Introduction
Den førende dødsårsag brystkræft er gennem metastase 1, 2. Taxaner, såsom docetaxel og paclitaxel, der i øjeblikket anvendes som førstevalg regimer i behandlingen af metastatisk brystkræft 2, 3, 4, 5, 6. De er en del af en gruppe af mikrotubuli-targeting midler (MTA'er), der forstyrrer mikrotubulusdynamik. Men en af de største udfordringer for anvendelse af taxaner i kurativ terapi er udviklingen af taxan resistens i cancerceller, hvilket fører til recidiv 7. Lægemiddelresistens tegner sig for mere end 90% af alle dødsfald blandt patienter med metastatisk brystkræft 7.
Mikrotubuli dannes ved polymerisation af a- og p-tubulin-heterodimererclass = "xref"> 8, 9. Den præcise regulering af mikrotubulusdynamik er vigtigt for mange cellulære funktioner, herunder celle polarisering, cellecyklusprogression, intracellulær transport, og cellesignalering. Dysregulering af mikrotubuli og deres dynamik vil forstyrre cellefunktion og resultere i celledød 10, 11. Afhængigt af, hvordan de forårsager denne fejlregulering, kan MTA narkotika klassificeres som enten mikrotubuli stabiliserende midler (dvs. taxaner) eller mikrotubuli-destabalizing midler (dvs. vinca alkaloider eller colchicin-site bindemidler) 20. Trods deres modsatte virkninger på mikrotubulus masse, ved en tilstrækkelig dosering, kan begge klasser dræbe kræftceller via deres virkninger på mikrotubulusdynamik 21.
Taxaner fungerer primært ved at stabilisere mikrotubulære spindel 12, der fører tilkromosomal fejljustering. Den efterfølgende perpetual aktivering af spindlen samling kontrolpunkt (SAC) standser cellen i mitose. Langvarig mitosestandsning derefter forårsager apoptose 13, 14. Taxan interagerer med mikrotubuli gennem taxan bindingsstedet på β-tubulin 8, 15, som kun er til stede i samlet tubulin 16.
Flere mekanismer for taxan resistens er blevet foreslået 9, 17. Disse mekanismer omfatter både generel multilægemiddelresistens grund af overekspression af lægemiddel-efflux proteiner og taxan-specifik resistens 5, 9, 18, 19. For eksempel kan taxan-resistente cancerceller har ændret ekspression og funktion af visse β-tubUlin isotyper 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Ved anvendelse af en in vivo metode til at måle mikrotubulære dynamik ustabilitet, viser vi, at, når sammenlignet med ikke-modstandsdygtige, parentale MCF-7 CC celler 17, de mikrotubulusdynamik af docetaxel-resistente MCF-7 TXT celler er ufølsomme over for docetaxel behandling.
For bedre at forstå funktionen af MTA'erne og den nøjagtige mekanisme af taxan-resistens i kræftceller, er det vigtigt at måle mikrotubulusdynamik. Her rapporterer vi en in vivo fremgangsmåde til at gøre det. Ved at anvende levende billeddannelse i kombination med ekspressionen af GFP-mærkede tubulin i cellerne, kan vi måle mikrotubulusdynamik af MCF-7 TXT og MCF-7-CC-celler med og without docetaxel behandling. Resultaterne kan hjælpe os med at designe mere effektive lægemidler, der kan overvinde taxan modstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af Celler til live Imaging
- Celledyrkning og såning
- Brug MCF-7 brystcancerceller udvalgt for resistens mod docetaxel (MCF-7 TXT) og deres ikke-resistent parentale cellelinje (MCF-7 CC). Den detaljerede udvælgelsesprocessen og karakterisering af disse udvalgte cellelinjer blev beskrevet tidligere 24.
- Grow alle celler i 10 cm dyrkningsskåle ved 37 ° C i et medium sammensat 90% af Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) og 10% føtalt bovint serum (FBS) og suppleret med ikke-essentielle aminosyrer. Opretholde medium i en 5% CO2-atmosfære. Oprethold MCF-7 TXT-celler ved 5 nM docetaxel.
- Seed celler på dækglas for levende billeddannelse. Sterilisere 24 mm poly-L-lysin-overtrukne dækglas ved at skylle dem med 70% alkohol og derefter udsætte dem for UV natten over. Placer dækglassene i en 6-brønds dyrkningsplade på 35 mm. place et dækglas i hver brønd.
- Fjern mediet fra 10 cm dyrkningsskål og vask af cellerne med PBS. Tilsæt 0,5 ml trypsin-EDTA i skålen for at frigøre cellerne fra skålen. Tilsæt 5 ml dyrkningsmedium til fadet for at neutralisere trypsin efter udstationering af cellerne.
- Tæl cellerne med et hæmocytometer at bestemme antallet af celler pr volumen.
- Der tilsættes ca. 10 5 celler til hver brønd baseret på celleantallet pr volumen. Efter omrystning den forsigtigt, sætte pladen tilbage i kuvøsen til at tillade, at cellerne tillægger dækglas.
- Ekspression af GFP-mærkede α-tubulin
- Til analyse mikrotubulusdynamik, transducere cellerne med GFP-mærkede α-tubulin med den kommercielle GFP-transduktion kontrol (f.eks BacMam) ifølge fabrikantens protokol.
- Dyrke cellerne i brønden i 36 timer i en 37 ° C cellekultur inkubator for at tillade comkomplet adhæsion og 60% konfluens.
- Beregn det passende volumen af GFP-mærkede α-tubulin at tilføje til hver brønd, ifølge den følgende ligning:
Antallet af celler er den anslåede samlede antal celler i brønden på tidspunktet for mærkning og den ønskede PPC er antallet af partikler per celle.
BEMÆRK: podning af MCF-7-celler burde have fordoblet celletallet fra 10 5 til 2 x 10 5 med en ønsket PPC på 20, er derfor 40 pi den nødvendige for hvert dækglas volumen. For forskellige celler, beregnet volumen baseret på ovenstående formel kan ikke være den bedste. Den nøjagtige mængde bør justeres i henhold til selve udtrykket niveau af GFP-tubulin. - Bland GFP-mærkede a-tubulin flere gange ved inversion for at sikre en homogen opløsning. Undlad at slynge.
BEMÆRK: For kontrol, Null (kontrol) reagens mangler enhver pattedyr genetiskelementer og kan bruges til at hjælpe med at bestemme potentielle baculovirus-medierede effekter og baggrund fluorescens. kan også anvendes en ikke-målrettet GFP transduktion kontrol, der vil lyse op hele cellen. - Erstat dyrkningsmediet med frisk medium. Tilsæt 2 ml af det nye medie og 40 pi af GFP-mærkede α-tubulin til hver brønd.
- Ryst pladen forsigtigt for at tillade fuldstændig blanding af GFP-mærkede α-tubulin med dyrkningsmediet. Returnere pladen til kulturen inkubator og inkuberes i 24 timer for at tillade ekspression af GFP-tubulin.
- Behandl celler med docetaxel
BEMÆRK: Dette forsøg er at teste effekten af docetaxel på mikrotubulus dynamisk ustabilitet. Således behandles cellerne med den ønskede koncentration af docetaxel.- Forbered et medium sammensat 90% DMEM og 10% FBS og suppleret med ikke-essentielle aminosyrer. Brug DMEM uden phenolrødt fordi phenolrødt kan forstyrre fluorescence af GFP-tubulin. Tilføj den ønskede koncentration af docetaxel (i området fra 10 nM til 10 uM). Stamopløsningen af docetaxel er 10 mM i dimethylsulfoxid (DMSO).
- Pre-varme docetaxel medium til 37 ° C i vævskultur inkubator.
- Erstatte den normale dyrkningsmedium med docetaxel-holdigt medium og inkuberes i 30 minutter i vævskultur inkubator. Der bør være mindst 3 dækglas per brønd for hver koncentration docetaxel.
2. Levende Imaging til at undersøge mikrotubulus Dynamisk ustabilitet
- Opsætning af systemet
- Udfør eksperimenter i et kammer holdt ved 37 ° C og 5% CO2. Acquire fluorescensbilleder ved tidsforskydning med en mikroskopisk udstyret med en 60X, 1,42 NA olie objektivlinse på en inverteret fluorescensmikroskop og med et CCD-kamera.
- Opsætning af celler til direkte billedvisning. Pre-varm både prøveholderen ogmediet til 37 ° C. Vælg et dækglas til at undersøge. Monter dækglasset af renter på en prøve holder og inkuberes med 1 ml af docetaxel medium forberedt i trin 1.3.1.
- Levende billeder af mikrotubuli dynamisk ustabilitet
- Identificere de celler, der vil blive anvendt til billeddannelse. De skal være fladt, have en høj fluorescensintensitet af udtrykt GFP-tubulin, og har klare mikrotubulus strukturer.
- Vælg en celle fra gruppen af identificerede celler fra trin 2.2.1 at undersøge først. Fokus på det perifere område af den identificerede celle. Opsætning af programmet for eksponeringstid og hyppigheden af erhvervelsen billede. Som eksponeringstid er normalt 0,5 s, vil billederne blive overtaget hver anden s.
- Tillad yderligere 20 minutter for de skridt fra 1,33 til 2.2.3. Således præcis 50 minutter efter tilsætning af docetaxel, som beskrevet i trin 1.3.3, starte billeddannelse (dette er til standardisering).
- Optag mikrotubuli dynamics i 2 min, tager et foto hver 2 s. I alt erhverve 60 billeder til den identificerede celle.
- Flyt til næste identificerede celle og gentag trin 2.2.2 til 2.2.4. Gentag proceduren, indtil 5 celler er blevet afbildet. Det er bydende nødvendigt at gøre dette inden tiden når 70 min efter tilsætning af docetaxel, som beskrevet i trin 1.3.3.
- For hver behandling tilstand, skal du gentage trin 2.2.1 til 2.2.5 i 3 forskellige dækglas. I alt billede 15 celler, som er tilstrækkelige data til at måle mikrotubulus dynamisk ustabilitet.
3. Billedbehandling og dataanalyse
- Udfoldning af billeder
- Deconvolve de erhvervede billeder for at opnå en høj kvalitet. Åbn deconvolution program udstyret med mikroskopet system.
- Klik på "Process" og vælg "Deconvolve." Træk billedfilen til "Input" og klik "Do." Billedet fil vil blive udfoldede, ogudfoldede fil vil blive gemt som en ny fil automatisk.
- Generering af videoer
- Klik på den udfoldede billedfil til at åbne med udstyret software.
- Klik på "Filer" og vælg "Gem som film." Vælg "Film format" som "AV" og "Animation stil" som "Forward". Indstil "Compression kvalitet" til "100%" og "Frame rate" til "5 / sekund."
- Markér afkrydsningsfeltet for "Animer gennem tiden", og klik på "Gør det." Videoen vil blive genereret.
- Måling af mikrotubulus afkortning og vækstrate
- Identificere de mikrotubuli, der vil blive anvendt ved målingerne. For hver celle, vil kun et par mikrotubuli kunne have deres afkortning eller vækst efterfulgt klart og fuldstændigt.
- Undersøge hver frame af videoen til at identificere den ramme, der viser start længde af mikrotubulus ennd rammen med den mest forlænget eller forkortet mikrotubuli. Måle ændringen i længde mellem de to mikrotubuli og tidsrummet mellem de to rammer.
- Beregn vækstraten eller afkortning ved at dividere ændringen i længde efter tid (enheden er um / s). For hver behandling tilstand, følge mindst 10 celler og måle mindst 20 mikrotubuli.
- Beregn gennemsnittet og standardafvigelsen for hver behandling tilstand. Analysere statistisk forskel mellem de betingelser under anvendelse af Student-test. Rapporter data i en tabel og / eller i et diagram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under anvendelse af protokollen fremlagt her, studerede vi effekterne af docetaxel på mikrotubulusdynamik normale (MCF-7 CC) og docetaxel-resistente (MCF-7 TXT) brystcancerceller. To sæt billeder viser virkningerne af docetaxel (0,5 uM) på mikrotubulus vækst og afkortning i MCF-7 CC og MCF-7 TXT-celler (figur 1A).
Vi beregnede også hastigheden af mikrotubulus vækst eller forkortning under disse betingelser i de to cellelinier og viste, at ved 0,5 uM, docetaxel kraftigt inhiberer tubulin dynamik MCF-7 CC celler, men ikke MCF-7 TXT celler (Figur 1B).
Figur 1: Virkningerne af Docetaxel på mikrotubulus Dynamics af MCF-7 TXT og MCF-7 CC Cells. Den levende billeddannelse blev udført som beskrevet. (A) De valgte billeder fra den levende billeddannelse af mikrotubulusdynamik i MCF-7 CC og MCF-7 TXT celler efter behandling med 0,5 pM docetaxel i 1 time. Pilen angiver strækker mikrotubuli. Den pilespids angiver afkortning mikrotubuli. Størrelse bar = 5 um. (B) Forlængelsen sats og afkortning på mikrotubuli blev målt fra de optagede billeder. Hvert datum er gennemsnittet af 20 målinger fra mindst 8 forskellige celler. Fejlen bar er standard fejl. ** Angiver, at forskellen er statistisk signifikant, med p <0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er to store metoder til at måle mikrotubulære dynamisk ustabilitet: in vitro og in vivo. I in vitro-metode, oprenses tubulin anvendes til at måle mikrotubulus dynamisk ustabilitet med computer-forbedret time-lapse differential interferens-kontrast mikroskopi. I in vivo-metoden, mikroinjiceres fluorescerende tubulin, eller udtrykkes GFP-tubulin, er indarbejdet i mikrotubuli. Dynamikken (vækst og afkortning) af mikrotubuli registreres derefter ved tidsforskudt anvendelse af et følsomt kamera i det perifere område af interfase-celler 10, 20, 25. Selv om forskellige typer af mikroskoper har været anvendt til dette formål, protokollen vi rapporteret her anvender en dekonvolution mikroskop.
