Summary
Lever verwondingen worden begeleid door voorlopercellen cel expansie die een heterogene populatie cellen vertegenwoordigt. Nieuwe indeling van deze cellulaire compartiment zorgt voor de onderscheidende meerdere subsets. De hier beschreven methode laat de flowcytometrieanalyse en hoge zuiverheid isoleren van diverse subsets die kunnen worden gebruikt voor verdere tests.
Abstract
Tijdens chronische lever verwondingen, progenitorcellen breiden in een proces genaamd ductulaire reactie, die ook betrekking heeft op de weergave van inflammatoire cellulaire infiltraat en epitheliale cel activatie. De populatie voorlopercellen gedurende deze ontstekingsreacties is meestal onderzocht middels enkel oppervlak markers, door histologische analyse of met flowcytometrie-gebaseerde technieken. Echter, nieuwe oppervlak markers geïdentificeerd verschillende functioneel verschillende subgroepen binnen de lever voorloper / stamcel compartiment. De hier gepresenteerde methode beschrijft de isolatie en gedetailleerd flowcytometrie analyse van voorlopercellen subsets door middel van nieuwe oppervlak marker combinaties. Bovendien toont hoe de verschillende voorlopercel deelverzamelingen kunnen worden geïsoleerd met hoge zuiverheid met behulp van geautomatiseerde magnetische en FACS sortering-gebaseerde methoden. Belangrijker nieuwe en vereenvoudigde enzymatische dissociatie van de lever maakt de isolatie van deze zeldzame celpopulaties met een hoge levensvatbaarheiddie superieur in vergelijking met andere bestaande methodes. Dit is met name relevant voor verdere studie voorlopercellen in vitro of scheidt hoogwaardige RNA aan het genexpressieprofiel analyseren.
Introduction
Leverregeneratie wordt meestal geassocieerd met de zelfvernieuwingscapaciteit van hepatocyten. Niettemin chronische leveraandoeningen letsels ontstaan met progenitor cel activatie en expansie, die zijn geassocieerd met hun vermogen om te differentiëren in hepatocyten en cholangiocyten 1, 2, 3, 4. Dit is bijzonder relevant omdat, tijdens chronische letsels, hepatocyten proliferatie niet effectief. Ondanks meerdere genetische tracing studies gericht progenitorcellen, hun rol in leverregeneratie blijft controversieel 5, 6, 7, 8. Bovendien heeft het activeren van voorlopercellen in verband gebracht met verhoogde fibrotische respons in de lever, die vragen over hun precieze rol verhoogt tijdens verwondingen 9, 10.
De heterogeniteit van de voorlopercellen compartiment lang gesuggereerd genexpressiestudies dat progenitor cellen die een enkel oppervlak aanwijzer kan microdissectie of celsortering-gebaseerde werkwijzen 1, 11 geïsoleerd. Sterker nog, onlangs, een roman oppervlak marker combinatie met behulp van GP38 (podoplanin) eenduidig gekoppeld vorige single markers van stamcellen aan verschillende subgroepen 12. Belangrijk is dat deze subgroepen niet alleen verschilden in oppervlakte marker expressie maar vertoonden functionele veranderingen gedurende 12 verwondingen.
Meerdere dierlijke modellen zijn gebruikt om te onderzoeken voorlopercellen cel activatie en de lever regeneratie. Het lijkt erop dat de verschillende soorten schade bevorderen de activering van verschillende subsets van progenitorcellen 12. Dit kan het ph verklarenenotypic divergentie van de ductulaire reactie waargenomen bij mensen 4. Dus de complexe fenotypische en functionele analyse van progenitorcellen zijn cruciaal voor hun rol in verwondingen en de ware betekenis van ductulaire reactie leverziekten begrijpen.
Naast de oppervlakte marker combinaties, de cruciale verschillen in cel isolatie protocollen verder te compliceren de conclusies op basis van eerdere studies 2. Een aanzienlijke hoeveelheid onderzoek gericht de rol van stamcellen die sterk verschillen in hun isolatieprotocol (bijvoorbeeld lever dissociatie (enzymcombinatie en duur van het proces), medium dichtheid en centrifugeersnelheid) 2. Een geoptimaliseerde isolatie techniek, een betere leefbaarheid voor zeldzame celpopulaties en een afspiegeling is van subgroep samenstelling, is ontwikkeld en onlangs 12 gepubliceerd. Het doel van dit artikel is om een meer det biedenailed protocol van deze levercel isolatiewerkwijze en deelanalyse om de juiste reproductie van de techniek. Bovendien, het protocol bevat een vergelijking met de vorige isolatiewerkwijze de verschillen met het nieuwe protocol demonstreren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de ethiek en verzorging van dieren commissies van Homburg University Medical Center.
1. Voorbereiding van Materialen en Buffers
- Vers voor te bereiden alle buffers die nodig zijn voor de lever spijsvertering met steriele componenten en een laminaire kap om bacteriële besmetting te voorkomen.
