Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Canlı Görüntüleme taksan dirençli Meme Kanserlerinde Mikrotubul dinamik dengesizlik Eğitim için

Published: February 20, 2017 doi: 10.3791/55027
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medical Genetics, Signal Transduction Research Group, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

Introduction

Meme kanseri ölümlerinin önde gelen nedenidir metastazı 1, 2 geçer. Birinci basamak metastatik meme kanseri, 2, 3, 4, 5, 6 tedavisinde rejimleri gibi dosetaksel ve paklitaksel gibi taksanlarm kendilerine hidrofobik şu anda kullanılmaktadır. Onlar mikrotübül dinamiklerini bozabilir mikrotübül hedefleme ajanları (MTAs) bir grubun parçasıdır. Ancak, küratif tedavi taksan kullanarak en büyük sorunlardan biri nüks 7 neden kanser hücrelerinde taksan direnci, geliştirilmesidir. İlaç direnci metastatik meme kanseri 7 olan hastalarda, tüm ölümlerin% 90'dan fazla sorumludur.

Mikrotübüller α- ve β-tübülin heterodimerlerinin polimerizasyonuyla oluşurclass = "xref"> 8, 9. mikrotubul dinamiği kesin düzenlemesi, hücre polarizasyon, hücre döngüsü ilerlemesinin, hücre içi ulaşım ve hücre sinyalizasyon dahil olmak üzere birçok hücre fonksiyonları için önemlidir. Mikrotübüllerin ve dinamikleri bozulması hücre fonksiyonunu bozabilir ve hücre ölümü 10, 11 neden olur. Bu sistem bozukluğu neden bağlı olarak, MTA ilaçlar mikrotübül stabilize edici ajanlar (örneğin, taksanlar) ya da mikrotübül destabalizing maddeler (örneğin, vinka alkaloidler ve kolşisin yerinde bağlama maddeleri), 20, ya da sınıflandırılabilir. Mikrotübül kütlesi üzerindeki zıt etkilerine rağmen, yeterli dozda, hem sınıflar mikrotübül dinamiklerine 21 üzerindeki etkileri yoluyla kanser hücrelerini öldürür.

Taksan yol açan mikrotübül mili 12 dengeleyici öncelikle işlevkromozomal hiza. mili montaj kontrol noktasında (SAC) sonraki sürekli aktivasyon mitoz hücreyi tutuklamalar. Uzamış mitotik tutuklama daha sonra apoptoz 13, 14 olur. Taksan monte tubulin 16 sadece mevcut olan β-tubulin 8, 15, ilgili taksan bağlanma sitesi üzerinden mikrotübüller ile etkileşime girer.

Taksan direnç çok mekanizma 17 9 önerilmiştir. Bu mekanizmalar sayesinde ilaç akış proteinler ve taksan özgü direnci 5, 9, 18, 19 aşın hem genel hem de çoklu ilaç direncini kapsamaktadır. Örneğin, taksan dirençli kanser hücreleri, bazı β-küvet ekspresyonu ve fonksiyonunu değiştirmiş olabilirUlin 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23 izotipleri. Mikrotübül Dinamik dengesizlik ölçmek için bir in vivo yöntem kullanarak, dirençli olmayan ebeveyn MCF-7 hücreleri CC 17 ile karşılaştırıldığında, dosetaksel dayanıklı MCF-7 TXT hücrelerin mikrotübül dinamiklerinin dosetaksel tedaviye duyarlı olduğunu göstermektedir.

