipuler, et la préparation des échantillons pour l' imagerie est simple (Figure 2).
A RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP line double-transgénique a été utilisé pour visualiser la formation ectopique des ostéoclastes induite par RANKL. En outre, osx: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP larves triple transgénique ont été utilisés pour la détection simultanéeion des ostéoblastes et les ostéoclastes prématurés différenciés (figure 3). Vue d' ensemble des images ont été prises avec un stéréomicroscope (figure 3A - C et F - H), alors que la microscopie confocale a été utilisé pour visualiser les processus au niveau cellulaire (Figure 3D, E, I, J têtes de flèches). La SLA tachée matrice osseuse le long des arcs de neurones (na) et centra (c) (figure 3D) a été utilisé comme référence pour déterminer la position des cellules osseuses marquées par fluorescence (Figure 3D et I).
Un avantage de la visualisation simultanée des ostéoclastes et des ostéoblastes dans la même larves intacte est que l'activité anti-résorption osseuse par rapport anabolisant d'un composé testé peut être distingué. Pour ce faire, la répartition des ostéoclastes et des ostéoblastes est déterminée le long de la matrice osseuse minéralisée préexistante et nouvellement formé. Sucune coloration excessive de la matrice osseuse avec la SLA (rouge) (figure 4A, B) , suivie par la calcéine (vert) (Figure 4C, D) révèle novo une matrice osseuse déminéralisée (vert) (Figure 4E, F têtes de flèches). Cet essai permet la quantification du taux de formation osseuse. Augmentation de novo des taux après le traitement médicamenteux indiquent un effet osseux-anabolique du composé testé. En revanche, la persistance de points de la matrice osseuse pré-existantes à une activité anti - résorption du médicament 27. Les deux étiquettes ALC et calcéine dans les larves sont stables pendant au moins deux semaines, permettant une observation continue de formation d'os nouveau dans les larves de medaka in vivo.
Figure 2: Schéma de traitement de la toxicomanie, en direct ALC Coloration et montage pour confocale en direct Imaging. A. Une plaque à six puitsest utilisé pour le traitement médicamenteux pour assurer un espace suffisant pour les larves. La matrice minéralisée d'os est colorée par incubation des larves de medaka dans 0,1% ALC pendant 1,5 - 2 h dans l'obscurité. Les larves Stained sont rincés plusieurs fois avec le milieu de poisson. 0,01% Tricaine est utilisé pour anesthésier les larves. B. Après le transfert des larves anesthésiés à tiède et de liquide de 1,5% à faible point de fusion d'agarose, leur position est ajustée avec un microloader plastique. Les larves sont ensuite monté en fonction de la région d'intérêt (par exemple, la colonne vertébré est mieux imager dans la vue latérale). Après l'agarose est solidifié, l'échantillon monté est prêt pour l'imagerie confocale. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:
Figure 4: Analyse de De Novo Minéralisation de matrice osseuse par la coloration successive de Larves avec ALC et calcéine à 12 et 15 DPF, respectivement. A, B. ALC-tachée matrice squelettique à 12 DPF. C, D. Calcéine-tachée matrice squelettique à 15 DPF dans la même larves. E, F. Fusionné montrant l'image du nouveau mineralisée matrice osseuse au niveau des extrémités des arcs neuraux (vert, flèches). B, D et F. Confocal pile de la zone encaissée A, C et E, respectivement. Les barres d'échelle en A, C et E: 100 um. Les barres d'échelle par B, D et F: 50 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Images représentatives Affichage d' un Unsuccessful et un succès de montage pour imagerie confocale. AC. montage Unsuccessful dans les résultats bas point de fusion d'agarose dans une partie de l'échantillon (à gauche) se trouvant en dehors du plan focal. DF. montage réussi montrant tout regions d'intérêt dans le même plan focal. Barres d'échelle: 50 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Traitement alendronate prévient la résorption osseuse. ALC-tachée matrice squelettique et ctsk: nlGFP exprimant ostéoclastes chez les larves de medaka transgénique sans RANKL induction (AC), avec l' expression de RANKL induite par un choc thermique (DF), et avec l'ajout de l' alendronate sur le même jour que RANKL induction (GI) . C, F et I. Piles confocale des zones encadrées en A et B, D et E, G et H, respectivement.C. ALC-tachée colonnes vertébrales intactes sans RANKL induction. F. Induite par RANKL, ctsk exprimant sous forme de ostéoclastes autour des arcs neuraux et le centra, entraînant la résorption complète de la matrice minéralisée des arcs neuraux (flèches) et des défauts à la centra (pointes de flèches). G. L'addition de l' alendronate n'a pas d' effet sur la formation de ctsk: nlGFP ostéoclastes exprimant, mais il bloque la résorption osseuse et laisse les arcs neuraux et le centra intacte. Les barres d'échelle en A, B, D, E, G et H: 100 um. Barres d'échelle en C, F et I: 50 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Étapes critiques dans le Protocole
Il est essentiel que les conditions pour le traitement de choc thermique sont cohérentes et stables lorsque l'on compare les différents échantillons. Des conditions de température stables assurent des niveaux similaires de RANKL induction dans les larves transgéniques et, par conséquent, la formation des ostéoclastes comparables, ce qui peut être confirmé par criblage ctsk: Expression nlGFP. En fin de compte, ce qui conduit à un degré similaire de la résorption osseuse induite ectopique et des lésions de l'ostéoporose comme, comme validé par coloration ALC. Un tel modèle expérimental permet alors la détermination et la comparaison des effets de divers médicaments anti-résorption ou le même médicament appliqué à différentes concentrations.