- Bereid de collectie buffer (CB) door mengen 49,5 ml RPMI medium en 0,5 ml foetaal runderserum (FBS, laag endotoxine, geïnactiveerd) aan een oplossing 1% (v / v) te bereiken. Bewaar de oplossing op ijs tot verder gebruik.
OPMERKING: Ongeveer 25 ml CB moet een gehele lever verteren. - Bereid de digestie buffer (DB) met de volgende ingrediënten: RPMI-medium, 1% (v / v) FBS (laag endotoxine, hitte geïnactiveerd), collagenase P (0,2 mg / ml), DNase-I (0,1 mg / ml) en dispase (0,8 mg / ml).
OPMERKING: Ongeveer 25 ml DB moet een gehele lever verteren. Pre-warm de DB in thij 37 ° C waterbad voor gebruik. - Reconstrueren de enzymen bij aankomst in Hanks 'gebalanceerde zoutoplossing (HBSS; collagense P en dispase) of DNase-I buffer (50% (v / v) glycerol, 1 mM MgCl2 en 20 mM Tris-HCl, pH 7,5) , aliquot het, en op te slaan bij -20 ° C. Bewaar de DNase I-buffer bij 4 ° C en gebruik het binnen twee maanden.
2. Voorbereiding van de lever Single-cell Suspension
- Euthanaseren onbehandeld wild-type muizen door cervicale dislocatie in overeenstemming met de lokale ethiek en verzorging van dieren commissies.
- Leg de muizen op een dissectie board en nat van de vacht met 70% ethanol. Met een schaar, opent de buik met een middellijn incisie van de huid, gevolgd door een Y-incisie aan de ledematen. Open het buikvlies tot aan het borstbeen met de schaar. Om de lever bloot te leggen, verplaatsen de darm voorzichtig naar rechts met een wattenstaafje.
- Met de hulp van een schaar en pincet, verwijder de lever lobben,het verlaten van de galblaas achter, en besmetting met bindweefsel te voorkomen. Weeg de lever en plaats het op het ijs in een petrischaal met HBSS.
- Plaats de lever lobben op een droge petrischaal en snijd de leverweefsel in homogene blokjes van ongeveer 2 mm een zij met behulp van een scalpel. Breng de stukken in een 15-ml conische centrifugebuis.
- Voeg 2,5 ml van DB naar de 15-mL conische centrifugebuis die de lever stukken en leg het in een 37 ° C waterbad om de spijsvertering te starten (een gezonde lever duurt 60-70 min en een levercirrose neemt 80-90 min ).
Opmerking: Als een gehele lever wordt verteerd, moet de lever worden gescheiden in twee 15-ml conische centrifugebuizen goede cellevensvatbaarheid waarborgen. - Bereid een nieuwe 15 ml conische centrifugebuis om vrijgelaten levercellen te verzamelen. Plaats een polyamide 100-um zeef bovenop de buis en bevochtig het gaas met 800 gl CB. Plaats de conische centrifugebuis op ijs.
- Meng de samples in het 37 ° C waterbad na 5 en 10 minuten om de spijsvertering te ondersteunen door schudden van de 15-ml conische centrifugebuis die de lever stukken.
- 15 minuten na het starten van de spijsvertering, meng de lever stukken met behulp van een 1000-ul pipet met een cut tip dat de lever stukken in staat stelt door middel van eenvoudig te passen. Plaats de buizen terug in het waterbad en laat de stukken te regelen voor 2 min.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof met de verspreide cellen (meestal 2x 700 ui) en voeg deze toe aan de buis bereid in stap 2.6. Vervang de verwijderde bovenstaande vloeistof met DB (2x 700 pi) en plaats het terug in de 37 ° C waterbad.
- Herhaal de procedure in stap 2,8 (kenmerkend bij 30, 40, 50, 55 en 60 min) beschreven tot ongeveer 60-70 minuten sinds het begin van de spijsvertering doorgegeven. Vanaf 40 minuten verder, moet het resterende lever stukken klein genoeg om door middel van een ongesneden 1000-pi pipet tip door te geven.
LET OP: De gezonde lever is DIGEsted volledig binnen 60-70 min, terwijl fibrotische lever meestal nodig 80-90 min. Door dit tijdstip moet het leverweefsel niet zichtbaar op de conische 15 ml centrifugebuis die de lever stukken en alle uitgebrachte cellen worden overgebracht in de buis bereid in stap 2.6. - Aan het eind van de spijsvertering, het verzamelen van de cellen en centrifugeer ze gedurende 8 min bij 180 xg en 4 ° C (onder verminderde versnelling / vertraging en 4/2).
- Resuspendeer de celpellet in 1 ml ammonium- chloride-kalium (ACK) lysis buffer en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur om de rode bloedcellen te lyseren. Stop de reactie door toevoeging van 5 ml CB en centrifugeer de cellen gedurende 8 min bij 180 xg en 4 ° C (onder verminderde versnelling / vertraging en 4/2). Resuspendeer de cellen in 4 ml CB en bewaar ze op ijs. Tel de cellen, zoals beschreven in stap 3.