Daha iyi MTAs işlevini ve kanserli hücrelerde taksan direnci tam mekanizmasını anlamak için, mikrotübül dinamiklerini ölçmek için esastır. Burada, bu sayede, bir in vivo yöntem sunulmaktadır. Hücrelerinde GFP-etiketli tubulin sentezlenmesi ile birlikte canlı görüntüleme kullanarak, MCF-7 TXT ve MCF-7 hücreleri CC ve wi mikrotübül dinamiklerinin ölçebilirthout dosetaksel tedavisi. Sonuçlar bize taksan direncini aşmak için daha etkili ilaçlar tasarlamaya yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Canlı Görüntüleme Hücreleri hazırlanması

  1. Hücre kültürü ve tohum
    1. Dosetaksel (MCF-7 TXT) ve dirençli olmayan ana hücre dizisi (MCF-7 CC) karşı direnç için seçilir MCF-7 göğüs kanseri hücreleri kullanır. Ayrıntılı seçim süreci ve bu seçilen hücre hatları özellikleri daha önce 24 tarif edildi.
    2. Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) ve fetal sığır serumu (FBS), 10%, 90% oluşan ve temel olmayan amino asitler ile takviye edilmiş bir ortam içinde, 37 ° C'de 10 cm kültür tabaklarında tüm hücreleri büyütün. % 5 CO2 atmosferinde ortam muhafaza edin. 5 nM dosetaksel de MCF-7 TXT hücreleri korumak.
    3. canlı görüntüleme için lamelleri Tohum hücreleri. Gecede UV onları teşhir sonra% 70 alkol ile durulama ve 24 mm poli-L-lizin kaplı cam lamelleri sterilize edin. 35 mm'lik bir 6-yuvalı kültür plakasına lamelleri yerleştirin. plHer iyi bir lamel ace.
    4. 10 cm'lik bir kültür kabı orta çıkarın ve hücreler PBS ile yıkayın. çanak hücreleri ayırmak için çanak tripsin-EDTA 0.5 mL ekleyin. Hücrelerin dekolmanı aşağıdaki tripsin nötralize etmek çanak kültür ortamı 5 ml ekleyin.
    5. Birim hacim başına hücre sayısını belirlemek için bir hemasitometre ile hücre sayımı.
    6. Her bir birim hacmi başına hücre sayısı göre yaklaşık olarak 10 5 hücre ekleyin. hafifçe sallayarak sonra, hücreler lamelleri eklemek için izin inkübatör geri tabak koydu.
  2. GFP etiketli α-tubulin ekspresyonu
    1. Mikrotübül dinamiklerinin tahlil üreticinin protokolüne göre, ticari GFP transdüksiyon kontrolü (ör BacMam) GFP-etiketli α-tubulin ile hücreleri nakletmek için.
    2. 37 ° C hücre kültürü inkübatöründe 36 saat bir gözdeki hücrelerin com izin vermek için, kültürkomplet yapışma ve% 60 izdiham.
    3. aşağıdaki denkleme göre, her bir oyuğa ilave GFP-etiketli α-tubulin uygun hacimde hesaplayın:
      Denklem
      hücrelerin sayısı etiketleme sırasında bir gözdeki hücrelerin sağ tahmini toplam sayısıdır ve istenen PPC hücre başına parçacıkların sayısıdır.
      Not: MCF-7 hücreleri tohumlama 20 arzu edilen bir PPC 10 5 5 10 ila 2 x hücre sayısı iki gereken her bir lamel için gerekli hacmi dolayısıyla 40 ml. farklı hücreler için, hacim en iyi olmayabilir yukarıda verilen formüle göre hesaplanacaktır. Kesin hacmin GFP tubulin gerçek ifade seviyesine göre ayarlanmalıdır.
    4. homojen bir çözelti sağlamak için ters çevirme ile GFP etiketli α-tübülin birkaç kez karıştırılır. vorteks etmeyin.
      NOT: kontrolü için, boş (kontrol) reaktif herhangi bir memeli genetik yoksunelemanları ve potansiyel bakulovirüs dolayımlı etkileri ve arka plan floresanı belirlenmesine yardımcı olmak için kullanılabilir. Olmayan hedefli GFP transdüksiyon kontrolü de tüm hücre yanacaktır, hangi kullanılabilir.
    5. taze ortam ile kültür ortamı değiştirin. Her bir oyuğa GFP etiketli α-tubulin, yeni orta 2 mL 40 uL ekleyin.
    6. kültür ortamı ile GFP etiketli α-tubulin tamamen karışmanın sağlanması için hafifçe plakayı sallayın. Kültür Plakaları kuluçka makinesine geri dönün ve GFP-tubulin ekspresyonunu sağlamak için 24 saat boyunca inkübe edilir.
  3. Dosetaksel ile muamele hücreleri
    Not: Bu deney mikrotübül dinamik istikrarsızlık üzerinde dosetaksel etkisini test etmektir. Bu durumda, hücreler, dosetaksel istenen konsantrasyona ile muamele edilir.
    1. Orta DMEM% 90 FBS ve% 10 oluşur ve temel olmayan amino asitler ile takviye hazırlayın. fenol kırmızısı flüoresan etkileyebilir çünkü fenol kırmızısı olmadan DMEM kullanınGFP-tubulin CE. (10 nM ila 10 uM arasında) doketaksel istenilen konsantrasyonu ekleyin. dosetaksel stok solüsyonları dimetil sülfoksitte (DMSO) içinde 10 mM'dir.
    2. Ön sıcak doku kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C docetaksel içeren ortam.
    3. docetaksel içeren ortam ile normal kültür ortamı yerine ve doku kültürü kuluçka makinesi içinde 30 dakika inkübe edilir. Her bir dosetaksel konsantrasyonu için oyuk başına en az 3 lamelleri olmalıdır.

