Introduction
乳腺癌死亡率的主要原因就是通过转移1，2。紫杉烷类，如多西他赛和紫杉醇，目前用作一线转移性乳腺癌2，3，4，5，6的治疗方案。他们是一群扰乱微管动力学微管靶向代理（MTA）的一部分。然而，在治疗性治疗使用紫杉烷类的最大挑战之一是在癌细胞中紫杉烷抗性，从而导致疾病复发7的发展。耐药占转移性乳腺癌7之间所有死亡的90％以上。
微管是由α-和β微管蛋白异源二聚体的聚合形成类=“外部参照”> 8，9。微管动力学的精确调节是许多细胞功能，包括细胞极化，细胞周期进程，细胞内运输和细胞信号传导的重要。微管和它们的动态的失调会扰乱细胞的功能，导致细胞死亡10,11。取决于它们怎样导致此失调，MTA药物可归类为微管稳定剂（即紫杉烷）或微管destabalizing剂（ 即，长春花生物碱或秋水仙碱点结合剂）20。尽管微管的质量的相反的效果，以足够的剂量，这两个类可以通过其对微管动力学21作用杀死癌细胞。
紫杉烷类通过稳定微管主轴12主要作用，导致染色体错位。在纺锤体装配检验点（SAC）的后续永久激活逮捕的有丝分裂细胞。延长的有丝分裂停滞然后导致凋亡13,14。紫杉烷与通过对β微管蛋白8，15，这是只有在组装的微管蛋白16存在的紫杉烷的结合位点的微管相互作用。
对紫杉烷抗性多种机制已经提出9,17。这些机制包括由于药物外排蛋白与紫杉类药物特异性抵抗力5，9，18，19的表达了一般多药耐药性。例如，耐紫杉类癌细胞可能已经改变了某些β桶的表达和功能同型球蛋白5，9，19，20，21，22，23。通过使用体内方法测量微管动态不稳定，我们表明，相对于非抗性，父母的MCF-7 的CC单元17时，耐多西紫杉醇的MCF-7 的TXT细胞的微管动力学是不敏感的多西他赛治疗。
为了更好地了解的MTA的功能，并在癌细胞紫杉烷抗性的确切机制，重要的是测量微管动力学。这里，我们报告这样的体内方法。通过使用实时成像结合GFP标记的微管蛋白在细胞中的表达，我们可以测量的MCF-7 的TXT和MCF-7 的CC细胞和Wi的微管动力学thout多西紫杉醇治疗。研究结果可以帮助我们设计出能够克服阻力紫杉更加有效的药物。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.准备实时成像单元格
- 细胞培养和播种
- 使用选择用于抗多西他赛（MCF-7 的TXT）和它们的非抗性亲代细胞系（MCF-7，CC）MCF-7乳腺癌细胞。详细的选择过程并且这些选择的细胞系的表征先前24描述。
- 生长于10cm培养皿中的所有细胞在37℃下在由90％的Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）和胎牛血清（FBS）的10％，并补充有非必需氨基酸介质。保持在5％ 的 CO 2气氛中的介质。保持在5nM的多西他赛的MCF-7 的TXT细胞。
- 种子细胞盖玻片上的实时成像。通过用70％乙醇漂洗它们，然后将它们暴露于紫外线过夜消毒24毫米涂覆聚-L-赖氨酸盖玻片。放置盖玻片成35mm的6孔培养板上。 PL在每口井癿盖玻片。
- 除去从10厘米的培养皿的培养基，并用PBS洗涤细胞。添加0.5毫升胰蛋白酶-EDTA的的菜分离从盘的细胞。添加5毫升培养基的培养皿中以中和胰蛋白酶的细胞的分离如下。
- 计数细胞用血细胞计数器确定每单位体积电池的数目。
- 加约10 5个细胞每孔的基础上每单位体积的细胞数量。轻轻摇动后，将板放回孵化器，以使细胞附着在盖玻片。
- GFP标记α微管蛋白的表达
- 为了测定微管动力学，转导与GFP标记α微管蛋白的细胞根据制造商的协议商业GFP转导控制（ 例如，BacMam）。
- 培养在井中的细胞36小时在37℃的细胞培养孵化器，以允许玉米完整粘附和60％汇合。
- 计算GFP标记α微管蛋白的适当体积添加到各孔中，根据以下公式：
细胞的数量是细胞在井在标签的时间的估计的总数目和所需的PPC是每个细胞的粒子数。
注：播种在MCF-7细胞应该一倍，从10 5至2×10 5细胞数为20的期望的PPC，需要为每个盖玻片的体积因此是40微升。对于不同的小区，体积算出基于上述公式可能不是最好的。确切的量应根据GFP微管蛋白的实际表达水平进行调整。 - 通过倒置混合GFP标记α微管蛋白几次，以确保均匀的溶液。不要旋涡。
注：对于控制中，空（控制）试剂没有任何哺乳动物的基因元件和可用于帮助确定潜在杆状病毒介导的作用和背景荧光。非针对性的GFP转导的控制也可使用，这将照亮整个细胞。 - 替换用新鲜培养基的培养基中。添加2mL的新培养基中，40微升GFP标记α微管蛋白的每个孔中。
- 轻轻摇动板以允许与所述培养基GFP标记α微管蛋白的完全混合。返回板到培养培养箱孵育24小时，以允许GFP微管蛋白的表达。
- 处理细胞多西他赛
注：此实验是测试多西他赛的微管动态不稳定性的影响。因此，该细胞与多西紫杉醇的所需浓度进行处理。- 制备的培养基由90％的DMEM和10％FBS的和补充有非必需氨基酸。使用DMEM培养基无酚红，因为酚红可以与fluorescen干扰GFP微管蛋白的CE。添加多西他赛（范围从10nM至10μM）的所需的浓度。多西紫杉醇的储备溶液是在二甲亚砜（DMSO）的10mM。