OPMERKING: De celpellet los, en daarom wordt de supernatant verwijderd gepipetteerd plaats van gedecanteerd.3. Bepaling van het aantal cellen met behulp van flowcytometrie
Opmerking: Voor het bepalen van het aantal cellen of een geautomatiseerde celgetalmeter of, idealiter, wordt de doorstroomcytometrie-gebaseerde cel kwantificering hieronder voorgesteld in plaats van de klassieke Neubauer kamerstelsel methode. De lever eencellige suspensie in stap 2 beschreven bevat parenchym en niet-parenchymale cellen (NPC) met zeer verschillende afmetingen en granularities. De juiste uitsluiting van cellulaire resten met de gating-on voorwaartse verstrooiing, zijwaartse verstrooiing (FSC-SSC) kenmerkend NPC bij gebruik van stromingscytometrie zorgt het succes van de 12 beschreven protocol.
- Bereid een monster van de lever celsuspensie (20 ui) en voeg 174 ul van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 6 pl propidiumjodide (PI; eindconcentratie 0,375 ug / ml). Optellende parels die het mogelijk maken de kwantificering van de cellen.
- Gate aan SSC-A-FSC-A om vuil te voorkomen en verder sluiten doubletten behulp FSC-H en FCS-A.
NB: Het is belangrijk om de gating strategie weergegeven in figuur 2 te volgen. - Gate out PI-positieve dode cellen, het meten van 30 pi van uw monsters, en de gebeurtenissen vast te leggen. Volg de richtlijnen van de fabrikant om het aantal cellen te berekenen.
LET OP: Volg de stappen 4 voor flowcytometrie meting, stappen 5 en 6 voor magnetische gebaseerd voorlopercellen cel isolatie, en stap 7 voor flowcytometrie soort voorlopercellen subpopulaties.
4. kleuring van de lever Single-cell suspensie voor de Fow Cytometry Analyse van Progenitor subsets
Antilichaam Clone Host / Isotype Stock Concentratie [mg / ml] Verdunning CD64 X54-5 / 7.1 Mouse IgG1, κ 0.5 1: 100 CD16 / 32 93 Rat IgG2a, λ 0.5 1: 100 CD45 30-F11 Ratte IgG2b, κ 0.2 1: 200 CD31 MEC13.3 Rat IgG2a, κ 0.5 1: 200 ASGPR1 Polyklonaal Geit IgG 0.2 1: 100 podoplanin 2001/01/08 Syrische Hamster IgG 0.2 1: 1400 podoplanin 2001/01/08 Syrische Hamster IgG 0.5 1: 1400 CD133 Mb9-3G8 rat IgG1 0.03 3 pi CD133 315-2C11 rat IgG2a, λ 0.5 1: 100 CD34 RAM34 Rat IgG2a, κ 0.5 1: 100 CD90.2 53-2,1 Rat IgG2, κ 0.5 1: 800 CD157 BP-3 Muis IgG2b, κ 0.2 1: 600 EpCAM G8.8 Rat IgG2a, κ 0.2 1: 100 Sca-1 D7 Rat IgG2a, κ 0.03 10 pi Muis IgG2b, κ MPC-11 0.2 rat IgG1 RTK2071 0.2 Ratte IgG2b, κ RTK4530 0.2 Rat IgG2a, κ RTK2758 0.5 Rat IgG2a, κ RTK2758 0.2 Syrische Hamster IgG SHG-1 0.2 Syrische Hamster IgG SHG-1 0.5 Normaal Geit IgG controle Polyklonaal Geit IgG 1 Ezel anti-Geit IgG Donkey IgG 2 1: 800 streptavidine 1 1: 400 Tafel 1.
Antilichaam 1 2 3 4 5 CD45 APC / Cy7 Ratte IgG2b, κ
0,5 pl+ + + + CD31 biotine + Rat IgG2a, κ
0,5 pl+ + + ASGPR1 gezuiverd + + Normaal Geit IgG controle
0,2 pl+ + podoplanin APC + + + Syrische Hamster IgG
1 ui van een 1:14 verdunning+ CD133 PE + + </ Td> + + rat IgG1
0,45 piEzel anti-Goat
Alexa Fluor 488+ + + + + streptavidine
Alexa Fluor 405+ + + + + Tafel 2.
- Plaats een hoeveelheid van de celsuspensie uit stap 2,11 in een reactiebuis (1,5 ml) dat 2,5 x 10 5 cellen, bepaald zoals beschreven in stap 3.
- Centrifugeer de cellen gedurende 3 min bij 300 xg en 4 ° C met behulp van een microcentrifuge.
OPMERKING: Op dit punt, kan een vacuümpomp worden gebruikt om voorzichtig de supernatant. - Resuspendeer de cel pellet in Fc-blok mix en incubeer het voor 5 minuten op ijs. Bereid Fc-blok mix met een totaal volume van 50 ul per vlek. Voeg 10 gl FcR-blokkerende reagens, 1 ul van gezuiverd anti-CD64 (1: 100; 0,5 ug / kleuring) en 40 pl vlekken buffer (ST buffer: HBSS, 1% (v / v) FBS en 0,01% natriumazide) per vlek.
