Summary
lesioni al fegato sono accompagnate da espansione di cellule progenitrici che rappresenta una popolazione cellulare eterogenea. Classificazione Novel di questo compartimento cellulare consente di distintivo più sottoinsiemi. Il metodo qui descritto illustra l'analisi citofluorimetrica ed elevato isolamento purezza vari sottogruppi che possono essere utilizzati per ulteriori analisi.
Abstract
Durante lesioni croniche del fegato, cellule progenitrici espandono in un processo chiamato reazione duttulare, che comporta anche la comparsa di infiltrato cellulare infiammatorio e l'attivazione delle cellule epiteliali. La popolazione di cellule progenitrici durante tali reazioni infiammatorie è stato per lo più studiata utilizzando marcatori di superficie singoli, sia per l'analisi istologica o con tecniche di citometria a base di flusso. Tuttavia, nuovi marcatori di superficie identificati vari sottoinsiemi funzionalmente distinte all'interno del progenitore di fegato / stelo vano cella. Il metodo presentato qui descrive l'isolamento e il flusso dettagliata analisi di citometria di sottoinsiemi progenitrici utilizzando combinazioni marcatori romanzo di superficie. Inoltre, dimostra come i vari sottogruppi di cellule progenitrici possono essere isolati con metodi di elevata purezza con modalità automatizzate magnetico e FACS ordinamento-based. Importante, novel ed enzimatica semplificato dissociazione del fegato consente l'isolamento di queste popolazioni cellulari rare con un'alta redditivitàche è superiore rispetto ad altri metodi esistenti. Questo è particolarmente rilevante per studiare ulteriormente cellule progenitrici in vitro o per isolare l'RNA di alta qualità per analizzare il profilo di espressione genica.
Introduction
la rigenerazione del fegato è principalmente associato con la capacità di auto-rinnovamento degli epatociti. Tuttavia, le lesioni croniche del fegato si verificano con l'attivazione delle cellule progenitrici e di espansione, che sono stati associati con la loro capacità di differenziarsi in epatociti e colangiociti 1, 2, 3, 4. Questo è particolarmente rilevante in quanto, durante lesioni croniche, epatociti proliferazione non è efficace. Nonostante diversi studi di tracciabilità genetica di targeting cellule progenitrici, il loro ruolo nella rigenerazione del fegato rimane controverso 5, 6, 7, 8. Inoltre, l'attivazione delle cellule progenitrici è stato collegato ad un aumento della risposta fibrotica nel fegato, che solleva domande sul loro ruolo esatto durante lesioni 9, 10.
La natura eterogenea del compartimento di cellule progenitrici è stato a lungo suggerito da studi di espressione genica che isolate cellule progenitrici che esprimono un unico marcatore di superficie utilizzando microdissezione o cella metodi basati su di smistamento 1, 11. Infatti, di recente, una nuova combinazione marcatore superficie con gp38 (podoplanin) inequivocabilmente legata precedenti marcatori singoli di cellule progenitrici di vari sottoinsiemi 12. È importante sottolineare che questi sottoinsiemi non solo differivano nella loro espressione marcatore di superficie, ma anche esposte le alterazioni funzionali durante ferite 12.
Molteplici modelli animali sono stati utilizzati per studiare l'attivazione delle cellule progenitrici e la rigenerazione del fegato. Sembra che i vari tipi di lesioni promuovere l'attivazione di diversi sottoinsiemi di cellule progenitrici 12. Questo potrebbe spiegare il phdivergenza enotypic della reazione duttulare osservato negli esseri umani 4. Così, i complessi fenotipiche e funzionali analisi di cellule progenitrici sono fondamentali per comprendere il loro ruolo nella infortuni e il vero significato della reazione duttulare in malattie del fegato.
Oltre combinazioni marcatore di superficie, le differenze cruciali nei protocolli isolamento delle cellule complicano ulteriormente le conclusioni sulla base di studi precedenti 2. Una notevole quantità di studi affrontato il ruolo delle cellule progenitrici che notevolmente differiscono per il protocollo di isolamento (ad esempio, dissociazione fegato (combinazione enzima e durata del processo), media densità, e la velocità di centrifugazione) 2. Una tecnica di isolamento ottimizzato, fornendo una migliore sopravvivenza per le popolazioni di cellule rare e riflessivo della composizione sottoinsieme, è stato sviluppato e pubblicato di recente 12. Lo scopo di questo articolo è di fornire una più detprotocollo soffriva esattamente di questa procedura di isolamento delle cellule del fegato e il sottoinsieme di analisi per consentire la corretta riproduzione della tecnica. Inoltre, il protocollo include un confronto con il metodo di isolamento precedente per dimostrare le differenze rispetto al nuovo protocollo.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state condotte con l'approvazione dei comitati di etica e cura degli animali di Homburg University Medical Center.
1. Preparazione dei Materiali e tamponi
- Appena preparare tutti i buffer necessari per la digestione fegato utilizzando componenti sterili e una cappa laminare per evitare la contaminazione batterica.
