Introduction
Den främsta orsaken till dödligheten i bröstcancer är genom metastaser 1, 2. Taxaner, såsom docetaxel och paklitaxel, används idag som första linjens behandling vid behandling av metastaserande bröstcancer 2, 3, 4, 5, 6. De är en del av en grupp av mikrotubuli-målsökande medel (MTA) som stör mikrotubuli dynamik. Men en av de största utmaningarna med att använda taxaner i botande behandling att utveckla taxan resistens i cancerceller, vilket leder till återfall i sjukdomen 7. Motstånd läkemedel står för mer än 90% av alla dödsfall bland patienter med metastaserande bröstcancer 7.
Mikrotubuli är bildade genom polymerisation av a- och P-tubulin-heterodimererclass = "xref"> 8, 9. Den exakta regleringen av mikrotubuli dynamik är viktig för många cellulära funktioner, inklusive cell polarisering, cellcykelprogression, intracellulär transport, och cellsignalering. Dysreglering av mikrotubuli och deras dynamik kommer att störa cellernas funktion och leda till celldöd 10, 11. Beroende på hur de orsakar denna dysreglering kan MTA droger klassificeras som antingen mikrotubuli stabiliseringsmedel (dvs taxaner) eller mikrotubuli-destabalizing medel (dvs, vinkaalkaloider eller colchicin plats bindemedel) 20. Trots deras motsatt effekt på mikrotubuli massa, vid en tillräcklig dos, kan båda klasserna döda cancerceller genom deras effekter på mikrotubuli dynamik 21.
Taxaner fungerar främst genom att stabilisera mikrotubuli spindeln 12, vilket leder tillkromosomala förskjutning. Den efterföljande ständig aktivering av spindelenhet checkpoint (SAC) hejdar cellen i mitos. Långvarig mitotiska arrestering orsakar då apoptos 13, 14. Taxan interagerar med mikrotubuli genom taxan bindningsställe på β-tubulin 8, 15, som endast finns i monterat tubulin 16.
Flera mekanismer för taxan motstånd har föreslagits 9, 17. Dessa mekanismer innefattar både allmän multiresistens på grund av överuttryck av läkemedelsutflödes proteiner och taxan specifika motståndet 5, 9, 18, 19. Till exempel, kan taxanresistenta cancerceller har förändrat uttryck och funktion av vissa β-tubUlin isotyper 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Genom att använda en in vivo metod för att mäta mikrotubuli dynamisk instabilitet, visar vi att, jämfört med icke-resistenta, föräldra MCF-7 CC celler 17, de mikrotubuli dynamik docetaxel-resistent MCF-7 TXT celler är okänsliga för docetaxel behandling.
För att bättre förstå funktionen hos MTA och den exakta mekanismen för taxan-resistens i cancerceller, är det viktigt att mäta mikrotubuli dynamik. Här rapporterar vi en in vivo-metod för att göra detta. Genom att använda levande avbildning i kombination med uttrycket av GFP-märkta tubulin i celler, kan vi mäta mikrotubuli dynamik MCF-7 TXT och MCF-7 CC-celler med och without docetaxel-behandling. Resultaten kan hjälpa oss att utforma mer effektiva läkemedel som kan övervinna taxan motstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda Celler för Live Imaging
- Cellkultur och sådd
- Använd MCF-7 bröstcancerceller som valts ut för resistens mot docetaxel (MCF-7 TXT) och deras icke-resistenta parental cellinje (MCF-7 CC). Den detaljerade urvalsprocessen och karakterisering av dessa utvalda cellinjer beskrevs tidigare 24.
- Växa alla celler i 10 cm odlingsskålar vid 37 ° C i ett medium sammansatt 90% av Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) och 10% fetalt bovint serum (FBS) och kompletterades med icke-essentiella aminosyror. Bibehålla medium i en 5% CO2 atmosfär. Behåll MCF-7 TXT celler vid 5 nM docetaxel.
- Utsädes celler på täckglas för levande avbildning. Sterilisera 24 mm poly-L-lysin-belagda täckglas genom att skölja dem med 70% alkohol och sedan utsätta dem för UV natten. Placera täckglasen i en 6-brunnars odlingsplatta av 35 mm. place ett täckglas i varje brunn.
- Avlägsna mediet från 10-cm odlingsskål och tvätta cellerna med PBS. Tillsätt 0,5 ml av trypsin-EDTA till skålen för att lösgöra cellerna från skålen. Tillsätt 5 ml odlingsmedium till skålen för att neutralisera trypsin efter avskiljande av cellerna.
- Räkna cellerna med en hemocytometer för att bestämma antalet celler per volymsenhet.
- Tillsätt ca 10 5 celler till varje brunn baserat på cellantalet per volymsenhet. Efter att ha skakat det försiktigt sätta plattan tillbaka i inkubatorn för att tillåta cellerna att fästa till täck.
- Expression av GFP-märkta α-tubulin
- För att analysera mikrotubuli dynamik, transducera cellerna med GFP-märkta α-tubulin med den kommersiella GFP transduktion kontroll (t.ex., BacMam) enligt tillverkarens protokoll.
- Odla cellerna i brunnen under 36 h i en 37 ° C cellodlingsinkubator för att tillåta complett vidhäftning och 60% konfluens.
- Beräkna lämplig volym av GFP-märkta α-tubulin för att lägga till varje brunn, i enlighet med följande ekvation:
Antalet celler är det uppskattade totala antalet celler i brunnen vid tidpunkten för märkningen och den önskade PPC är antalet partiklar per cell.
OBS: Ympning de MCF-7-celler bör ha fördubblats cellantalet från 10 5 till 2 x 10 5 med en önskad PPC av 20, är den volym som krävs för varje täckglas därför 40 mikroliter. För olika celler, beräknad volym baserat på ovanstående formel kanske inte är den bästa. Den exakta volymen bör justeras enligt den faktiska expressionsnivån av GFP-tubulin. - Blanda GFP-märkta a-tubulin flera gånger av inversion för att säkerställa en homogen lösning. Inte virvel.
OBS: För kontrollen, saknar däggdjur genetisk Null (kontroll) reagenselement och kan användas för att fastställa potentiella baculovirus-medierad effekter och bakgrundsfluorescens. En icke-riktade GFP transduktion kontroll kan också användas, som kommer att lysa upp hela cellen. - Ersätta odlingsmediet med färskt medium. Tillsätt 2 ml det nya mediet och 40 mikroliter av GFP-märkta α-tubulin till varje brunn.
- Skaka plattan försiktigt för att möjliggöra fullständig blandning av GFP-märkta α-tubulin med odlingsmediet. Returnera plattan till odlings inkubatorn och inkubera under 24 h för att medge uttryck av GFP-tubulin.
- Behandla celler med docetaxel
OBS: Detta experiment är att testa effekten av docetaxel på mikrotubuli dynamisk instabilitet. Således är de celler som behandlats med den önskade koncentrationen av docetaxel.- Förbereda en medium sammansatt 90% av DMEM och 10% FBS och supplementerades med icke-essentiella aminosyror. Använda DMEM utan fenolrött, eftersom fenolrött kan störa fluorescence av GFP-tubulin. Lägga den önskade koncentrationen av docetaxel (som sträcker sig från 10 nM till 10 | iM). Stamlösningen av docetaxel är 10 mM i dimetylsulfoxid (DMSO).
- Pre-värma docetaxel innehållande medium till 37 ° C i vävnadsodlingsinkubator.
- Ersätta den normala odlingsmediet med docetaxel-innehållande medium och inkubera i 30 min i vävnadsodlingsinkubator. Det bör finnas åtminstone 3 täckglas per brunn för varje docetaxel koncentration.
2. Live avbildning att Undersök mikrotubuli Dynamisk Instabilitet
- Ställa in systemet
- Utföra experiment i en kammare som hölls vid 37 ° C och 5% CO2. Förvärva fluorescens bilder av tid förfaller med en mikroskopisk system utrustat med en 60X, 1,42 NA olja objektiv på ett inverterat fluorescensmikroskop och med en CCD-kamera.
- Ställ upp celler för levande avbildning. Pre-varm både provhållaren ochmediet till 37 ° C. Välj en täck att undersöka. Montera täck av intresse på en provhållare och inkubera den med 1 ml av docetaxel innehållande medium framställt i steg 1.3.1.
- Live avbildning av mikrotubuli dynamisk instabilitet
- Identifiera de celler som kommer att användas för avbildning. De bör vara platt, har en hög fluorescensintensitet av uttryckt GFP-tubulin, och ha tydliga mikrotubuli strukturer.
- Välj en cell från gruppen av identifierade celler från steg 2.2.1 prövas först. Fokusera på det perifera området av den identifierade cellen. Ställa in programmet för exponeringstiden och frekvensen av bilden förvärvet. Eftersom exponeringstiden är vanligen 0,5 s, kommer bilderna förvärvas varannan s.
- Låt en ytterligare 20 minuter för steg från 1,33 till 2.2.3. Således, exakt 50 minuter efter tillsatsen av docetaxel, som beskrivs i steg 1.3.3, börja imaging (detta är för standardisering).