OPMERKING: Natriumazide is zeer giftig. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals nitril handschoenen, een laboratoriumjas en een gezichtsmasker. - Voeg 50 ul van kleuring mengsel aan de cellen (de totale hoeveelheid cellen nu 100 ui) en incubeer de cellen met het antilichaam mix, beschermd tegen licht en 20 min op ijs.
- Bereid het antilichaam mix met een totaal volume van 50 ul per vlek. Voor 50 ul van ST buffer, voeg de volgende geconjugeerde antilichamen voor eenvoudige kleuring: CD45 (0,5 ui, 1: 200; 0,1 ug / vlek), CD31 (0,5 ui, 1: 200; 0,25 ug / vlek), ASGPR1 (1 pl ; 1: 100; 0,2 ug / vlek), podoplanin (1 ui van een 1:14 verdunning; 1: 1400 verdunning eind; 0,014 gg / vlek) en CD133 (3 pl; 0,09 gg / kleuring).
LET OP: Table1 vat het antilichaam klonen en verdunningen gebruikt voor basis vlekken en voor meer oppervlaktemerkers van de verschillende subsets. Houd extra celsuspensies voor het antilichaam mengsel dat de overeenkomstige isotype controles en / of fluorescentie minus één controles (FMO), zoals aangegeven in tabel 2. - Voeg 400 ul van ST buffer aan elk monster en centrifugeer de cellen gedurende 4 min bij 300 xg en 4 ° C.Discard het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 pi secondair antilichaam mengsel dat 0,125 gl ezel anti-geit IgG (1: 800, 0,25 ug / kleuring) en 0,25 pl fluorescent-geconjugeerde streptavidine (1: 400, 0,25 ug / kleuring) in 100 pl buffer ST.
- Incubeer de cellen terwijl beschermd tegen licht en met het antilichaam mengsel gedurende 20 min op ijs. Voeg 400 ul van ST buffer aan elk monster en centrifugeer de cellen gedurende 4 min bij 300 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 300 pl ST buffer met 0,25 ug / ml PI.
NB: De cel levensvatbaarheid van stamcellen neemt af met de tijd; Daarom wordt voorgesteld om verse monsters zo snel mogelijk te meten.
5. Magnetische Microbead gebaseerd Verrijking van Progenitor Cellen
- Breng een hoeveelheid van de lever enkelvoudige celsuspensie bevattende 1,5-2 x 10 6 cellen, op basis van het celgetal bepaald zoals beschreven in stap 3, in een nieuwe 15-ml conische centrifugebuis.
- Centrifugeer de cellen gedurende 8 min bij 180 xg en 4 ° C (met behulp van vereenvoudigde versnelling / vertraging en 4/2).
OPMERKING: Meestal een gezonde C57BL / 6 muizenlever (of 1 g leverweefsel) moet in drie 15-ml conische centrifugebuis te scheiden. - Resuspendeer de cellen in 400 ui HBSS 0,5% (v / v) runderserumalbumine (BSA) en voeg 40 ul van anti-CD31 microbolletjes en 30 pl anti-CD45 microbolletjes. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
OPMERKING: niet meer dan tHij incubatietijd, de zuiverheid van de scheiding aanzienlijk wordt verminderd. - Voeg 5 ml HBSS 0,5% (v / v) BSA aan de cellen en centrifugeer ze gedurende 8 min bij 180 xg en 4 ° C (onder verminderde versnelling / vertraging en 4/2).
- Resuspendeer de celpellet in 100 ui van dode cellen verwijderd kralen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min. In de tussentijd bereidt een LS kolom voor de scheiding en het ijken van het met 3 ml HBSS 0,5% (v / v) BSA.
NB: Neem niet meer dan de incubatietijd, de zuiverheid van de scheiding zal aanzienlijk worden verminderd. - Voeg 900 ul HBSS 0,5% (v / v) BSA aan de cellen filteren via 100-um zeef polyamide en plaats ze op de kolom LS scheiding.
LET OP: Laad één hele lever op één LS scheidingskolom. - Was de kolom driemaal met 3 ml HBSS 0,5% (v / v) BSA en laat het doorstroomkanaal.
- Centrifugeer de doorstroming gedurende 8 min bij 180 xg en 4 ° C (onder verminderde acceleration / 4 en vertraging / 2).
- Resuspendeer de celpellet hetzij in spoelbuffer (RB) (PBS en 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)) dat 0,5% (v / v) BSA of ST buffer, afhankelijk van de verdere experimentele procedure.
6. Magnetische Microbead-based Automated Cell Zuivering van voorlopercellen cel subsets gecombineerd uit Multiple levers
OPMERKING: Aangezien progenitor cel subsets vertegenwoordigen zeldzame celpopulaties combineert cellen uit meerdere levers vaak nodig om voldoende aantallen cellen te bereiken voor verdere experimenten. Als voorbeeld, CD133 + en gp38 + celscheiding wordt hieronder beschreven.
- Isolatie van CD133 + progenitors
- Na stap 5.9, tel de cellen, zoals beschreven in stap 3, en resuspendeer tot 10 6 cellen (typisch 4-6 poolen gezonde levermonsters) in 100 pl RB.