- Preparare il tampone di raccolta (CB) mescolando 49,5 ml di terreno RPMI e 0,5 ml di siero bovino fetale (FBS, bassa endotossina, inattivati al calore) per ottenere una soluzione all'1% (v / v). Conservare la soluzione in ghiaccio fino a nuovo uso.
NOTA: Circa 25 ml di CB è necessario per digerire un fegato intero. - Preparare il tampone di digestione (DB) utilizzando i seguenti ingredienti: terreno RPMI, 1% (v / v) di FBS (basso endotossina, inattivato con il calore), collagenasi P (0,2 mg / mL), DNase-I (0,1 mg / ml) e dispasi (0,8 mg / mL).
NOTA: Circa 25 ml di DB è necessario per digerire un fegato intero. Pre-riscaldare il DB in tlui 37 ° C bagnomaria prima dell'uso. - Ricostituire gli enzimi all'arrivo in soluzione salina bilanciata Hanks '(HBSS; collagense P e dispasi) o in DNasi-I Buffer (50% (v / v) glicerolo, 1 mM MgCl 2, e 20 mm Tris-HCl, pH 7,5) , aliquote, e conservarlo a -20 ° C. Conservare il DNase-I tampone a 4 ° C ed utilizzare entro due mesi.
2. Preparazione di fegato cella singola sospensione
- Euthanize topi wild-type non trattati da dislocazione cervicale in conformità con l'etica locali e dei comitati per la cura degli animali.
- Mettere i topi su una tavola di dissezione e bagnare il pelo con il 70% di etanolo. Utilizzando le forbici, aprire l'addome con una incisione mediana della pelle, seguita da un Y incisione verso gli arti. Aprire il peritoneo fino allo sterno usando le forbici. Al fine di scoprire il fegato, l'intestino spostare delicatamente sul lato destro usando un tampone di cotone.
- Con l'aiuto di forbici e pinze, rimuovere i lobi del fegato,lasciando la cistifellea dietro, e evitare la contaminazione con il tessuto connettivo. Pesare il fegato e posizionarlo sul ghiaccio in una capsula di Petri contenente HBSS.
- Posizionare i lobi del fegato su un piatto a secco di Petri e tagliare il tessuto epatico a cubetti omogenee circa 2 mm a lato utilizzando un bisturi. Trasferire i pezzi in un tubo da centrifuga conica da 15 ml.
- Aggiungere 2,5 ml di DB nella provetta conica da centrifuga da 15 mL contenente i pezzi fegato e trasferirla in un bagno di acqua a 37 ° C per avviare il processo di digestione (un fegato sano prende 60-70 min e un fegato cirrotico prende 80-90 min ).
NOTA: Se una intera fegato viene digerito, il fegato deve essere separato in due provette da 15 ml conica centrifuga per assicurare una buona vitalità cellulare. - Preparare un nuovo tubo conico da centrifuga da 15 ml per raccogliere le cellule del fegato rilasciati. Inserire una poliammide maglia filtrante 100 micron sulla parte superiore del tubo e bagnare la maglia con 800 microlitri di CB. Posizionare il tubo da centrifuga conica sul ghiaccio.
- Mescolare il samples nel bagno d'acqua 37 ° C dopo 5 e 10 minuti al fine di sostenere il processo di digestione agitando la provetta conica da centrifuga da 15 mL contenente i pezzi fegato.
- 15 min dopo l'inizio la digestione, mescolare delicatamente i pezzi di fegato utilizzando una pipetta da 1.000 ml con una punta di taglio che permette i pezzi di fegato di passare attraverso facilmente. Posizionare i tubi di nuovo nel bagno di acqua e lasciare i pezzi di accontentarsi di 2 min.
- Rimuovere il surnatante contenente le cellule disseminate (tipicamente 2x 700 ml) e aggiungerlo al tubo preparato al punto 2.6. Sostituire il surnatante rimosso con DB (2x 700 ml) e metterlo di nuovo in bagno d'acqua a 37 ° C.
- Ripetere la procedura descritta al punto 2.8 (tipicamente a 30, 40, 50, 55 e 60 min) fino a circa 60-70 min hanno trascorso dall'inizio della digestione. Da 40 min in poi, i pezzi di fegato rimanenti dovrebbero essere abbastanza piccole da passare attraverso un non tagliato 1.000 microlitri punta della pipetta.
NOTA: fegato sano è Digested completamente entro 60-70 minuti, mentre il fegato fibrotico deve di solito 80-90 min. A questo punto di tempo, il tessuto epatico non dovrebbe essere visibile nella conico provetta da centrifuga da 15 ml contenente i pezzi di fegato, e tutte le cellule rilasciati dovrebbe essere trasferito nel tubo preparato al punto 2.6. - Al termine del processo di digestione, raccogliere le cellule e centrifugare per 8 minuti a 180 xg e 4 ° C (con accelerazione ridotta / 4 e decelerazione / 2).
- Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di ammonio-cloruro di potassio (ACK) tampone di lisi e incubare per 1 min a temperatura ambiente per lisare i globuli rossi. Arrestare la reazione aggiungendo 5 ml di CB, e centrifugare le cellule per 8 minuti a 180 xg e 4 ° C (con accelerazione ridotta / 4 e decelerazione / 2). Risospendere le cellule in 4 ml di CB e memorizzarli sul ghiaccio. Contare le cellule, come descritto al punto 3.