Modifications et dépannage
Les larves de poissons sont très fragile et doit être manipulé avec précaution pendant le processus de montage pour l'imagerie. Pour l'imagerie optimale confocale en direct, les larves sont soigneusement positiun onné avec microloader plastique, plutôt que d'une pince, afin d' éviter des blessures (figure 2B). L'extension du jaune d'oeuf est moins sensible aux stimuli de toucher et peut être utilisé pour orienter les larves avec une microloader, évitant ainsi le déplacement des larves lors du montage. La région d'intérêt doit être monté à plat pour faire en sorte que l'échantillon peut être focalisé dans un plan focal pendant la formation d' image (figure 5). le comportement des cellules osseuses est très dynamique et nécessite la résolution temporelle et spatiale élevée lors de l'imagerie en direct. Idéalement, time-lapse imagerie par analyse confocale on souhaite suivre les interactions ostéoblastes-ostéoclastes au cours de plusieurs heures dans les larves vivant. Cependant, ceci exige des conditions particulières pour maintenir les larves vivantes et dans une position fixe. Pour l'anesthésie prolongée, une solution de 0,001% Tricaine dans un milieu de poisson est ajoutée pour couvrir la solidification d'agarose au cours de l'imagerie. Cela empêche l'agarose de se dessécher et empêche secousses soudaine des larves au cours imagtion pendant plusieurs heures.
Limites de la technique
L'ostéoporose est une maladie qui affecte principalement les hommes âgés. Par conséquent, un idéal modèle in vivo pour le criblage de médicaments de l' ostéoporose devrait impliquer les poissons adultes. Jusqu'à présent, cependant, la technique de l'imagerie en direct décrite dans le présent rapport se limite aux stades embryonnaire et larvaire. Actuellement imagerie disponible confocale ne permet pas l'imagerie en direct des cellules osseuses génétiquement marquées chez les poissons adultes en raison des limites de la profondeur de pénétration. Le développement récent de la Fiche Lumière Fluorescence Microscopy (LSFM), qui permet l'imagerie en profondeur dans les tissus vivants, ainsi que la disponibilité de moins souches pigmentées "voir à travers" medaka, fait-il concevable que cette limitation sera bientôt surmontée, et l'imagerie en direct les cellules osseuses chez les poissons adultes medaka après le dépistage des drogues seront possibles.
Importance de la technique en matière d'existant / Alternative Méthodes
Une combinaison unique d'imagerie en temps réel et des outils génétiques de pointe a fait petit téléostéens poisson populaire pour la recherche biomédicale - recherche sur les os en particulier - et comme modèles in vivo pour le dépistage des drogues. Avec la possibilité d'analyser les interactions entre les cellules dans un organisme intact, les lignées transgéniques medaka sont particulièrement adaptés à l'imagerie en temps réel des processus cellulaires dynamiques lors de la modélisation et du remodelage osseux. Parce qu'ils partagent de nombreux réseaux régulateurs de gènes pour contrôler l' homéostasie osseuse avec des mammifères, des études in vivo en medaka peuvent compléter et même dépasser les études in vitro utilisant des ostéoblastes et ostéoclastes de mammifères essais de culture cellulaire.
Applications futures ou les directions après la maîtrise de cette technique
Autres que de tester des composés uniques dans un fond transgénique, comme décrit dans ce protocole, les poissons offrent également des approches simples pour examiner des combinaisons de vamédicaments Rious de synergie possible ou interférence des composés. En outre, l'utilisation d'une combinaison de différentes lignes de rapporteurs, par exemple, dans le contexte d'un fond mutant particulier, offre de nombreuses possibilités d'étudier le comportement des cellules osseuses lors de différentes étapes de la dégénérescence osseuse et la réparation, ou en présence d'un os médicament -modulating. Avec ses caractéristiques uniques qui complètent les essais de souris, le modèle medaka de l' ostéoporose offre une excellente approche in vivo pour tester et quantifier les effets anabolisants et antirésorptifs de nouveaux composés modulant os.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts ou financiers.
Acknowledgments
Ce projet a été financé par des subventions du ministère singapourien de l'Education (MOE, numéro de subvention 2013-T2-2-126) et l'Institut national de la santé, États-Unis (NIH, numéro 1R21AT008452-01A1 accorder). TY a reçu une bourse d'études supérieures du Département des sciences biologiques NUS. Nous remercions l'unité confocale du Centre NUS pour les sciences BioImaging (CBIS) pour leur soutien constant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μL |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
References
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