- Add anti-CD64 1: 100 en anti-CD16 / 32 1: 100 tot de cellen en incubat ze op ijs gedurende 5 minuten. Voeg 1: 100 anti-CD133 gebiotinyleerd antilichaam aan de cellen en incubeer ze op ijs gedurende nog eens 10 min.
- Voeg 5 ml RB en centrifugeer gedurende 8 min bij 180 xg en 4 ° C (onder verminderde versnelling / vertraging en 4/2).
- Resuspendeer de cellen in 400 pi van RB en voeg 10 ul van anti-biotine microbolletjes. Incubeer het monster gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Niet overschrijden incubatietijd, omdat dit de zuiverheid van de monsters vermindert.
- Voeg 5 ml RB en centrifugeer gedurende 8 min bij 180 xg en 4 ° C (onder verminderde versnelling / vertraging en 4/2). Resuspendeer de pellet in 1 ml RB.
- Isolatie van GP38 + progenitors
- Na stap 5.9, tel de cellen, zoals beschreven in stap 3, en resuspendeer tot 10 6 cellen (typisch 4-6 poolen gezonde levermonsters) in 100 pl RB.
- Add anti-CD64 1: 100 en anti-CD16 / 32 1: 100 aan de cellen en incubeer ze op ijs gedurende 5 minuten. Voeg vervolgens 1:100 anti-gp38 gebiotinyleerd antilichaam aan de cellen en incubeer ze op ijs gedurende nog eens 10 min.
- Voeg 5 ml RB en centrifugeer gedurende 8 min bij 180 xg en 4 ° C (onder verminderde versnelling / vertraging en 4/2).
- Resuspendeer de cellen in 400 pi van RB en voeg 5 ul van anti-biotine microbolletjes. Incubeer het monster gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Niet overschrijden incubatietijd, omdat dit de zuiverheid van de monsters vermindert.
- Voeg 5 ml RB en centrifugeer gedurende 8 min bij 180 xg en 4 ° C (onder verminderde versnelling / vertraging en 4/2).
- Resuspendeer de celpellet in 1 ml RB.
- Vaak stappen na stap 6.1 of 6.2
- Plaats de 15 ml conische centrifugebuis die de magnetisch gelabelde celsuspensies Op een chill 5 rack met twee extra lege buizen voor het verzamelen van de positieve en negatieve fracties. Plaats de kou rek op de scheiding platform van de afscheider.
- Gebruik de positieve selectie programma(Possel_d2) met een uitgebreid wassen stap tussen elk monster (spoeling optie).
OPMERKING: Gebruik kolommen gebaseerde handmatige scheiding van cellen in plaats van het automatische afscheider zal de zuiverheid van het monster te verlagen. - Verzamel de positieve fractie en centrifugeer gedurende 8 min bij 180 xg en 4 ° C (onder verminderde versnelling / vertraging en 4/2).
- Resuspendeer de celpellet hetzij RB of ST buffer, afhankelijk van de verdere experimentele procedure.
- Voor een zuiverheid controle een aliquot van de cellen en vlekken ze als beschreven in stap 4.
7. flowcytometrie Cell Sorting
OPMERKING: Een hoge zuiverheid van elke soort voorlopercel deelverzameling kan worden bereikt met de hierna beschreven protocol. De totale opbrengst aan cellen is veel lager dan die beschreven in stap 6 en het beste is voor genexpressie analyse.
Parameter omgeving nozzle Size 85 urn Frequentie 46,00-46,20 Amplitude 38,30-55,20 Fase 0 Drop Delay 28,68-28,84 verzwakking Uit eerste Drop 284-297 Target Gap 9.-14 Druk 45 psi Tabel 3.
- Verwerven cellen van de magnetische-gebaseerde verrijking (beschreven in stap 5); tellen, zoals beschreven in stap 3; en vlek hen voorlopercellen markers (CD133, gp38), CD31, en CD45 ASGPR1, zoals beschreven in stap 4.
- Bereid sorteren medium (SM): fenol-rood vrij Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) dat 0,5% (v / v) BSA en 0,01% (v / v) natriumazide. Resuspendeer de gekleurde cellen in SM, zet ze in een polypropyleen ronde bodem buis, en leg ze op ijs.
OPMERKING: Natriumazide is zeer giftig. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals nitril handschoenen, een laboratoriumjas en een gezichtsmasker. Niet gebruiken natriumazide als de gesorteerde cellen worden gebruikt voor functionele bepalingen. - Met de juiste software voor het type sorteerder gebruikt voor celisolatie. Open de software en volg de instructies van de fabrikant voor het opzetten van de sorteermachine parameters en machine specificaties.
OPMERKING: De machine specificaties zijn samengevat in tabel 3. Hoewel verschillende machinespecificaties bij verschillende instellingen te maken, is het belangrijk op te merken dat de vermindering van het sorteren druk en een grotere dopmaat nodig (45 psi en 85-um nozzle) de levensvatbaarheid van de voorlopercellen populat vergrotenion en de kwaliteit van het RNA bereid uit de cellen gesorteerd. Belangrijk is verrijkt leverprogenitorcellen gebruikt voor het instellen van de compensatie. Andere lever of leukocyten populaties verschillende auto-fluorescentie en resulteren in een suboptimale oplossing van de stromale bevolking en een valse gating strategie. - Kalibreren van de machine en plaats een 5-mL polypropyleen ronde bodem buis met 350 pi van SM in het soort collectie apparaat. Start monster acquisitie en sorteren. Verzamel 1.000 gebeurtenissen van de subpopulatie en stop de sample flow.
- Neem de buis uit de sorteerinrichting en meet de gesorteerde cellen op de flowcytometer. Identificeer het percentage van de gesorteerde celpopulatie aanwezig tussen de levende cellen. Dit percentage geeft de zuiverheid van de gesorteerde cellen.
- Als een soort zuiverheid 95% overschrijdt, plaats een 5-mL polypropyleen ronde bodem buis met 350 ul RLT lysisbuffer in het soort collectie apparaat.
- Start het soort en het verzamelen van 7,000-10.000 evenementen per stromale subpopulatie.
- Breng de RLT lysisbuffer die de gesorteerde cellen op een DNase- en RNase-vrij reactiebuis en de monsters opgeslagen bij -80 ° C tot verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier gepresenteerde voor de digestie van de lever met een nieuw mengsel van enzymen in een enkele-celsuspensie parenchymale en niet-parenchymale levercellen (figuren 1 en 2a). Na de ACK-lyseren van rode bloedcellen, de directe flowcytometrie analyse van de enkele-celsuspensie mogelijk (figuren 1 en 2). De gating strategie omvat de uitsluiting van doubletten en dode cellen (Figuur 2a). De cellen die negatief zijn voor CD45, CD31 en ASGPR1 zijn gated. Deze populatie omvat de progenitorcellen en kunnen worden gegroepeerd op basis van hun gp38 en CD133 expressie (Figuur 2a). De GP38 + CD133 + en de GP38 - CD133 + cellen vertegenwoordigen de meest voorkomende celpopulaties onder CD45 - CD31 - ASGPR1 - cellen in de gezonde volwassen muis livER (figuur 2a, b). Deze subsets verschillen in de expressie van bijkomende oppervlaktemerkers eerder geassocieerd met progenitorcellen, zoals EpCAM, Sca-1 en CD34 (Figuur 2c).
Progenitorcellen kunnen worden uitgeput van hematopoietische en parenchymale cellen zoals hepatocyten en lever sinusoïdale endotheelcellen (LSECs) (figuren 1 en 3) en stamcellen kunnen verder worden gezuiverd met magnetische microbead gebaseerde isolatie (figuur 3a, b) of hoge zuiverheidsgraad sorteren (figuren 1 en 4). De magneetkopmiddelen microbead gebaseerde scheiding van CD133 + of gp38 + cellen resulteert in meer dan 90% zuiverheid (figuur 3a, b) met betrekking tot eventuele contaminerende CD45, CD31 of ASGPR1 + cellen, en de cellen blijven zeer levensvatbaar (Figuur 3a, b).
2. Dit is vooral relevant voor de keuze van enzymmengsel gebruikt voor weefsel dissociatie. Hier, collagenase P plaats van collagenase D werd gebruikt voor de lever 1, 2, 8. Belangrijk werd de expressie van CD133 op progenitorcellen en de opbrengst van geïsoleerde celpopulaties sterk verminderd in aanwezigheid van collagenase D (figuur 5a, b). Daarnaast, onze bevatte dispase, die zeer geschikt is voor zachte disaggregatie en subcultuur van verschillende celtypes 13. Collagenase P met dispase vertegenwoordigteen ideale combinatie voor cel dissociatie van de lever voor voorlopercel analyse. Deze combinatie was ook superieur aan trypsine en pronase gebaseerd digestie van de lever (gegevens niet getoond). Het is even belangrijk op te merken dat de dichtheid centrifugeren, zoals Percoll-gebaseerde verrijking 2, 14, niet noodzakelijk was voor de stamvader analyses die in dit protocol.