NOTA: Il pellet cellulare è allentato, e quindi il surnatante viene pipettato distanza invece di essere travasato.3. Determinazione del Cell Count citometria a flusso
NOTA: Per determinare i conteggi delle cellule, un contatore di cellule automatizzato o, idealmente, la quantificazione delle cellule citometria a base di flusso descritto di seguito si suggerisce invece che il metodo della camera a base classica Neubauer. La sospensione del fegato cella singola descritto al punto 2 contiene cellule parenchimali e non parenchimali (NPC) con dimensioni molto diverse e granularità. La corretta esclusione di detriti cellulari insieme alla-on gating scatter in avanti, side scatter (FSC SSC) caratteristico della NPC quando citometria a flusso garantisce il successo del protocollo descritto 12.
- Preparare una aliquota della sospensione di cellule del fegato (20 ml) e aggiungere 174 ml di PBS (PBS) e 6 ml di ioduro di propidio (PI; concentrazione finale 0,375 mg / ml). Aggiungere il conteggio sfere che consentono la quantificazione delle cellule.
- Gate SSC-A-FSC-A per evitare i detriti ed escludere ulteriori doppiette con FSC-H e FCS-A.
NOTA: E 'importante seguire la strategia di gating illustrato nella figura 2. - Porta fuori le cellule morte della PI-positivo, misurano 30 microlitri dai vostri campioni, e registrare gli eventi. Seguire linee guida del produttore per calcolare il numero di celle.
NOTA: Seguire i passaggi 4 per citometria a flusso misura, punti 5 e 6 per l'isolamento di cellule progenitrici a base magnetica, e passaggi da 7 per citometria a flusso sorta di sottopopolazioni progenitrici.
4. La colorazione della cella singola sospensione del fegato per la Fow analisi di citometria Progenitor sottoinsiemi
Anticorpo Clone Host / Isotipo Della Concentrazione [mg / ml] Diluizione CD64 X54-5 / 7.1 IgG1 di topo, κ 0.5 1: 100 CD16 / 32 93 Rat IgG2a, λ 0.5 1: 100 CD45 30-F11 Rat IgG2b, κ 0.2 1: 200 CD31 MEC13.3 Rat IgG2a, κ 0.5 1: 200 ASGPR1 Policlonale di capra IgG 0.2 1: 100 Podoplanin 1/8/2001 Criceto siriano IgG 0.2 1: 1.400 Podoplanin 1/8/2001 Criceto siriano IgG 0.5 1: 1.400 CD133 Mb9-3G8 IgG1 Rat 0.03 3 ml CD133 315-2C11 Rat IgG2A, λ 0.5 1: 100 CD34 RAM34 Rat IgG2a, κ 0.5 1: 100 CD90.2 53-2,1 Rat IgG2, κ 0.5 1: 800 CD157 BP-3 Mouse IgG2b, κ 0.2 1: 600 EpCAM G8.8 Rat IgG2a, κ 0.2 1: 100 Sca-1 D7 Rat IgG2a, κ 0.03 10 microlitri Mouse IgG2b, κ MPC-11 0.2 IgG1 Rat RTK2071 0.2 Rat IgG2b, κ RTK4530 0.2 Rat IgG2a, κ RTK2758 0.5 Rat IgG2a, κ RTK2758 0.2 Criceto siriano IgG SHG-1 0.2 Criceto siriano IgG SHG-1 0.5 Controllo di capra IgG Normale Policlonale di capra IgG 1 Donkey anti-IgG di capra Donkey IgG 2 1: 800 streptavidina 1 1: 400 Tabella 1.
Anticorpo 1 2 3 4 5 CD45 APC / Cy7 Rat IgG2b, κ
0,5 ml+ + + + CD31 biotina + Rat IgG2a, κ
0,5 ml+ + + ASGPR1 purificato + + Controllo di capra IgG Normale
0,2 ml+ + Podoplanin APC + + + Criceto siriano IgG
1 ml di una diluizione 1:14+ CD133 PE + + </ Td> + + IgG1 Rat
0,45 mlDonkey anti-capra
Alexa Fluor 488+ + + + + streptavidina
Alexa Fluor 405+ + + + + Tavolo 2.
- Inserire una aliquota della sospensione cellulare dal passo 2.11 in un tubo di reazione (1,5 mL) contenente 2,5 x 10 5 cellule, determinato come descritto nel passaggio 3.
- Centrifugare le cellule per 3 min a 300 xg e 4 ° C usando una microcentrifuga.
NOTA: A questo punto, una pompa a vuoto può essere utilizzata per rimuovere con attenzione il surnatante. - Risospendere il pellet cellulare in mix Fc-blocco e incubare per 5 minuti in ghiaccio. Preparare mix Fc-blocco con un volume totale di 50 microlitri per macchia. Aggiungere 10 microlitri di reagente FCR-bloccante, 1 ml di purificato anti-CD64 (1: 100; 0,5 mg / macchia), e 40 ml di tampone colorazione (ST buffer: HBSS, 1% (v / v) di FBS, e 0,01% azide di sodio) per macchia.