- Anteckna mikrotubuli dynamics under 2 minuter, ta ett foto varje 2 s. Totalt förvärva 60 bilder för den identifierade cellen.
- Flytta till nästa identifierade cellen och upprepa steg 2.2.2 till 2.2.4. Upprepa proceduren tills 5 celler har avbildats. Det är absolut nödvändigt att göra detta innan tiden når 70 minuter efter tillsatsen av docetaxel, som beskrivs i steg 1.3.3.
- För varje behandling tillstånd, upprepa steg 2.2.1 till 2.2.5 i 3 olika täck. Totalt bild 15 celler, som är tillräckligt med data för att mäta mikrotubuli dynamisk instabilitet.
3. Bildbehandling och dataanalys
- Avfaltning av bilder
- Deconvolve de förvärvade bilder för att uppnå en hög kvalitet. Öppna avfaltning programmet utrustad med mikroskopsystemet.
- Klicka på "Process" och välj "Deconvolve." Dra bildfilen till "Input" och klicka "Do." Bildfilen kommer att dekonvolvering ochdekonvolvering fil sparas som en ny fil automatiskt.
- Generation av videoklipp
- Klicka på dekonvolvering bildfilen för att öppna med utrustat programvara.
- Klicka på "File" och välj "Spara som film." Välj "Film format" som "AV" och "Animation stil" som "Framåt". Ställ in "Compression kvalitet" till "100%" och "Frame rate" till "5 / sekund."
- Markera kryssrutan för "Animera genom tiden" och klicka på "Gör det." Videon kommer att genereras.
- Mätning av mikrotubuli förkortning och tillväxt
- Identifiera de mikrotubuli som kommer att användas för mätning. För varje cell, kommer endast ett fåtal mikrotubuli kunna ha sin förkortning eller tillväxt följde tydligt och fullständigt.
- Undersök varje bildruta i videon för att identifiera den ram som visar utgångs längd mikrotubuli ennd ramen med mest förlängas eller förkortas mikrotubuli. Mäta förändringen i längd mellan de två mikrotubuli och den tid som förflutit mellan de båda ramarna.
- Beräkna tillväxttakten eller förkortning genom att dividera förändringen i längd efter tid (enheten är xm / s). För varje behandlingsbetingelse, följer åtminstone 10 celler och mäta minst 20 mikrotubuli.
- Beräkna den genomsnittliga och standardfelet för varje behandlingsbetingelse. Analysera den statistiska skillnaden mellan de betingelser med användning av Student-testet. Rapportera data i en tabell och / eller i ett diagram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användning av det protokoll som presenteras här, vi studerat effekterna av docetaxel på mikrotubuli dynamik normal (MCF-7 CC) och docetaxel-resistenta (MCF-7 TXT) bröstcancerceller. Två uppsättningar av bilder visar effekterna av docetaxel (0,5 M) på mikrotubuli tillväxt och matfett i MCF-7 CC och MCF-7 TXT celler (Figur 1A).
Vi räknade också hastigheten av mikrotubuli tillväxt eller förkorta under dessa förhållanden för de två cellinjer och visade att vid 0,5 ^ M, docetaxel hämmar starkt de tubulin dynamiken i MCF-7-CC-celler men inte MCF-7-TXT-celler (Figur 1B).
Figur 1: Effekterna av Docetaxel på mikrotubuli Dynamics av MCF-7 TXT och MCF-7 CC celler. Den levande avbildning utfördes såsom beskrivits. (A) Valda bilder från levande avbildning av mikrotubuli dynamik i MCF-7 CC och MCF-7 TXT celler efter behandling med 0,5 | iM docetaxel under 1 timme. Pilen indikerar sträcker mikrotubuli. Den pilspets indikerar Förkortningen mikrotubuli. Storlek bar = 5 um. (B) Förlängningen hastighet och förkorta hastighet av mikrotubuli mättes från inspelade bilderna. Varje nollpunkt är medelvärdet av 20 mätningar från minst 8 olika celler. Felet bar är standardfelet. ** Anger att skillnaden är statistiskt signifikant med p <0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns två viktiga metoder för att mäta mikrotubuli dynamisk instabilitet: in vitro och in vivo. I in vitro-metod, renas tubulin används för att mäta mikrotubuli dynamisk instabilitet med dator förbättrad time-lapse differential interferens kontrast mikroskopi. I in vivo-metoden, mikroinjiceras fluorescerande tubulin, eller uttryckt GFP-tubulin, har införlivats i mikrotubuli. Dynamiken (tillväxt och förkortning) av de mikrotubuli registreras sedan av tidsförlopp med användning av en känslig kamera i det perifera området av interfasceller 10, 20, 25. Även om olika typer av mikroskop har använts för detta ändamål, det protokoll som vi rapporterat här använder en avfaltning mikroskop.