Figuur 1: Workflow van de beschreven protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Nieuwe indeling van de lever progenitor subsets. Een eencelligesuspensie werd bereid uit gezonde levers en vervolgens gekleurd met een panel van oppervlakte markers: CD45, CD31, CD133 en gp38 (A). Voor dode cel uitsluiting, propidiumjodide (PI) werd gebruikt. Representatieve dot plots met de gating strategie zijn afgebeeld. De poorten worden gebruikt voor flowcytometrie celgetal bepaling worden ook gemarkeerd. (B) De percentages en het absolute aantal aanwezige cellen per g leverweefsel van de verschillende stromale cel subsets van de CD45-negatieve cellen in wildtype behandelde dieren worden getoond. (C) De histogrammen tonen onderscheidende marker kenmerken van stromale cel subsets in een gezonde lever. Hoge expressie van CD90.2 en de aanwezigheid van CD157 specifiek voor A, terwijl CD34 specifiek is voor subpopulatie B. Sca-1 aanwezig in B, C, D en EpCAM is alleen aanwezig in populatie C en D. gemiddelde ± SEM; de data (AC) vertegenwoordigen 2-3 onafhankelijke experimenten met n = 3-4 per experiment. De gegevens were vergeleken met behulp van een ongepaarde, tweezijdige T-test * P <0,05, ** p <0,005, *** P <0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Magnetic-microbead gebaseerde verrijking en geautomatiseerde cel zuivering. (A) Magnetische-microbead gebaseerde verrijking van CD45 -, CD31 - en ASGPR1 - cellen worden afgebeeld voor en na verrijking. (B) Representatieve dot plots van de geautomatiseerde microbead gebaseerde cel isolaties worden afgeschilderd voor CD133 + en GP38 + cellen, aan de linkerkant. Rechts, de levensvatbaarheid van de celpopulaties voor en na verrijking worden weergegeven als het percentagepropidiumjodide (PI) -negatieve cellen. Mean ± SEM; Gegevens (AB) te vertegenwoordigen 3 onafhankelijke experimenten met n = 3 per experiment. De gegevens werden vergeleken onder toepassing van een ongepaarde, tweezijdige t-toets * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Flowcytometrie soort voorlopercellen deelverzamelingen met een hoge zuiverheid. Dot plots tonen de zuiverheid van de celpopulaties in de gesorteerde monsters (na sorteren). De gegevens stellen 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
= "1"> 
Figuur 5: Vergelijking van verteringsenzymen. De enkele-celsuspensie werd bereid met collagenase P (zie stap 2) of collagenase D (1 mg / ml + DNase-I 0,1 mg / ml) uit gezonde levers en werd vervolgens gekleurd met een panel van oppervlakte markers: CD45, CD31, CD133 en gp38 (A). De percentages van cellen die aanwezig zijn per g leverweefsel van de verschillende stromale cel subsets van de CD45-negatieve cellen in wildtype behandelde dieren worden getoond. (B) De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van CD133 afgebeeld voor CD133 + celpopulatie. Mean ± SEM; Gegevens (AB) te vertegenwoordigen 2 onafhankelijke experimenten met n = 3 per experiment. De gegevens werden vergeleken onder toepassing van een ongepaarde, tweezijdige t-toets * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,0001.target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leverontsteking en schade van verschillende oorsprong leiden regeneratieve processen in de lever die gepaard gaan met progenitorcelexpansie en activering 2, 3. Deze progenitorcellen bezitten stamcel kenmerken en waarschijnlijk een belangrijke rol bij het ontrafelen voor verschillende leverziekten spelen.
De heterogeniteit van leverprogenitorcellen is al lang gesuggereerd. De herbeoordeling van de lever voorlopercellen subsets met behulp van een nieuw oppervlak marker combinatie van CD133 en GP38 subgroepen die verschillende oppervlakte markers dragen kon identificeren en express een unieke set van ontsteking-gerelateerde genen tijdens leverschade 12. De hier beschreven methode maakt het directe flowcytometrie analyse van abnormale cellen en hun directe vergelijking in verschillende modellen leverschade. Dit is vooral van belang, aangezien diverse verwondingen leiden tot de activering van meerdere voorlopercellen subsets dat een afspiegeling is van de cellulaire heterogeniteit waargenomen in reacties ductulaire 3, 4, 11, 12 kunnen zijn. Met name een kleine fractie van muizen leverweefsel (0,2 g) voldoende om voldoende cellen te isoleren voor flowcytometrie analyse van voorlopercellen met de beschreven werkwijze.
Flowcytometrie sorteren verstrekken van hoge zuiverheid populaties van de subsets is noodzakelijk om hun unieke genexpressieprofielen te verkennen. Eerdere rapporten beschreven flowcytometrie op basis van voorlopercellen cel isolatie 15, 16. Toch is de hier gepresenteerde protocol biedt een geoptimaliseerde methode die de hoge zuiverheid en de levensvatbaarheid van deze cellen garandeert. Met name kan in vitro kweken en uitbreiden eerder beschreven technieken goed worden gecombineerd met de hier gepresenteerde protocol 15
Veel soorten flowcytometrie sorteerders zijn verkrijgbaar bij de verschillende instellingen en hun specifieke instrumentaties kan enigszins variëren. Niettemin de algemene beginselen voor celsortering worden in de beschreven protocol. In het algemeen een lagere druk en grotere spuitmond absoluut noodzakelijk, onafhankelijk van het type en de specificaties machine. Bovendien kan het gebruik van een geschikt medium sorteren significante toename van de vitaliteit en het RNA kwaliteit van de gesorteerde cellen, wat een belangrijke factor is, met name voor genexpressie studies. Het sorteren van progenitorcellen echter vermindert cellevensvatbaarheid en de opbrengst aan cellen na sortering relatief laag (voor zeer zuivere soort 7-10,000 events / subpopulatie, 4-5 gezonde levers moeten worden samengevoegd). Dit kan een beperkende factor voor verdere in vitro analyses worden. Wij stellen voor magnetische-microbead basis van isolatie invitro testen, vanwege de hogere opbrengst en levensvatbaarheid van de cellen, en flowcytometrie sorteren voor genexpressie analyse, met name wanneer meer bepaalde subgroep analyses en isolaties nodig.
Gebaseerd op het feit dat de levensvatbaarheid van cellen aanzienlijk is verminderd na stromingscytometrie sortering is een geautomatiseerde magnetische microbead gebaseerde isolatie van progenitorcellen ontwikkeld en hier gepresenteerd. Het zorgt voor het isoleren van een groter aantal progenitorcellen met hoge zuiverheid (het combineren van meerdere levers). Verder wordt de levensvatbaarheid van de cellen gehandhaafd, aangezien de tijd die voor de isolatiewerkwijze sterk wordt verminderd. Terwijl lagere aantallen stamcellen kan worden uitgebreid in vitro 1, 2, 15, 16, is het raadzaam na te gaan hoe deze in vitro manipulaties de cellulaire kenmerken van de stam / Progen kunnen veranderenitor cellen beschreven voor andere mesenchymale en stromale celpopulaties 17, 18.
De belangrijkste beperking van het aangeboden magnetische microbead gebaseerde isolatie dat de CD133 + en gp38 + celpopulaties vertegenwoordigen heterogene cellen. Aanvullende oppervlaktemerkers kan nodig kleinere celpopulaties identificeren.
Het begrip van hoe de lever stamcellen en voorlopers tot elkaar verhouden is verre van compleet, ondanks de uitstekende studies door Lola Reid en anderen 1, 8, 19. Zo kunnen de zorgvuldige afweging van technieken resulteert in hogere opbrengsten en levensvatbaarheid, zoals de hier voorgestelde bijdragen tot de analyse van progenitor subsets en het begrip van hun onderling gerelateerde verlengen.
Over het algemeen hebben we beschreven thij gedetailleerde isolatie en analyse van de lever progenitor subsets die onlangs werden onderscheiden 12. Bovendien kan door toepassing van een nieuwe enzymcombinatie, zeldzame progenitors kunnen worden geanalyseerd door directe doorstroomcytometrie gemeten. Bovendien, het protocol laat zien hoe stamcellen te verrijken met een hoge zuiverheid, met behulp van celsortering of een geautomatiseerde microbead gebaseerde techniek.
Probleemoplossen:
De percentages van celafval en stervende cellen high
Indien tijdens digestie (stap 2), het pipetteren van de lever monsters te hard, het percentage stervende cellen in de enkelvoudige celsuspensie toeneemt. Als de lever in grote stukken gesneden dan voorgesteld, de spijsvertering minder efficiënt en resulteert in meer celdood tijdens de bereiding.
Na de procedure van stap 5, de zuiverheid van de monsters onvoldoende
Indien de percentages van celafval en stervende cellen in de enkelvoudige celsuspensie werd bereid in stap 2 te hoog zijn, de microkralen aspecifiek binden, en derhalve is de zuiverheid van de isolatie sterk verminderd.
Laag aantal cellen na-microbead gebaseerd zuivering
Voor het welslagen van de beschreven protocol, is het belangrijk dat de verhouding van cellen microkralen optimaal, zoals in het protocol. Gebruik kunnen maken microkralen vermindert de zuiverheid en vermindert de opbrengst en levensvatbaarheid van de geïsoleerde cellen. Als er andere dan die welke in het protocol oppervlaktemarkers worden gebruikt voor voorlopercellen deelverzameling afzondering moet de optimale verhouding van cellen microkralen bepalen.
Magnetische microbead gebaseerd isolatie van GP38 + CD133 - bevolking
Volg de stappen in hoofdstuk 5. In stap 5.3 toe te voegen bovendien 10 pi anti-CD133 + microbolletjes, volg dan stappen 5, 6.2 en 6.3 als beschrijvend.
Het berekenen van absolute celaantallen
Het gewicht lever wordt gebruikt om te berekenen hoeveel cellen van een bepaalde subgroep aanwezig per gram leverweefsel zijn.
(% Van de subpopulatie in levende cellen (op basis van flowcytometrie) / 100) x totale bewoonbare aantal cellen geïsoleerd uit de lever stuk = Z
(1 / gewicht van de lever stuk) x Z = aantal cellen / g leverweefsel
Andere celpopulaties die kunnen worden geïsoleerd met deze werkwijze
Het is mogelijk om de volgende levercellen gebruik van dit protocol digestie isoleert: CD45 + cellen (of subpopulaties van hematopoietische cellen, zoals Kupffer-cellen, dendritische cellen, T-cellen, NK-cellen, enzovoort) en LSECs. De vertering protocol is niet geschikt voor isolatie van hepatocyten of hepatische stellaatcellen. Deze cellen aanwezig zijn bij relatief lage aantal cellen en tonen verminderde levensvatbaarheid vergeleken met allemaal verschillendr beschikbare methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Alexander von Humboldt Stichting Sofja Kovalevskaja Award uit aan VLK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
- Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
- Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
- Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
- Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
- Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
- Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
- Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
- Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
- Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
- Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
- Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
- Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
- Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
- Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).