2. Canlı Görüntüleme Mikrotubul dinamik dengesizlik incelemek için

  1. Sistem kurma
    1. 37 ° C'de ve% 5 CO2 de muhafaza edilen bir oda içinde deneyleri gerçekleştirmek. Bir 60X, ters floresan mikroskop ve bir CCD kamera ile 1.42 NA petrol objektif lens ile donatılmış bir mikroskobik sistemi ile zaman atlamalı tarafından floresan görüntü kazanır.
    2. canlı görüntüleme için hücreler ayarlayın. Pre-sıcak numune tutucu hem de37 ° C'ye kadar ortam. incelemek için lamel seçin. Bir numune tutucu üzerinde ilgi lamel monte ve aşama 1.3.1 hazırlanan docetaksel içeren ortam 1 ml ile inkübe edin.
  2. Mikrotübül dinamik istikrarsızlık Canlı görüntüleme
    1. görüntüleme için kullanılacak hücrelerin belirlenmesi. Bunlar, düz GFP-tubulin yüksek floresan yoğunluğunu, ve açık bir mikrotübül yapılarının sahip olmalıdır.
    2. İlk incelemek için aşama 2.2.1 üzerinden tanımlanmıştır hücre grubundan bir ölçeri seçin. belirlenen hücrenin çevresel alana odaklanmak. maruz kalma süresi için program ve görüntü alımı sıklığını ayarlayın. Pozlama süresi genellikle 0,5 s gibi görüntüleri her iki s satın alınacak.
    3. 1.33 den 2.2.3 adımları için ek bir 20 dakika bekleyin. Aşama 1.3.3 tarif edildiği gibi nedenle, tam 50 dakika dosetaksel ilave edildikten sonra (bu standardizasyon için) görüntüleme başlar.
    4. mikrotübül d kaydedindinamiği çalışmaları 2 dakika süreyle, bir Fotoğrafa her 2 sn alarak. Toplamda, tespit hücre için 60 görüntü kazanır.
    5. Bir sonraki tanımlanmış hücreye taşımak ve tekrar 2.2.4 için 2.2.2 adımları. 5 hücreleri görüntülü kadar aynı işlemi tekrarlayın. Adım 1.3.3 de açıklandığı gibi zaman, dosetaksel eklenmesinden sonra 70 dakika ulaşmadan önce bunu yapmak zorunludur.
    6. Her tedavi koşulu için tekrarlayın 3 farklı lamelleri için 2.2.5 için 2.2.1 adımları. Toplamda, görüntü 15 hücreleri, yeterli veri mikrotübül dinamik istikrarsızlık ölçmek için hangi.