In vivo sker dynamisk instabilitet endast på mikrotubuli plus ändar (ändarna med β-tubulin vänd utåt), medanminus ändar (de slutar med α-tubulin utåt) förblir samma längd 26. Å andra sidan, för mikrotubuli monterade in vitro sker dynamisk instabilitet på båda ändarna av mikrotubuli, med plus ändar är mer robust än minusändarna 27. Den största fördelen med att analysera dynamiska instabilitet in vitro är att det ger mekanistiska information om den specifika betydelsen av olika medel på mikrotubuli dynamik i frånvaro av cell kartor. Dessutom, under in vitro betingelser, dynamisk instabilitet kan studeras i båda ändar. Detta ger en inblick i de mekanismer genom vilka läkemedel eller regulatoriska proteiner påverkar mikrotubuli stabilitet vid de motsatta ändarna. Historiskt är de minus ändarna spåras mycket mindre än plus ändarna 10. En stor del av vår förståelse av mikrotubuli beteende kommer från studier på mikrotubuli sammansatta av renat tubulin in vitro. Även om många av de grundläggande principerna för mikrotubuli beteende vunnits från dessa studier kan också tillämpas på mikrotubuli i celler, finns det vissa skillnader i mikrotubuli dynamik mellan in vitro och in vivo. I celler, mikrotubuli ofta växa i en fem- till tio gånger snabbare, och övergångar mellan tillväxt och / eller förkortning förekommer ~ 10 gånger oftare än med mikrotubuli sammansatta av renat tubulin in vitro. Det finns också dramatiska förändringar i mikrotubuli organisation och dynamik i hela cellcykeln, vilket återspeglar en hög grad av rumslig och temporal reglering av cellulära mikrotubuli beteende. Detta beteende kan inte studeras av in vitro-forskning. Dessutom är regleringen av mikrotubuli dynamik uppnås genom tubulin posttranslationell modifiering, tubulin isotyp uttryck, och en stor grupp av kartor och andra mikrotubuli-interagerande proteiner som antingen stabilisera eller destabilisera mikrotubuli 28, 29. Därför studerar mikrotubuli instabilitet i levande celler är mycket mer fysiologiskt relevant.
Den metod som beskrivs här är en enkel och mycket tillförlitlig protokoll för att studera mikrotubuli dynamik i levande celler. De steg som kräver mer uppmärksamhet är valet av cellen för observation och bestämning av exponeringstiden. Det är kritiskt att välja celler som är platt och har hög fluorescensintensitet av GFP-tubulin. Det är också önskvärt att minska intensiteten i excitation och exponeringstiden för att undvika blekning av GFP-fluorescens. Visst, liksom alla de andra in vivo-metoder, är detta protokoll inte lämpar sig för att studera mikrotubuli dynamisk instabilitet under olika manipulerade förhållanden. Till exempel kan olika isoformer av α- och β-tubulin bete sig annorlunda när det gäller mikrotubuli dynamik. Endast in vitro-metoder kan användas för att sTudy effekterna av enskilda renade tubulin isoformer på mikrotubuli dynamisk instabilitet. Dessutom, jämfört med mikroinjektion av fluorescensmärkt tubulin kan expressionen av GFP-märkt tubulin genom transfektion eller transduktion av plasmiderna uppvisar en relativt sett lägre signal-till-brus-förhållande. Men uttryck av GFP-märkta tubulin i celler genom transfektion eller transduktion av plasmiderna ger mer frihet att experimentellt ändra andra cellulära egenskaper.
Det protokoll som rapporteras här kan användas för olika studier. Å ena sidan kan det ge nya och viktiga insikter om funktionen hos mikrotubuli under olika faser av cellcykeln, särskilt i mitos. Det kan också användas för att studera effekterna av olika cellulära processer, såsom migration, på mikrotubuli dynamik. Å andra sidan kan den användas för att studera effekterna av olika mikrotubuli hämmare (många av dem är cancerläkemedel) på mikrotubuli dynamik i normal ochcancerceller under mer fysiologiska förhållanden. Vi har använt denna metod för att studera effekterna av olika anti-mitotiska cancerläkemedel på mikrotubuli dynamisk instabilitet i både docetaxel resistenta och icke-docetaxel resistent bröstcancerceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
References
- Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
- Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414 (2013).
- Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
- Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
- Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
- Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
- Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
- Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
- McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
- Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
- Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
- Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
- Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
- Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
- Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
- Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
- Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
- Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
- Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
- Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
- Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318 (2008).
- Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
- Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).