NOTA: Il sodio azide è altamente tossico. Utilizzare dispositivi di protezione adeguati, come ad esempio guanti di nitrile, un camice da laboratorio, e una maschera. - Aggiungere 50 ml di colorazione mix alle cellule (il volume totale di cellule è ora 100 ml) e incubare le cellule con la miscela anticorpale, protette dalla luce e per 20 min in ghiaccio.
- Preparare la miscela anticorpale con un volume totale di 50 microlitri per macchia. Per 50 ml di ST tampone, aggiungere i seguenti anticorpi coniugati per la colorazione di base: CD45 (0,5 microlitri; 1: 200; 0.1 mg / macchia), CD31 (0,5 microlitri; 1: 200; 0,25 mg / macchia), ASGPR1 (1 ml ; 1: 100; 0,2 mg / macchia), podoplanin (1 ml di una diluizione 1,14; diluizione 1: 1.400 fine; 0,014 mg / macchia), e CD133 (3 ml; 0,09 mg / macchia).
NOTA: Tabella1 riassume i cloni di anticorpi e diluizioni utilizzate per le macchie di base e per i marcatori di superficie supplementari dei vari sottoinsiemi. Preparare sospensioni cellulari supplementari per la miscela anticorpale contenente i comandi isotipo corrispondenti e / o fluorescenza meno uno controlli (QOR), come illustrato nella Tabella 2. - Aggiungere 400 ml di tampone ST per ogni campione e centrifugare le cellule per 4 min a 300 xg e 4 ° C.Discard il surnatante e risospendere le cellule in 100 ml di miscela anticorpo secondario contenente 0,125 ml di asino anti-IgG di capra (1: 800; 0,25 mg / macchia) e 0,25 ml di streptavidina fluorescente coniugato (1: 400; 0,25 mg / macchia) in 100 ml di tampone ST.
- Incubare le cellule mentre protettivo dalla luce e con la miscela di anticorpi per 20 min in ghiaccio. Aggiungere 400 ml di ST buffer per ogni campione e centrifugare le cellule per 4 min a 300 xg e 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 300 ml di ST appassionatoer contenente 0,25 mg PI / mL.
NOTA: La vitalità cellulare delle cellule progenitrici diminuisce con il tempo; Pertanto, si suggerisce di misurare campioni freschi appena possibile.
5. magnetico arricchimento microperla a base di cellule progenitrici
- Trasferire un'aliquota della sospensione fegato singola cella contenente 1,5-2 x 10 6 cellule, sulla base del numero di celle determinato come descritto nel passaggio 3, in un nuovo tubo conico da centrifuga da 15 ml.
- Centrifugare le cellule per 8 minuti a 180 xg e 4 ° C (usando ridotta accelerazione / 4 e decelerazione / 2).
NOTA: in genere, un sano / 6 fegato di topo C57Bl (o 1 g di tessuto epatico) dovrà essere suddiviso in tre da 15 ml conica provetta. - Risospendere le cellule in 400 ml di HBSS 0,5% (v / v) di albumina sierica bovina (BSA) e aggiungere 40 ml di microsfere anti-CD31-e 30 ml di microsfere anti-CD45. Incubare le cellule per 15 minuti a 4 ° C.
NOTA: Non superare tha Incubazione, come la purezza della separazione sarà notevolmente ridotto. - Aggiungere 5 ml di HBSS 0,5% (v / v) BSA alle cellule e centrifugare per 8 minuti a 180 xg e 4 ° C (con accelerazione ridotta / 4 e decelerazione / 2).
- Risospendere il pellet cellulare in 100 ml di morti perline di rimozione delle cellule e incubare a temperatura ambiente per 15 min. Nel frattempo, preparare una colonna di separazione LS e calibrare con 3 mL di HBSS 0,5% (v / v) BSA.
NOTA: Non superare il tempo di incubazione, la purezza della separazione sarà notevolmente ridotto. - Aggiungere 900 ml di HBSS 0,5% (v / v) BSA alle cellule, filtrata utilizzando 100 micron filtro a rete in poliammide, e caricarli sulla colonna di separazione LS.
NOTA: Caricare un intero fegato su una colonna di separazione LS. - Lavare la colonna tre volte con 3 ml di HBSS 0,5% (v / v) BSA e raccogliere il flusso passante.
- Centrifugare il flusso passante per 8 minuti a 180 xg e 4 ° C (con ridotta accecome repentine / 4 e decelerazione / 2).
- Risospendere il pellet cellulare sia in risciacquo tampone (RB) (PBS e 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)) contenente 0,5% (v / v) BSA o di tampone ST, a seconda del procedimento ulteriormente sperimentale.
A base di microperla 6. magnetica automatizzata delle cellule progenitrici Purificazione di sottopopolazioni cellulari combinato da fegati più
NOTA: Dal momento che i sottoinsiemi di cellule progenitrici rappresentano popolazioni di cellule rare, le cellule che conciliano da più fegato è spesso necessario per raggiungere il numero di cellule sufficiente per ulteriori esperimenti. Come esempio, CD133 + e gp38 + separazione cellulare è descritta sotto.
- Isolamento di CD133 + progenitori
- Dopo il punto 5.9, contare le cellule, come descritto al punto 3, e sospendere nuovamente fino a 10 6 cellule (tipicamente pooling 4-6 campioni di fegato sani) in 100 ml di RB.
- Aggiungere anti-CD64 1: 100 e anti-CD16 / 32 1: 100 alle cellule e incubli mangiava in ghiaccio per 5 min. Aggiungere 1: 100 contro CD133-anticorpo biotinilato alle cellule e incubare su ghiaccio per ulteriori 10 min.
- Aggiungere 5 ml di RB e centrifugare per 8 minuti a 180 xg e 4 ° C (con riduzione di accelerazione / decelerazione 4 e / 2).
- Risospendere le cellule in 400 ml di RB e aggiungere 10 ml di microsfere anti-biotina. Incubare il campione per 15 minuti a 4 ° C. Non superare il tempo di incubazione, in quanto ciò riduce la purezza dei campioni.
- Aggiungere 5 ml di RB e centrifugare per 8 minuti a 180 xg e 4 ° C (con riduzione di accelerazione / decelerazione 4 e / 2). Risospendere il pellet in 1 ml di RB.
- Isolamento di gp38 + progenitori
- Dopo il punto 5.9, contare le cellule, come descritto al punto 3, e sospendere nuovamente fino a 10 6 cellule (tipicamente pooling 4-6 campioni di fegato sani) in 100 ml di RB.
- Aggiungere anti-CD64 1: 100 e anti-CD16 / 32 1: 100 per le cellule e incubare in ghiaccio per 5 min. Successivamente, aggiungere 1:100 contro gp38 biotinilato anticorpi alle cellule e incubare su ghiaccio per ulteriori 10 min.
- Aggiungere 5 ml di RB e centrifugare per 8 minuti a 180 xg e 4 ° C (con riduzione di accelerazione / decelerazione 4 e / 2).
- Risospendere le cellule in 400 ml di RB e aggiungere 5 ml di microsfere anti-biotina. Incubare il campione per 15 minuti a 4 ° C. Non superare il tempo di incubazione, in quanto ciò riduce la purezza dei campioni.
- Aggiungere 5 ml di RB e centrifugare per 8 minuti a 180 xg e 4 ° C (con riduzione di accelerazione / decelerazione 4 e / 2).
- Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di RB.
- passaggi comune dopo passo 6.1 o 6.2
- Posizionare il tubo conico da centrifuga da 15 mL contenente le sospensioni di cellule marcate magneticamente su un freddo 5 rastrelliera con due tubi vuoti aggiuntivi per la raccolta delle frazioni positive e negative. Inserire la griglia freddo sulla piattaforma di separazione del separatore.
- Utilizzare il programma di selezione positiva(Possel_d2) con una vasta fase di lavaggio tra ciascun campione (opzione di risciacquo).
NOTA: Usando basata su colonne separazione manuale delle cellule al posto del separatore automatico ridurrà la purezza del campione. - Raccogliere la frazione positiva e centrifugare per 8 minuti a 180 xg e 4 ° C (con accelerazione ridotta / 4 e decelerazione / 2).
- Risospendere il pellet cellulare sia in RB o buffer di ST, a seconda del procedimento ulteriormente sperimentale.
- Per un controllo della purezza, prendere una aliquota di cellule e macchiare come descritto al punto 4.
7. Citometria a Flusso di separazione delle cellule
NOTA: una elevata purezza sorta di ogni sottoinsieme di cellule progenitrici potrebbe essere raggiunto con il protocollo descritto di seguito. La resa complessiva delle cellule è molto inferiore a quello descritto nel passaggio 6 ed è migliore per l'analisi di espressione genica.
Parametro Ambientazione Dimensioni ugello 85 micron Frequenza 46,00-46,20 Ampiezza 38,30-55,20 Fase 0 goccia di ritardo 28,68-28,84 Attenuazione via Prima goccia 284 - 297 obiettivo Gap 9.-14 Pressione 45 psi Tabella 3.
- Acquisire le cellule dalla arricchimento magnetico-based (descritto al punto 5); contarli, come descritto al punto 3; e li macchiare per i marcatori progenitrici (CD133, gp38), CD31, CD45 e ASGPR1, come spiegato al punto 4.
- Preparare medio di smistamento (SM): fenolo-rosso libera DulbecModified medio di co Eagle (DMEM) contenente 0,5% (v / v) BSA e 0,01% (v / v) di sodio azide. Risospendere le cellule colorate in SM, trasferirli in una provetta a fondo tondo in polipropilene, e disporli sul ghiaccio.
NOTA: Il sodio azide è altamente tossico. Utilizzare dispositivi di protezione adeguati, come ad esempio guanti di nitrile, un camice da laboratorio, e una maschera. Non utilizzare sodio azide se vengono utilizzate le cellule ordinati per test funzionali. - Utilizzare il software appropriato per il tipo di selezionatrice utilizzato per l'isolamento delle cellule. Aprire il software e seguire le istruzioni del produttore per impostare i parametri di ordinamento e le specifiche della macchina.
NOTA: Le specifiche della macchina sono riassunti nella Tabella 3. Mentre specifiche macchine potrebbero essere differenti a varie istituzioni, è importante notare che la riduzione della pressione di ordinamento e un ugello più grande è necessaria (45 psi e l'ugello 85 micron) per aumentare la vitalità delle cellule progenitrici populationi e la qualità del RNA preparato da cellule filtrate. E 'importante utilizzare cellule progenitrici epatiche arricchito per l'impostazione della compensazione. Altre popolazioni fegato o leucociti hanno diverse auto-fluorescenza e risultato in una risoluzione non ottimale della popolazione stromale e in una strategia di gating falso. - Calibrare la macchina e mettere a 5 ml in polipropilene tubo a fondo rotondo contenente 350 ml di SM nel dispositivo di raccolta sorta. Avviare l'acquisizione dei campioni e ordinare. Raccogliere 1.000 eventi della sottopopolazione e fermare il flusso del campione.
- Prendere il tubo dal dispositivo di smistamento e misurare le cellule ordinati sul citofluorimetro. Identificare la percentuale della popolazione cellulare ordinato presente tra le cellule viventi. Questa percentuale dà la purezza delle cellule ordinati.
- Se sorta di purezza superiore al 95%, posto a 5 ml in polipropilene tubo a fondo rotondo contenente 350 ml di tampone di lisi RLT nel dispositivo di raccolta sorta.
- Avviare il tipo e raccogliere 7,000-10.000 eventi al stromale sottopopolazione.
- Trasferire il tampone di lisi RLT contenente le cellule ordinati in un tubo di reazione DNase- e RNase-free e conservare i campioni a -80 ° C fino ad ulteriore analisi.
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Representative Results
La procedura qui presentata per la digestione del fegato utilizzando una nuova miscela di enzimi risultati in una cella singola sospensione contenente parenchimali e le cellule epatiche non parenchimali (Figure 1 e 2a). Dopo l'ACK-lisi dei globuli rossi, il flusso diretto analisi di citometria di cella singola sospensione è possibile (figure 1 e 2). La strategia di gating comporta l'esclusione di doppietti e cellule morte (Figura 2a). Le cellule che sono negativi per CD45, CD31, e ASGPR1 sono gated. Questa popolazione include le cellule progenitrici epatiche e possono essere raggruppati in base alla loro gp38 ed espressione CD133 (Figura 2a). I gp38 + CD133 + e la gp38 - cellule CD133 + rappresentano le popolazioni più abbondanti di cellule tra CD45 - CD31 - ASGPR1 - cellule del sano liv topo adultoer (Figura 2a, b). Questi sottoinsiemi differiscono nell'espressione di marcatori superficiali aggiuntivi precedentemente associati con le cellule progenitrici, come EpCAM, Sca-1 e CD34 (figura 2c).
Cellule progenitrici potrebbero essere scompaiono dalle cellule ematopoietiche e parenchimali, quali epatociti e fegato sinusoidale cellule endoteliali (LSECs) (figure 1 e 3), e cellule progenitrici potrebbero essere ulteriormente purificato con magnetica isolamento microsfere a base (figura 3a, b) o con elevata purezza classificare (figure 1 e 4). L'isolamento magnetico microperla a base di gp38 cellule + risultati CD133 + o in più del 90% di purezza (Figura 3a, b) per quanto riguarda eventuali cellule contaminanti CD45, CD31, o ASGPR1 +, e le cellule rimangono altamente vitali (Figura 3a, b).
2 cellulare. Questo è particolarmente rilevante per la scelta della miscela enzimatica utilizzata per la dissociazione dei tessuti. Qui, collagenasi P invece di collagenasi D è stato utilizzato per il fegato 1, 2, 8. È importante sottolineare che il livello di espressione di CD133 sulle cellule progenitrici e la resa di popolazioni di cellule isolate sono stati notevolmente ridotti in presenza di collagenasi D (figura 5a, b). In aggiunta a questo, la nostra miscela conteneva dispasi, che è particolarmente adatto per disaggregazione dolce e subcoltura di vari tipi cellulari 13. Collagenasi P insieme a dispasi rappresentauna combinazione ideale per la dissociazione delle cellule del fegato per l'analisi di cellule progenitrici. Questa combinazione è stata anche superiore alla tripsina o digestione pronase basata del fegato (dati non mostrati). È altrettanto importante notare che centrifugazione densità, quali l'arricchimento Percoll a base 2, 14, non era necessario per il progenitore analisi presentate in questo protocollo.
Figura 1: Workflow del protocollo descritto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: classificazione Romanzo di sottoinsiemi progenitrici epatiche. Una cella singolasospensione è stata preparata da fegati sani e successivamente trattata con un pannello di marcatori di superficie: CD45, CD31, CD133 e gp38 (A). Per esclusione cellule morte, ioduro di propidio (PI) è stato utilizzato. dot plots rappresentativi con la strategia di gating sono raffigurati. Le porte utilizzate per la citometria a flusso determinazione conta delle cellule sono anche marcate. (B) Le percentuali e il numero assoluto di cellule presenti per g di tessuto epatico dei vari sottogruppi di cellule stromali tra le cellule CD45-negative in wild-type animali non trattati sono mostrate. (C) Gli istogrammi mostrano caratteristiche distintive di marcatori sottoinsiemi di cellule stromali in un fegato sano. Alta espressione CD90.2 e la presenza di CD157 sono specifiche per A, mentre CD34 è specifico per sottopopolazione B. Sca-1 è presente in B, C, D e EpCAM è presente solo nella frazione C e D. media ± SEM; i dati (AC) rappresentano 2-3 esperimenti indipendenti con n = 3-4 per esperimento. La wer datie confrontato con un spaiato, a due code T test * P <0.05, ** p <0,005, *** p <0,0001. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Magnetic arricchimento microbead basata e purificazione delle cellule automatizzato. (A) Magnetic arricchimento microsfere a base di CD45 -, CD31 - e ASGPR1 - cellule sono raffigurati prima e dopo arricchimento. (B) rappresentativi dot plots delle isolamenti cellulari microsfere a base automatizzati sono raffigurati per CD133 + e le cellule gp38 +, a sinistra. Sulla destra, la vitalità delle popolazioni di cellule prima e dopo arricchimento sono mostrati come la percentuale diioduro di propidio (PI) cellule -negative. Media ± SEM; i dati (AB) rappresentano 3 esperimenti indipendenti con n = 3 per esperimento. I dati sono stati confrontati con un spaiato, a due code T test * P <0.05, ** p <0,005, *** p <0,0001. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: citometria a flusso sorta di sottoinsiemi progenitrici con elevata purezza. trame Dot raffigurano la purezza delle popolazioni di cellule nei campioni ordinati (post-Sort). I dati rappresentano 3 esperimenti indipendenti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 5: Confronto di enzimi digestivi. La sospensione monocellulare è stata preparata usando collagenasi P (come descritto nel passaggio 2) o collagenasi D (1 mg / mL + DNase-I 0,1 mg / mL) da fegati sani ed è stata successivamente trattata con un pannello di marcatori di superficie: CD45, CD31, CD133, e gp38 (A). Sono mostrati Le percentuali di cellule presenti per g di tessuto epatico dei vari sottogruppi di cellule stromali tra le cellule CD45-negative in wild-type animali non trattati. (B) L'intensità di fluorescenza mediana di CD133 è raffigurata per la popolazione di cellule CD133 +. Media ± SEM; i dati (AB) rappresentano 2 esperimenti indipendenti con n = 3 per esperimento. I dati sono stati confrontati con un spaiato, a due code T test * P <0.05, ** p <0,005, *** p <0,0001.target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Infiammazione del fegato e lesioni di diversa origine innescano processi rigenerativi del fegato che sono accompagnati da espansione di cellule progenitrici e l'attivazione 2, 3. Queste cellule progenitrici epatiche possiedono staminali caratteristiche cellulari e probabilmente svolgono un ruolo significativo nel meccanismo patogenetico di varie malattie del fegato.
L'eterogeneità delle cellule progenitrici epatiche è stato a lungo suggerito. La rivalutazione di sottoinsiemi progenitrici epatiche utilizzando una nuova combinazione marcatore di superficie di CD133 e gp38 potrebbe identificare sottogruppi che portano diversi marcatori di superficie e di esprimere un unico set di geni infiammatori legati durante danno epatico 12. Il metodo qui descritto consente il flusso diretto analisi di citometria di cellule rare e il loro confronto diretto in vari modelli danno epatico. Questo è particolarmente rilevante, come varie lesioni innescano l'attivazione di molteplici progenitore subsets che potrebbero essere riflettente della eterogeneità cellulare osservata nelle reazioni duttulare 3, 4, 11, 12. In particolare, una piccola frazione di tessuto epatico murino (0,2 g) è sufficiente per isolare cellule sufficiente per l'analisi citofluorimetrica dei progenitori utilizzando il metodo descritto.
La citometria a flusso di smistamento fornendo popolazioni ad alta purezza dei sottoinsiemi è necessario esplorare i loro profili di espressione genica unici. Relazioni precedenti flusso descritto citometria a base di isolamento di cellule progenitrici 15, 16. Tuttavia, il protocollo qui presentato fornisce un metodo ottimizzato che assicura l'elevata purezza e vitalità di queste cellule. In particolare, in vitro coltura e di ampliamento delle tecniche descritte in precedenza possono essere ben combinati con il protocollo presentato qui 15
Molti tipi di citometria a flusso selezionatori sono disponibili presso varie istituzioni, e le loro strumentazioni particolari potrebbero essere leggermente diverse. Tuttavia, i principi generali di separazione delle cellule sono presentate nel protocollo descritto. Generalmente, una pressione inferiore e dimensioni ugello più grande sono assolutamente necessarie, indipendente dai tipi di macchine e specifiche. Inoltre, l'utilizzazione di un mezzo di ordinamento appropriata può aumentare significativamente l'efficienza e la qualità dell'RNA delle cellule ordinati, che è un fattore importante, in particolare per studi di espressione genica. L'ordinamento delle cellule progenitrici, tuttavia, riduce notevolmente la vitalità delle cellule, e la resa delle cellule dopo l'ordinamento è relativamente bassa (per elevata purezza sorta di 7-10,000 eventi / sottopopolazione, 4-5 fegati sani hanno bisogno di essere messe in comune). Questo potrebbe essere un fattore limitante per un'ulteriore analisi in vitro. Vi consigliamo di isolamento microperla a base magnetica per avitro, a causa della sua elevata resa e la vitalità delle cellule, e citometria a flusso ordinamento per analisi di espressione genica, soprattutto quando più sottoinsieme specificato analizza e sono necessari isolamenti.
Sulla base del fatto che la vitalità delle cellule è notevolmente ridotto dopo citometria a flusso classificare, un isolamento microsfere a base magnetica automatizzata delle cellule progenitrici è stato sviluppato e presentato qui. Esso consente l'isolamento di un numero maggiore di cellule progenitrici con elevata purezza (combinazione di molteplici fegati). Inoltre, la vitalità delle cellule è mantenuta, in quanto il tempo necessario per il processo di isolamento è notevolmente ridotto. Mentre i numeri più bassi di cellule progenitrici possono essere espansi in vitro 1, 2, 15, 16, si raccomanda di considerare come questi vitro manipolazioni nei potrebbero alterare le caratteristiche cellulari di staminali / Progenito rag cellule descritte per le altre mesenchimali e cellule stromali popolazioni 17, 18.
La maggiore limitazione della isolamento microperla a base magnetica presentato è che il CD133 + e le popolazioni gp38 + cellulari rappresentano cellule eterogenee. Ulteriori marcatori di superficie potrebbero essere necessarie per identificare popolazioni di cellule più piccole.
La comprensione di come le cellule staminali epatiche e cellule progenitrici in relazione tra loro è lungi dall'essere completa, nonostante le eccellenti studi di Lola Reid e altri 1, 8, 19. Così, l'attento esame delle tecniche comportino rese elevate e vitalità, come quello qui suggerito, potrebbe contribuire ad estendere le analisi dei sottoinsiemi progenitrici e la comprensione delle loro relazioni interconnesse.
t Nel complesso, abbiamo descrittoha dettagliato l'isolamento e l'analisi dei sottoinsiemi progenitrici epatiche che sono stati recentemente distinti 12. Inoltre, utilizzando una combinazione di enzimi romanzo, progenitori rari potrebbero essere analizzati da misure dirette citometria di flusso. Inoltre, il protocollo dimostra come arricchire cellule progenitrici con un elevato grado di purezza, utilizzando l'ordinamento delle cellule o una tecnica automatizzata microperla-based.
Risoluzione dei problemi:
Le percentuali di detriti cellulari e delle cellule morenti sono alti
Se, durante la digestione (fase 2), il pipettamento dei campioni di fegato è troppo duro, la percentuale di cellule morte nei sospensione aumenta unicellulari. Se il fegato è tagliato in pezzi di diametro superiore suggerito, la digestione è meno efficiente e risultati in piu morte cellulare durante la preparazione.
Dopo aver completato la procedura descritta al punto 5, la purezza dei campioni non è sufficiente
Se le percentaggi di detriti cellulari e cellule morenti nella cella singola sospensione previste al punto 2 sono troppo alti, le microsfere legano aspecifico, e quindi, la purezza del isolamento è notevolmente ridotto.
numero di cellulare a basso dopo la purificazione a base di microsfere
Per il successo del protocollo descritto, è importante che il rapporto delle cellule di microsfere è ottimale, come suggerito nel protocollo. Utilizzando più microsfere riduce la purezza e diminuisce la resa e la vitalità delle cellule isolate. Se si utilizzano marcatori di superficie diverse da quelle presentate nel protocollo per l'isolamento progenitore sottoinsieme, il rapporto ottimale di cellule per microsfere deve essere determinata.
Isolamento magnetico microperla base di gp38 + CD133 - Popolazione
Seguire i passaggi nella sezione 5. Nel passo 5.3 aggiungere in aggiunta 10 microlitri anti-CD133 + microsfere, quindi seguire i punti 5, 6.2 e 6.3 come descrittod.
Calcolando il numero di cellule assoluti
Il peso del fegato viene utilizzato per calcolare il numero di cellule di un determinato sottoinsieme sono presenti per tessuto epatico grammo.
(% Della sottopopolazione di cellule viventi (sulla base di citometria a flusso) / 100) x numero totale cellula vivente isolato dal pezzo di fegato = Z
(1 / peso del pezzo di fegato) x Z = numero di cellule / g tessuto epatico
Altre popolazioni di cellule che possono essere isolate con questo metodo
E 'possibile isolare le seguenti cellule del fegato che utilizzano questo protocollo digestione: cellule CD45 + (o sottopopolazioni di cellule ematopoietiche, ad esempio, cellule di Kupffer, cellule dendritiche, cellule T, cellule NK, ecc) e LSECs. Il protocollo digestione non è adatto per l'isolamento di epatociti o cellule stellate epatiche. Queste cellule sono presenti in numero di cellule relativamente basse e mostrano ridotta vitalità rispetto al Other metodi disponibili.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Alexander von Humboldt Sofja Kovalevskaja premio per VLK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
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