- 预暖在组织培养培养箱含多西紫杉醇的培养基至37℃。
- 替换与含多西紫杉醇的培养基正常培养基并孵育在组织培养箱30分钟。应该有每孔至少为3的盖玻片为每个多西紫杉醇的浓度。
2.实时成像，以检查微管动态失稳
- 设置系统
- 在保持在37℃和5％的CO 2的腔室进行实验。由时间流逝用装有60X，在一个倒置荧光显微镜和CCD照相机1.42 NA油物镜的显微镜系统获取荧光图像。
- 设置了实时成像的细胞。预暖两个样本保持器和在中至37℃。选择一个盖玻片检查。安装在试样保持器的兴趣盖玻片并用1mL在步骤1.3.1制备的含多西紫杉醇的培养基孵育它。
- 微管动态不稳定的实时成像
- 确定将被用于成像的细胞。他们应该是平的，有表达GFP微管蛋白的荧光强度高，并有明确的微管结构。
- 选择组从步骤2.2.1确定细胞的一个单元首次检验。集中在识别的小区的周边区域。设置了曝光时间的程序和图像采集的频率。由于曝光时间一般是0.5秒，图像将每两个s收购。
- 允许步骤，一个额外的20分钟从1.33至2.2.3。因此，恰好在加入多西他赛之后50分钟，如在步骤1.3.3所述，开始成像（这是标准化）。
- 记录微管ðynamics 2分钟，拍摄照片，每2秒。总共获得用于识别的小区60的图像。
- 移动到下一个识别的小区，并重复步骤2.2.2至2.2.4。重复上述步骤，直到5细胞已被成像。当务之急是做到这一点的时间达到加成多西他赛之后70分钟，然后，如在步骤1.3.3说明。
- 对于每个处理条件，重复步骤2.2.1至2.2.5 3种不同的盖玻片。总体而言，图像15细胞，这是足够的数据来衡量的微管动态不稳定。
3.图像处理和数据分析
- 图像反卷积
- 去卷积所获取的图像，以实现高品质。打开装有显微镜系统去卷积程序。
- 单击“进程”，然后选择“反卷积”。图像文件拖动到“输入”窗口，点击“做。”该图像文件将被去卷积，并且反褶积文件将被自动保存为一个新文件。
- 视频生成
- 点击反褶积图像文件与配套软件打开。
- 点击“文件”，选择“另存为电影”。选择“电影格式”为“AV”和“动画风格”为“前进”。将“压缩质量”到“100％”和“帧速率”到“5张/秒。”
- 检查“通过时间动画”，并单击框“做吧。”视频将产生。
- 微管缩短和增长速度的测量
- 确定将被用于测量的微管。对于每个小区，只有少数微管就能有其缩短或增长遵循清晰，完整。
- 检查视频的每个帧，以确定显示微管一个的起始长度的帧第二最延长或缩短微管的帧。测量两个微管和两帧之间所经过的时间之间的长度变化。
- 通过时间除以长度变化计算增长或缩短的速度（单位是微米/秒）。对于每个处理条件，遵循至少10个细胞，并测量至少20微管。
- 计算每个处理条件的平均值和标准误差。分析使用Student测试条件之间的统计差异。报告在表和/或图表中的数据。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
用这里介绍的协议中，我们研究了在正常（MCF-7，CC）和耐多西紫杉醇（MCF-7 TXT）乳腺癌细胞的微管动力学的多西紫杉醇的效果。两组图像显示在微管的生长和缩短多西他赛（0.5μM）的在MCF-7 的CC和MCF-7 的TXT细胞（ 图1A）的影响。
我们还计算微管生长或缩短的速率在这些条件对两种细胞系下，并表明，在0.5微米，多西紫杉醇强烈抑制MCF-7 的CC细胞的微管蛋白动力学而不是MCF-7 的TXT细胞（ 图1B）。
图1： 多西他赛对微管的动态的影响小号的MCF-7 的TXT和MCF-7 的CC 细胞。如所述进行的实时成像。 （A）中，从微管动力学的在MCF-7 CC和以下用0.5微米的多西紫杉醇1小时处理的MCF-7 的TXT细胞实时成像选择图像。箭头指示延伸微管。箭头指示缩短微管。大小酒吧= 5微米。 （B）中的延伸率和微管的缩短率，从记录的图像进行测定。每个数据是20次测量，从至少有8个不同的细胞的平均值。误差条是标准的错误。 **表示该差异在统计上是显著，具有p <0.01。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
有两种主要的方法来测量微管动态不稳定性： 在体外和体内。在体外方法中，纯化的微管蛋白是用来测量与计算机增强的时间推移微分干涉反差显微镜微管动态不稳定性。在体内方法中，显微注射荧光微管蛋白，或表达GFP的微管蛋白，掺入微管。微管的动力学（生长和缩短）然后通过时间推移在间期细胞10，20，25的周边区域使用灵敏相机记录。虽然已经用于此目的的各种类型的显微镜，我们在这里报告的协议使用去卷积显微镜。