3. Görüntü İşleme ve Veri Analizi

  1. Görüntülerin Dekonvolüsyon
    1. yüksek kalitede elde etmek için elde edilen görüntüleri Deconvolve. mikroskop sistemi ile donatılmış Dekonvolüsyonun programını açın.
    2. "Süreç" tıklayın ve "Deconvolve." "Giriş" penceresinde görüntü dosyasını sürükleyin ve tıklayın "Do." görüntü dosyası deconvolved ve olacakdeconvolved dosya otomatik olarak yeni bir dosya olarak kaydedilir.
  2. Videoları Üretimi
    1. donanımlı yazılımla açmak için deconvolved görüntü dosyasını tıklatın.
    2. "Dosya" tıklayın ve "film olarak kaydedin." olarak "AV" ve "Animasyon tarzı" olarak "Film formatı" Seç "İlet." "100%" ve "Çerçeve oranı" için "Sıkıştırma kalitesi" Set "5 / saniye."
    3. "Zaman içinde canlandırın" ve tıklayın kutusunu işaretleyin "Do it." Video oluşacaktır.
  3. Mikrotübül kısalma ve büyüme hızının ölçülmesi
    1. ölçümü için kullanılacak mikrotübül belirleyin. her bir hücre için, sadece bir kaç mikrotübüller bunların yağ ya da büyüme açık ve tam olarak takip olması mümkün olur.
    2. mikrotübül a başlangıç ​​uzunluğunu gösterir çerçeveyi belirlemek için videonun her karesini inceleyinnd en uzatılabilir veya kısaltılabilir mikrotübül ile çerçeve. İki mikrotübül ve iki kare arasında geçen süre arasındaki uzunluk değişimi ölçün.
    3. zaman uzunluğu değişimi bölerek büyüme veya kısalma oranını hesaplamak (birim mm / s). Her bir tedavi durumu için, en az 10 hücrelerin takip ve en az 20 mikrotübülleri ölçer.
    4. Her bir tedavi durumu için ortalama ve standart hata hesaplanır. Öğrenci testi kullanılarak koşulları arasındaki istatistiksel fark analiz eder. tablo ve / veya bir grafik veri rapor edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada sunulan protokolü kullanarak, (MCF-7 TXT) meme kanseri hücrelerinde (MCF-7 CC), normal ve dosetaksel dayanıklı mikrotübül dinamiklerine dosetaksel etkilerini inceledi. Görüntü iki takım MCF-7 CC ve MCF-7 TXT hücreleri (Şekil 1A) mikrotübül büyüme ve katı üzerine dosetaksel (0.5 uM) etkilerini göstermektedir.

Ayrıca, iki hücre hatları için bu koşullar altında mikrotübül büyüme veya katı oranı hesaplanır ve 0.5 uM'de, dosetaksel güçlü MCF-7 CC hücrelerinin tübülin dinamikleri ancak MCF-7 TXT hücreleri (Şekil 1B) inhibe ettiğini göstermiştir.