In vivo, dynamisk ustabilitet forekommer kun på mikrotubuli plus ender (enderne med β-tubulin vender udad), hvorimodde minus ender (enderne med α-tubulin vender udad) forbliver den samme længde 26. På den anden side, for mikrotubuli samlet i vitro, dynamisk ustabilitet forekommer ved begge ender af mikrotubuli, med de plus ender er mere robust end minus ender 27. Den største fordel ved at analysere dynamisk ustabilitet in vitro er, at det giver mekanistisk information om den særlige rolle, forskellige agenter på mikrotubulusdynamik i fravær af cellulære kort. I henhold til in vitro-betingelser, dynamisk ustabilitet kan studeres i begge ender. Det giver indsigt i de mekanismer, som narkotika eller regulatoriske proteiner påvirker mikrotubuli stabilitet ved de modsatte ender. Historisk set er de minus ender spores meget mindre end plus slutter 10. Meget af vores forståelse af mikrotubuli adfærd kommer fra undersøgelser af mikrotubuli samlet af renset tubulin in vitro. Men mens mange af de grundlæggende principper for mikrotubuli adfærd erfaringer fra disse studier også kan anvendes til mikrotubuli i celler, der er visse forskelle i mikrotubulusdynamik mellem in vitro og in vivo. I celler, mikrotubuli ofte vokse med en fem- til ti gange hurtigere, og overgange mellem vækst og / eller afkortning opstår ~ 10 gange hyppigere end med mikrotubuli samlet af renset tubulin in vitro. Der er også dramatiske ændringer i mikrotubuli organisation og dynamik i hele cellecyklus, som afspejler en høj grad af rumlig og tidsmæssig regulering af cellulære mikrotubuli adfærd. Denne adfærd kan ikke studeres ved in vitro-forskning. Endvidere er reguleringen af mikrotubulusdynamik opnås ved tubulin posttranslationelle modifikation, tubulin isotype udtryk, og en stor gruppe af kort og andre mikrotubuli-interagerende proteiner, enten stabilisere eller destabilisere mikrotubuli 28, 29. Derfor studerede mikrotubulus ustabilitet i levende celler er meget mere fysiologisk relevant.
Den her beskrevne fremgangsmåde er en enkel og meget pålidelig protokol til at studere mikrotubulusdynamik i levende celler. De skridt, der kræver mere opmærksomhed, er valget af cellen til observation og bestemmelse af eksponeringstiden. Det er afgørende at vælge celler, som er flad og har høj fluorescensintensitet af GFP-tubulin. Det er også ønskeligt at reducere intensiteten af excitation og behandlingstid for at undgå svækkelsen af GFP-fluorescens. Bestemt, ligesom alle de andre in vivo-metoder, denne protokol er ikke egnet til at studere mikrotubulære dynamisk ustabilitet under forskellige manipulerede betingelser. For eksempel kan forskellige isoformer af α- og β-tubulin opfører sig anderledes med hensyn til mikrotubulusdynamik. Kun in vitro-metoder kan anvendes til at sgelse virkningerne af individuelle oprensede tubulin isoformer på mikrotubuli dynamisk ustabilitet. Endvidere sammenlignes med mikroinjektion af fluorescensmærket tubulin, kan ekspressionen af GFP-mærket tubulin ved transfektion eller transduktion af plasmider udviser en relativt lavere signal-til-støj-forhold. Ekspression af GFP-mærkede tubulin i cellerne ved transfektion eller transduktion af plasmider tillader dog mere frihed til eksperimentelt ændre andre cellulære karakteristika.
Protokollen rapporterede her kan anvendes til forskellige undersøgelser. På den ene side kan det tilvejebringe hidtil ukendte og kritiske indsigter vedrørende funktionen af mikrotubuli under forskellige faser af cellecyklussen, især i mitose. Den kan også anvendes til at undersøge virkningerne af forskellige cellulære processer, såsom migration på mikrotubulusdynamik. På den anden side kan det anvendes til at undersøge effekten af forskellige mikrotubuli inhibitorer (mange af dem er cancerlægemidler) på mikrotubulusdynamik i normal ogkræftceller under mere fysiologiske betingelser. Vi har anvendt denne metode til at undersøge virkningerne af forskellige anti-mitotiske cancerlægemidler på mikrotubulus dynamisk ustabilitet i både docetaxel resistente og ikke-resistente docetaxel brystcancerceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
References
- Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
- Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414 (2013).
- Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
- Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
- Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
- Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
- Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
- Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
- McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
- Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
- Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
- Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
- Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
- Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
- Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
- Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
- Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
- Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
- Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
- Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
- Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318 (2008).
- Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
- Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).