在体内 ，动态不稳定性仅在微管加末端（与β微管蛋白朝外的端部）时，而负端（朝外的α微管蛋白的端部）保持相同的长度26。另一方面，对于在体外组装的微管，动态失稳发生在微管的两端，与加两端比所述负端27更加健壮。 体外分析动态不稳定的主要优点是，它提供了关于微管动力学在缺乏蜂窝MAP的不同试剂的具体作用机理的信息。此外， 在体外条件下，动态不稳定性，可以在两端的研究。这提供了洞察哪些药物或调节蛋白影响的两端微管稳定的机制。在历史上，负端被追踪比加结束10要少得多。我们的许多微管行为的理解来自于体外纯化的微管蛋白装配的微管研究。 然而，尽管许多的微管的行为从这些研究中获得的基本原理也可在细胞中被应用到微管中，有在体外和之间体内微管动力学一定的差异。在细胞中，微管经常生长在5至10倍的快的速率，和生长和/或缩短之间的转变发生〜10倍的频率比与从体外纯化的微管蛋白组装的微管。也有在微管组织和整个细胞周期剧烈变化动力学，这反映了高度的细胞微管的行为的空间和时间调节。不能由体外研究来研究这种行为。此外，微管动力学的调控是通过微管蛋白的翻译后修饰，微管蛋白同种型的表达，和一大群MAP和其它微管相互作用的蛋白质，要么稳定或去稳定微实现小管28，29。因此，在活细胞中研究微管不稳定得多生理适用。
此处所描述的方法是一种简单，非常可靠的协议来研究微管动力学活细胞。需要更多关注的步骤是用于观察细胞的选择和曝光时间的测定。关键是要选择那些扁平细胞，并有GFP微管蛋白的荧光强度高。还希望减少激发的强度和曝光时间以避免GFP荧光的衰落。当然，像所有其他在体内的方法，这个协议不适合于研究各种操纵条件下的微管动态不稳定。例如，α-和β微管蛋白的不同亚型可能表现不同的微管动力学的条款。仅在体外方法可以用于为study微管动态不稳定个别的纯化的微管蛋白同种型的影响。此外，与荧光标记的微管蛋白的微注射相比，通过转染或质粒的转导GFP标记的微管蛋白的表达可表现出相对较低的信噪比。然而，在通过转染或质粒的转导细胞GFP标记的微管蛋白的表达可以更自由地通过实验改变其他细胞特征。
此处所报告的协议可用于各种研究。一方面，它可以提供关于微管在细胞周期的不同阶段的功能新颖和关键见解，特别是在有丝分裂。它也可以用来研究各种细胞过程，例如迁移的影响，对微管动力学。另一方面，它可用于研究各种微管抑制剂的效果（其中许多是癌症药物）在正常的微管动力学和癌细胞更多的生理条件下。我们已经用这种方法来研究两个多西他赛耐药和非耐多西他赛乳腺癌细胞微管动态不稳定的各种抗有丝分裂抗癌药物的影响。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
References
- Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
- Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414 (2013).
- Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
- Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
- Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
- Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
- Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
- Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
- McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
- Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
- Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
- Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
- Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
- Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
- Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
- Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
- Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
- Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
- Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
- Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
- Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318 (2008).
- Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
- Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).
