Murine Aortic Crush Injury: Eine effiziente In vivo Modell der glatten Muskelzellproliferation und Endothelfunktion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Tiermodell zu schaffen, das die gleichzeitige Beurteilung der Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen und der Reendothelisierung ermöglicht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Gefäßbiologie zu beantworten, wie z.B. was ist der Mechanismus der Restenose nach vaskulären Eingriffen? Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige in vivo Beurteilung der Proliferation und Reendothelisierung von vaskulären glatten Muskelzellen.

Beides Schlüsselereignisse, die die Restenose nach vaskulären Eingriffen verstärken oder abschwächen. Das Verfahren wird von Dr. Dan Yu, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Nachdem Sie bestätigt haben, dass Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren, entfernen Sie die Haare am Bauchbauch einer anästhesierten, 10 bis 12 Wochen alten männlichen C57BL/6-Maus vom Brustbein bis zur Leistenregion.

Desinfizieren Sie anschließend den Schulterbereich mit 70 % Ethanol und verwenden Sie eine 25-Gauge-Nadel oder kleiner, um eine geeignete Analgesie zu verabreichen. Legen Sie das Tier dann in Rückenlage auf ein chirurgisches Tablett, das mit einem isothermen Pad beheizt wird. Schrubben Sie das OP-Sehvermögen mit Betadin oder Chlorhexidin und einer Alkoholspülung.

Wiederholen Sie beide Schritte zwei weitere Male. Tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf. Nachdem Sie einen Schnitt in die mediane abdominale Laparotomie gemacht haben, reflektieren Sie den Dünndarm und den Zwölffingerdarm seitlich nach rechts.

Mit einem neuen Applikator mit Wattespitze legen Sie das Retroperitoneum und die Bauchschlagader von der linken Nierenvene bis zur Aortengabelung frei. Verwenden Sie dann einen weiteren sterilen Applikator mit Wattespitze, um die Aorta 30 aufeinanderfolgende Quetschungen innerhalb von fünf Sekunden durchzuführen. Nachdem die letzte Quetschverletzung verabreicht wurde, entfernen Sie die Watterolle und lassen Sie die Eingeweide in ihre ursprüngliche Position zurückkehren.

Verwenden Sie dann eine geflochtene, resorbierbare Naht, um die Faszie zu schließen, und schließen Sie die Haut mit einer laufenden 6-0, nicht resorbierbaren, monofilen Naht und setzen Sie das Tier in einen Auffangkäfig mit sauberer Einstreu mit Überwachung bis zum vollständigen Liegen. Um die endotheliale Integrität des verletzten Herzgewebes zu analysieren, wird zum geeigneten experimentellen Zeitpunkt eine 21-Gauge-Nadel in den linken Ventrikel des exsanguinierten Herzens eingeführt. Injizieren Sie PBS, bis das Abwasser aus dem rechten Vorhof klar ist, und perfundierten Sie das Tier dann fünf Minuten lang mit fünf Millilitern 0,3 %Evans-Blau-Farbstoff bei physiologischem Druck, gefolgt von fünf Millilitern frischem PBS.

Öffnen Sie am Ende der PBS-Infusion den Bauch mit einem Mittellinienschnitt und mobilisieren Sie den Dünndarm zur rechten Seite des Bauches, wie gerade gezeigt, um die infrarenale Aorta freizulegen. Präparieren Sie die Aorta scharf von den angrenzenden Geweben und schneiden Sie das Gefäß von der linken Nierenvene zur Aortenbifurkation heraus, um es in 4%igem Paraformaldehyd zu lagern. Am Ende der Fixierung öffnet man die Aorta in Längsrichtung und heftet das Gewebe an eine Wachsfolie, die die gesamte luminale Oberfläche freilegt, um die qualitative Beurteilung der endothelialen Integrität anhand des Grades des Evansblau-Farbstoffs zu ermöglichen.

Eine Quetschverletzung führt zu einer Verdickung der Aortenwand im Vergleich zu den Aorten von Tieren, die mit einem Scheinverfahren behandelt wurden, wobei drei Tage nach der Verletzung die größte Wandstärke beobachtet wurde. Die Verletzung führt auch zu einem abgerundeten Erscheinungsbild in den Zellen mit einer entsprechenden unregelmäßigen Kontur der Lumenoberfläche. Die EdU-Inkorporation deutet darauf hin, dass die vermehrte Wandverdickung der verletzten Aorta zumindest teilweise durch die vermehrte Proliferation medialer vaskulärer glatter Muskelzellen vermittelt wird.

Die Phospho-Erk1/2-Expression wird drei Tage nach der Verletzung mit einer um mehr als 200 % höheren Expression als zu Studienbeginn beobachtet, wobei eine verminderte Expression von p27Kip1 zu frühen Zeitpunkten gemessen wurde. Sowohl die Phospho-Erk1/2- als auch die p27Kip1-Expression kehren einen Monat nach der Verletzung auf das Ausgangsniveau zurück, was darauf hindeutet, dass die beobachtete Verdickung der Aortenwand auch teilweise auf eine erhöhte mediale Proliferation zurückzuführen ist. Wie mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie beurteilt, führt eine Quetschverletzung der luminalen Oberfläche der Aorta zu einer Störung der Endothelzellen und einer teilweisen Entblößung des Endothels.

Darüber hinaus ermöglicht eine Schädigung der Barrierefunktion des Endothels die Färbung der Basalmembran mit Evansblau-Farbstoff, während das Endothel von Mäusen, die allein mit einer Laparotomie behandelt wurden, seine Barrierefunktion und sein weißes Aussehen beibehält. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 20 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die auf die Aorta ausgeübte Kraft konsistent ist und der operierende Wissenschaftler für die experimentellen Bedingungen der Maus blind ist, um Verzerrungen zu vermeiden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Evans Blue Farbstoff und Paraformaldehyd gefährlich sein kann und dass bei der Verwendung dieser Materialien immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen getroffen werden sollten.