Şekil 1
Şekil 1: Mikrotubul Dinamik üzerine Dosetaksel EtkileriMCF-7 TXT ve MCF-7 CC Hücreler s. açıklandığı gibi canlı görüntüleme yapıldı. (A), MCF-7 CC ve 1 saat boyunca 0.5 uM doketaksel ile tedaviden sonra, MCF-7 TXT hücrelerde mikrotübül dinamiklerinin canlı görüntüleme seçilen ve görüntüler. Ok uzanan mikrotübül gösterir. ok kısalma mikrotübül gösterir. Boyut bar = 5 um. (B) uzama oranı ve mikrotübül kısaltılması oranı kayıtlı görüntülerden ölçüldü. Her veri, en azından 8 farklı hücre 20 ölçümün ortalamasıdır. hata çubuğu standart hatadır. ** Farkı p <0.01 ile istatistiksel olarak anlamlı olduğunu göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vitro ve in vivo: mikrotübül Dinamik dengesizlik ölçmek için iki ana yöntem vardır. In vitro yöntemde, saflaştırılmış tubulin bilgisayar destekli zaman atlamalı diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile mikrotübül dinamik istikrarsızlık ölçmek için kullanılır. In vivo metodunda, floresan tubulin mikroenjeksiyon ya da GFP-tubulin ifade mikrotübüllere dahil edilir. Mikrotübül dinamikleri (büyüme ve kısalma) sonra fazlar arası hücrelerinin 10, 20, 25 periferik bölgede hassas bir kamera kullanarak time-lapse tarafından kaydedilir. Mikroskop çeşitli Bu amaçla kullanılmış olsa da, burada bildirilen protokol ters evrişim mikroskop kullanılır.

İn vivo olarak, dinamik kararsızlık ise, sadece mikrotübül artı uçları (β-tübülin dışa bakacak şekilde uçları) oluşureksi uçları (dışa bakan α-tubulin ile biter) aynı uzunlukta 26 kalır. Öte yandan, in vitro bir araya mikrotübüllerin için, dinamik dengesizlik artı uçları eksi 27 sona daha sağlam olması ile, mikrotübül iki ucunda meydana gelir. In vitro dinamik istikrarsızlık analiz ana avantajı hücresel MAP'ler yokluğunda mikrotübül dinamiklerine farklı ajanların spesifik rolü hakkında mekanik bilgi sağlamasıdır. Ayrıca, in vitro koşullarda, dinamik dengesizlik her iki uçta da incelenebilir. Bu ilaçlar ya da düzenleyici proteinler zıt uçlarında mikrotübül istikrarını etkileyen mekanizmaları içgörü sağlar. Tarihsel olarak, eksi uçları artı 10 biter çok daha az izlenir. Mikrotubul davranış anlayışımızın çok in vitro saflaştırılmış tubulin monte mikrotübüller üzerindeki çalışmalardan gelmektedir. Bu çalışmalardan elde edilen mikrotübül davranış temel ilkeleri çoğu da hücrelerde mikrotübül uygulanabilir Ancak, in vitro ve in vivo olarak mikrotübül dinamiklerinin bazı farklılıklar vardır. Hücrelerde mikrotübül genellikle bir beş büyümeye daha hızlı oran on kat ve büyüme ve / veya katı arasındaki geçişler, in vitro olarak arıtılmış, tübülin monte mikrotübüller ile daha sık ~ 10 kat oluşur. Hücresel mikrotübül davranış mekansal ve zamansal düzenleme yüksek derecede yansıtmaktadır hücre döngüsü boyunca dramatik mikrotübül organizasyonu değişiklikler ve dinamikleri de vardır. Bu davranış, in vitro araştırmalar tarafından incelenen edilemez. Ayrıca, mikrotübül dinamiklerinin düzenlenmesi tübülin sonrası modifikasyon, tübülin izotip ifade ve stabilize veya mikro istikrarsızlaştırmak ya Maps ve diğer mikrotübül etkileşen proteinlerin büyük bir grup ile elde edilir29, 28 tübüler. Bu nedenle, canlı hücrelerin mikrotübül istikrarsızlık okuyan çok daha fizyolojik uygulanabilir.

Burada tarif edilen yöntem, canlı hücrelerde mikrotübül dinamiklerinin incelemek için basit ve çok güvenilir bir protokoldür. daha fazla dikkat gerektiren adımlar gözlem için hücre seçimi ve maruz kalma süresi belirlenmesi vardır. Düz olan hücreleri seçmek ve GFP-tubulin yüksek floresan yoğunluğu kritik öneme sahiptir. Uyarım yoğunluğunu ve GFP flöresan solmasını önlemek için maruz kalma süresini azaltmak için de arzu edilir. Elbette, in vivo yöntemlerle diğer hepsi gibi, bu protokol çeşitli manipüle koşullarda mikrotübül dinamik istikrarsızlık incelemek için uygun değildir. Örneğin, α- ve β-tubulin farklı izoformlar mikrotübül dinamiklerinin açısından farklı davranabilirler. Ancak in vitro yöntemler s kullanılabilirtudy mikrotübül dinamik istikrarsızlık bireysel saflaştırılmış tübülin izoformlarının etkileri. Ayrıca, floresans etiketli tubulin mikroenjeksiyon ile karşılaştırıldığında, transfeksiyon ya da plazmidlerin transdüksiyonu ile GFP etiketli tubulin ekspresyonu nispeten düşük bir sinyal-gürültü oranı sergileyebilir. Bununla birlikte, transfeksiyon ya da plazmidlerin transdüksiyonu ile hücrelerinde GFP-etiketli tubulin sentezlenmesi daha fazla özgürlük deneysel diğer hücre özelliklerinin değiştirilmesine imkan tanır.

Burada bildirilen protokol çeşitli çalışmalar için kullanılan olabilir. Bir yandan, özellikle mitoz sırasında hücre döngüsünün çeşitli evrelerinde mikrotübüllerin fonksiyonu ile ilgili olarak, yeni ve önemli bir temel sağlayabilir. Ayrıca mikrotübül dinamiklerine, göç gibi çeşitli hücresel işlemleri, etkilerini incelemek için kullanılabilir. Diğer taraftan, bu, normal mikrotübül dinamiklerine (birçoğu kanser ilaçlarıdır), çeşitli mikrotübül inhibitörleri etkilerini incelemek için kullanılabilir veDaha fazla fizyolojik koşullar altında kanserli hücre. İkimiz de dosetaksel dayanıklı olmayan dosetaksel dayanıklı meme kanser hücrelerinde mikrotübül dinamik istikrarsızlık çeşitli anti-mitotik kanser ilaçlarının etkilerini incelemek için bu yöntemi kullanmışlardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Non-essential amino acids Life Technologies, Invitrogen 11140-050
FBS Gibco, Invitrogen 12483
Anti-Anti (100x) Life Technologies, Invitrogen 15240-062
docetaxel Sigma-Aldrich 01885-5mg-F
DMEM phenol red-free Gibco, Invitrogen 21063
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin ThermoFisher Scientific C10613 Key reagent for expressing GFP tubulin in cells
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP ThermoFisher Scientific B10383 Control
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich+B9:AA9 472301 for dissoving decetaxel
22-mm glass coveslip Fisher Scientifics 12-545-101
6-well culture plate Greiner Bio-One International 6 Well Celi Culture Plate
DeltaVision Microscopy Imaging Systems GE Health This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific Hausser Scientific, Distributed by VWR Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
  2. Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414 (2013).
  3. Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
  4. Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
  5. Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
  6. Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
  7. Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
  8. Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
  9. McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
  10. Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
  11. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
  12. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  13. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
  14. Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
  15. Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
  16. Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
  17. Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
  18. Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
  19. Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
  20. Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
  21. Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
  22. Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
  23. Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
  24. Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318 (2008).
  25. Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
  26. Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
  27. Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
  28. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
  29. Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).

Tags

Cancer Research Sayı 120 tubulin Mikrotubul Mikrotubul dinamik dengesizlik Meme kanseri taksan dirençli Docetaxel Canlı görüntüleme, Ve GFP-tübülin
Canlı Görüntüleme taksan dirençli Meme Kanserlerinde Mikrotubul dinamik dengesizlik Eğitim için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, R., Wang, H., Wang, Z. Live… More

Wang, R., Wang, H., Wang, Z. Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers. J. Vis. Exp. (120), e55027, doi:10.3791/55027 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter