Summary
פציעות כבדות מלוות הרחבת תא ובתאים מייצגים אוכלוסייה הטרוגנית תא. סיווג רומן של תא הסלולר זה מאפשר הבחנה של תת מרובים. השיטה המתוארת כאן ממחישה את הזרימה cytometry ניתוח ובידוד טוהר גבוה של תת שונים שיכול לשמש מבחנים נוספים.
Abstract
במהלך פציעות כבדות כרוניות, ובתאים להרחיב בתהליך הנקרא תגובת ductular, אשר כרוך גם ההופעה חודר לתוך הסלולר דלקתי הפעלה תא אפיתל. אוכלוסיית התאים ובתאים במהלך תגובות דלקתיות כגון בעיקר נחקרה באמצעות סמני משטח אחד, בין אם על ידי ניתוח היסטולוגית או על ידי זרימת טכניקות cytometry מבוסס. עם זאת, סמני משטח רומן זיהו שונה תת ברורים מבחינה תפקודית בתוך ובתאים הכבדים / גזע תא תא. השיטה המוצגת כאן מתארת את הבידוד זרימת מפורט cytometry ניתוח של תת ובתאים באמצעות שילובים סמן משטח הרומן. יתר על כן, הוא מדגים כיצד תת תאים ובתאים השונים יכול להיות מבודד עם טוהר גבוה באמצעות אוטומטיות מגנט FACS שיטות מיון מבוסס. חשוב לציין, הרומן דיסוציאציה האנזימטית פשוטה של הכבד מאפשר בידוד של אוכלוסיות תאים נדירות אלה עם כדאיות גבוההכי עדיף בהשוואה לשיטות קיימות אחרות. זה רלוונטי במיוחד ללימוד נוסף ובתאים במבחנה או לבידוד RNA באיכות גבוהה לנתח את פרופיל ביטוי גנים.
Introduction
התחדשות כבדה מזוהית בעיקר עם קיבולת החידוש העצמי של hepatocytes. עם זאת, פציעות כבדות כרוניות להתרחש עם הפעלת תא אב והתרחבות, אשר נקשרו עם יכולת להתמיין hepatocytes ו cholangiocytes 1, 2, 3, 4. זה רלוונטי במיוחד כי, במהלך פציעות כרוניות, התפשטות hepatocyte אינה יעילה. למרות מחקרי מעקב גנטי מיקוד מרובים ובתאים, תפקידם ההתחדשות כבדה נשאר שנוי במחלוקת 5, 6, 7, 8. יתר על כן, ההפעלה ובתאים נקשרה בתגובת fibrotic גדלה בכבד, מה שמעלה שאלות לגבי תפקידם המדויק במהלך פציעות 9, 10.
האופי ההטרוגני של תא תא האב הוצע ארוך על ידי מחקרי התבטאות גנים מבודדים ובתאים להביע סמן משטח יחיד באמצעות microdissection או מיון תא מבוסס שיטות 1, 11. ואכן, לאחרונה, שילוב סמן משטח רומן באמצעות gp38 (podoplanin) מקושר באופן חד משמע סמנים יחידים קודמים של ובתאים כדי תת שונה 12. חשוב לציין, תת אלה לא היו שונים רק הביטוי סמן פני השטח שלהם, אלא גם הציג שינויים תפקודיים במהלך פציעות 12.
במודלים של בעלי חיים מרובים כבר נוצל כדי לחקור הפעלת תא אב והתחדשות כבדה. נראה כי סוגי הפציעה השונים לקדם את ההפעלה שונה תת קבוצות של ובתאים 12. זה עשוי להסביר את phהבדלי enotypic תגובת ductular שנצפתה אצל בני אדם 4. לפיכך, פנוטיפי מורכבים והניתוחים תפקודיים של ובתאים הם מרכזיים להבין את תפקידם פציעות ואת המשמעות האמיתית של תגובת ductular במחלות כבדות.
מלבד שילובים סמן משטח, ההבדלים המכריעים פרוטוקולי בידוד תא לסבך עוד יותר את המסקנות בהתבסס על מחקרים קודמים 2. חלק גדול ממאגרי נפט המחקרים התייחסו התפקיד של ובתאים כי שונים מאוד בפרוטוקול בידודם (למשל, דיסוציאציה הכבד (שילוב אנזים ומשך התהליך), בינוני צפיפות, ומהירות צנטריפוגה) 2. טכניקת בידוד אופטימיזציה, מתן כדאיות טובה יותר עבור אוכלוסיות תאים נדירות ומהורהרת של רכב משנה, פותחה ופורסמה 12 לאחרונה. מטרת מאמר זה היא לספק יותר detפרוטוקול שמציק של הליך בידוד תא הכבד הזה ואת ניתוח המשנה כדי לאפשר הרבייה הנכונה של הטכניקה. בנוסף, הפרוטוקול כולל השוואה עם שיטת הבידוד הקודמת המצביעים על ההבדלים לעומת הפרוטוקול החדש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוצדורות בוצעו באישור של אתיקה ועדות לטיפול בבעלי חיים של המרכז הרפואי האוניברסיטאי Homburg.
1. הכנת חומרים חוצצים
- טרי להכין את כל המאגרים הנדרש לעיכול כבד באמצעות רכיבים סטרילית במנדף למינרית כדי למנוע זיהום חיידקים.
- הכן את החיץ אוסף (CB) על ידי ערבוב 49.5 מ"ל של מדיום RPMI ו -0.5 מ"ל של סרום שור העובר (FBS; רעלן פנימי נמוך, חום מומת) כדי להשיג פתרון 1% (v / v). אחסן את הפתרון על הקרח עד לשימוש נוסף.
הערה: כ 25 מיליליטר של CB יש צורך לעכל כבד אחת שלם. - הכן את החיץ העיכול (DB) באמצעות המרכיבים הבאים: בינוני RPMI, 1% (v / v) FBS (רעלן פנימי נמוך, חום מומת), P collagenase (0.2 מ"ג / מ"ל), DNase-I (0.1 מ"ג / מ"ל) , ו dispase (0.8 מ"ג / מ"ל).
הערה: כ 25 מיליליטר של DB יש צורך לעכל כבד אחת שלם. טרום לחמם את DB ב tהוא באמבט מים 37 ° C לפני השימוש. - לשקם את האנזימים עם הגעתם תמיסת מלח מאוזנת "הנקס (HBSS; collagense P ו dispase) או ב DNase-לי חיץ (50% (v / v) גליצרול, 1 מ"מ MgCl 2, ו -20 מ"מ טריס-HCl; pH 7.5) , aliquot אותו, ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס. אחסן את DNase-לי חיץ על 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בו בתוך חודשיים.
2. הכנת השעית תא בודד כבדה
- להרדים עכברי-בר מטופל על ידי נקע בצוואר רחם בהתאם האתיקה המקומית ועדות לטיפול בבעלי החיים.
- מניחים את העכברים על קרש החיתוך להרטיב את הפרווה עם אתנול 70%. בעזרת מספריים, לפתוח את הבטן עם חתך קו האמצע של העור, ואחריו חתך Y-לקראת הגפיים. פתח את הצפק עד עצם החזה באמצעות מספריים. על מנת לחשוף את הכבד, לעקור את המעי בעדינות לצד ימין באמצעות מקלון צמר גפן.
- בעזרת מספרי מלקחיים, להסיר את האונה של הכבד,עוזב את כיס המרה מאחור, למנוע זיהום עם רקמת חיבור. לשקול את הכבד ומניחים אותו על קרח בצלחת פטרי המכילות HBSS.
- מניח את האונה של הכבד על צלחת פטרי יבשה וחתך את רקמת הכבד לקוביות הומוגנית כ -2 מ"מ צד באמצעות אזמל. מעבירים את חתיכות לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל קונית.
- להוסיף 2.5 מיליליטר של DB אל צינור צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר המכיל את החתיכות הכבדות ומניח אותו באמבט מים 37 ° C כדי להתחיל את תהליך העיכול (כבד בריא לוקח 60-70 דקות כבדות שחמת לוקח 80-90 דקות ).
הערה: אם הכבד כולו אחד הוא מתעכל, הכבד צריך להיות מופרד לשני 15 מיליליטר חרוטי צינורות צנטריפוגות כדי להבטיח כדאיויות תא טובות. - הכין צינור צנטריפוגות חרוטים חדש 15 מיליליטר לאסוף תאים כבדים שוחררו. מניח רשת מסנן 100 מיקרומטר פוליאמיד על החלק העליון של הצינור להרטיב את הרשת עם 800 μL של CB. מניח את צינור צנטריפוגות חרוטים על קרח.
- מערבבים את סםPles באמבט מים 37 ° C לאחר 5 ו -10 דקות כדי לתמוך בתהליך העיכול על ידי טלטול צינור צנטריפוגות חרוטי 15 מ"ל המכיל את חתיכות הכבד.
- 15 דקות לאחר תחילת העיכול, לערבב בעדינות את החתיכות הכבדות בעזרת פיפטה 1,000 μL עם קצה לחתוך המאפשר חתיכות הכבדות לעבור בקלות. מניחים את הצינורות בחזרה לתוך אמבט מים ולאפשר את החלקים להסתפק 2 דקות.
- הסר את supernatant המכיל את התאים המופץ (בדרך כלל 2x 700 μL) ולהוסיף אותו אל הצינור מוכן בשלב 2.6. החזר את supernatant להסיר עם DB (2x 700 μL) ולמקם אותו בחזרה לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- חזור על התהליך מתואר בשלב 2.8 (בדרך כלל 30, 40, 50, 55, ו -60 דקות) עד כ 60-70 דקות חלפו מאז תחילת העיכול. מ 40 דק 'ואילך, החתיכות הכבדות הנותרים צריכות להיות קטנות מספיק כדי לעבור דרך קצה פיפטה נימול 1,000-μL.
הערה: כבד בריא הוא DIGEsted מלא בתוך 60-70 דקות, בעוד כבד fibrotic בדרך כלל צריך 80-90 דקות. לפי זה נקודת זמן, רקמת הכבד לא צריכה להיות גלויה בצינור 15 מיליליטר צנטריפוגות החרוטים המכילים את החתיכות הכבדות, וכל התאים שוחררו יועברו לתוך הצינור המוכן בשלב 2.6. - בסוף תהליך העיכול, לאסוף את התאים צנטריפוגות עליהן במשך 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת האצה / 4 האטה / 2).
- Resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל של אשלגן אמוניום כלוריד (ACK) תמוגה חיץ דגירה זה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר כדי lyse את כדוריות הדם האדומות. עצור את התגובה על ידי הוספת 5 מ"ל של CB, ולאחר מכן צנטריפוגות התאים למשך 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת האצה / 4 האטה / 2). Resuspend התאים 4 מ"ל של CB ולאחסן אותם על הקרח. ספירת התאים, כמתואר בשלב 3.
הערה: תא גלולה רופף, ולכן supernatant הוא pipetted משם במקום להיות יצק.3. קביעה של ספירת כדוריות שימוש cytometry הזרימה
הערה: לקביעת ספירת התאי, דלפק תא אוטומטי או, באופן אידיאלי, זרימת cytometry מבוססת כימות התא המתואר להלן הוא הציעה במקום השיטה הקאמרית מבוסס נויבאואר הקלסית. השעית התא בודד כבד כמתואר בשלב 2 מכילה parenchymal ותאי הלא parenchymal (NPC) עם בגדלים שונים באופן משמעותי רמות פירוט. ההדרה התקינה של פסולת הסלולר יחד עם gating-על פיזור קדימה, פיזור צד (FSC-SSC) המאפיין של NPCs בעת שימוש cytometry זרימה מבטיחה את ההצלחה של הפרוטוקול המתואר 12.
- הכן aliquot של השעיה תא הכבד (20 μL) ולהוסיף 174 μL של בופר פוספט (PBS) ו -6 μL של יוד propidium (PI; ריכוז בסוף 0.375 מיקרוגרם / מ"ל). להוסיף חרוזים לספור המאפשרים כימות של תאים.
- שער על SSC-A-FSC-A כדי למנוע פסולת נוספת לכלול כפילויות באמצעות FSC-H ו FCS-A.
הערה: חשוב לעקוב אחרי האסטרטגיה gating מתואר באיור 2. - שער את התאים המתים PI-חיובי, למדוד 30 μL ממדגמים שלך, ולהקליט את האירועים. פעל על פי ההנחיות של היצרן כדי לחשב את ספירת תאי.
הערה: בצע את שלבי 4 עבור זרימת cytometry מדידה, שלבי 5 ו -6 עבור בידוד תא מגנטי מבוסס אב, ודורך 7 עבור זרימת cytometry מעין תת-אוכלוסיות אב.
4. מכתים של ההשעיה תא בודד הכבד לניתוח Cytometry Fow של קבוצות משנה ובתאים
נוֹגְדָן Clone מארח / אלוטיפ ריכוז המניות [מ"ג / מ"ל] מְהִילָה CD64 X54-5 / 7.1 עכבר IgG1, κ 0.5 1: 100 CD16 / 32 93 עכברוש IgG2a, λ 0.5 1: 100 CD45 30-F11 עכברוש IgG2b, κ 0.2 1: 200 CD31 MEC13.3 עכברוש IgG2a, κ 0.5 1: 200 ASGPR1 Polyclonal עיזים IgG 0.2 1: 100 Podoplanin 2001/01/08 אוגר סורי IgG 0.2 1: 1,400 Podoplanin 2001/01/08 אוגר סורי IgG 0.5 1: 1,400 CD133 Mb9-3G8 IgG1 עכברוש 0.03 3 μL CD133 315-2C11 איג עכברושG2a, λ 0.5 1: 100 CD34 RAM34 עכברוש IgG2a, κ 0.5 1: 100 CD90.2 53-2,1 עכברוש IgG2, κ 0.5 1: 800 CD157 BP-3 עכבר IgG2b, κ 0.2 1: 600 EpCAM G8.8 עכברוש IgG2a, κ 0.2 1: 100 SCA-1 D7 עכברוש IgG2a, κ 0.03 10 μL עכבר IgG2b, κ MPC-11 0.2 IgG1 עכברוש RTK2071 0.2 עכברוש IgG2b, κ RTK4530 0.2 עכברוש IgG2a, κ RTK2758 0.5 עכברוש IgG2a, κ RTK2758 0.2 אוגר סורי IgG SHG-1 0.2 אוגר סורי IgG SHG-1 0.5 בקרת עיזים IgG רגילה Polyclonal עיזים IgG 1 IgG אנטי עיזים וחמורים דונקי IgG 2 1: 800 streptavidin 1 1: 400 שולחן 1.
נוֹגְדָן 1 2 3 4 5 CD45 APC / Cy7 עכברוש IgG2b, κ
0.5 μL+ + + + CD31 ביוטין + עכברוש IgG2a, κ
0.5 μL+ + + ASGPR1 מטוהרים + + בקרת עיזים IgG רגילה
0.2 μL+ + Podoplanin APC + + + אוגר סורי IgG
1 μL של דילול 01:14+ PE CD133 + + </ Td> + + IgG1 עכברוש
0.45 μLאנטי-עיזים וחמורים
אלקסה פלואוריד 488+ + + + + streptavidin
אלקסה פלואוריד 405+ + + + + שולחן 2.
- הוסף aliquot של השעיה התא משלב 2.11 לתוך צינור התגובה (1.5 מ"ל) המכיל 2.5 x 10 5 תאים, נקבע כמתואר בשלב 3.
- צנטריפוגה התאים 3 דקות ב 300 XG ו -4 מעלות צלזיוס באמצעות microcentrifuge.
הערה: בשלב זה, משאבת ואקום יכולה להיות מנוצלת כדי להסיר את supernatant בזהירות. - Resuspend התא גלולה בתמהיל Fc-בלוק דגירה זה במשך 5 דקות על הקרח. הכינו תערובת Fc-בלוק בהיקף כולל של 50 μL לכל כתם. הוסף 10 μL של מגיב FCR-חסימה, 1 μL של אנטי CD64 מטוהרים (1: 100; 0.5 מיקרוגרם / כתם), ו -40 μL של חיץ מכתים (חיץ ST: HBSS, 1% (v / v) FBS, ו 0.01% אזיד הנתרן) לכל כתם.
הערה: אזיד הנתרן היא רעילה ביותר. יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים, כגון כפפות ניטריל, מעיל מעבדה, מסיכת פנים. - הוסף 50 μL של מכתים לערבב לתאים (הנפח הכולל של התאים הוא כעת 100 μL) ו דגירה התאים עם תערובת נוגדנים, מוגן מפני אור במשך 20 דקות על הקרח.
- מכינים את תערובת נוגדנים בהיקף כולל של 50 μL לכל כתם. במשך 50 μL של ST חיץ, מוסיפים את נוגדנים מצומדות הבאים מכתים בסיסיים: CD45 (0.5 μL; 1: 200; 0.1 מיקרוגרם / כתם), CD31 (0.5 μL; 1: 200; 0.25 מיקרוגרם / כתם), ASGPR1 (1 μL ; 1: 100; 0.2 מיקרוגרם / כתם), podoplanin (1 μL של דילול 1:14; 1: דילול סוף 1400; 0.014 מיקרוגרם / כתם), ו CD133 (3 μL; 0.09 מיקרוגרם / כתם).
הערה: טבלה1 מסכם את שיבוטי דילולי נוגדן מנוצלים עבור כתמים בסיסיים עבור סמני משטח נוספים של תת השונה. כן השעיות תא נוספים עבור לערבב נוגדן המכיל בקרות אלוטיפ המקביל ו / או קרינה מינוס אחד שולט (FMOs), כפי שהוא מתואר בטבלה 2. - להוסיף 400 μL של ST חיץ לדגום כל בצנטריפוגה תאים עבור 4 דקות ב 300 XG ו -4 ° C.Discard supernatant ו resuspend התאים 100 μL של תערובת נוגדנים משני המכיל 0.125 μL של IgG נגד עז חמור (1: 800; 0.25 מיקרוגרם / כתם) ו -0.25 μL של streptavidin ניאון מצומדות (1: 400; 0.25 מיקרוגרם / כתם) ב 100 μL של חיץ ST.
- דגירת התאים בעוד מוגן מפני אור ועם תמהיל הנוגדן עבור 20 דקות על קרח. להוסיף 400 μL של ST חיץ לדגום כל בצנטריפוגה תאים עבור 4 דקות ב 300 XG ו -4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant ו resuspend התאים 300 μL של חובב STאה המכיל 0.25 מיקרוגרם / מ"ל לצרכן.
הערה: כדאיות התא של ובתאים פוחתת עם הזמן; ולכן, הוא הציע למדוד דגימות טריות בהקדם האפשרי.
5. עשרת Microbead מבוסס מגנטיים של ובתאים
- העבר aliquot של השעית תא בודד כבד המכיל 1.5-2 x 10 6 תאים, המבוססים על ספירת התאים נקבעה כמתואר בשלב 3, לתוך צינור צנטריפוגות חרוטים חדש של 15 מיליליטר.
- צנטריפוגה התאים במשך 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת האצה / 4 האטה / 2).
הערה: בדרך כלל, C57Bl בריא אחד / 6 כבד עכבר (או 1 גרם של רקמת כבד) יהיה צורך לחלק לשלושה צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר קונית. - Resuspend התאים 400 μL של 0.5% HBSS (v / v) אלבומין בסרום שור (BSA) ולהוסיף 40 μL של microbeads אנטי CD31 ו -30 μL של microbeads אנטי CD45. דגירת התאים במשך 15 דקות ב 4 ° C.
הערה: אין לעבור tהוא זמן הדגירה, כמו טוהר ההפרדה יופחת באופן משמעותי. - הוסף 5 מ"ל של HBSS 0.5% (v / v) BSA אל התאים צנטריפוגות עליהן במשך 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת האצה / 4 האטה / 2).
- Resuspend התא גלולה ב 100 μL של חרוזים להסרת תאים מתים דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. בינתיים, להכין עמודה ההפרדה LS ולכייל אותו עם 3 מ"ל של 0.5% HBSS (v / v) BSA.
הערה: אין לעבור על זמן הדגירה, כמו טוהר ההפרדה יופחת באופן משמעותי. - להוסיף 900 μL של HBSS 0.5% (v / v) BSA לתאים, לסנן אותם באמצעות רשת מסנן פוליאמיד 100 מיקרומטר, ומעלה אותם על עמודת הפרדת LS.
הערה: טען אחד הכבד כולו על עמודת הפרדת LS אחד. - לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 3 מ"ל של HBSS 0.5% (v / v) BSA לאסוף את הזרימה דרך.
- צנטריפוגה זרימה דרך עבור 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות acce מופחתleration / 4 האטה / 2).
- Resuspend התא גלולה או בשטיפת חיץ (RB) (PBS ו 2 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA)) המכיל 0.5% (v / v) BSA או חיץ ST, בהתאם ההליך ניסויים נוספים.
6. מגנטי טיהור Cell Microbead מבוסס האוטומטית של קבוצות משנה תא אב בשילוב מ כבדי מרובים
הערה: מאחר תת תא האב מייצגים אוכלוסיות תאים נדירות, תאים משלבים בין כבד מרובים נדרש לעתים קרובות כדי להשיג מספרים סלולריים מספיקים עבור ניסויים נוספים. כדוגמא, CD133 + ו- gp38 + הפרדת תא מתואר להלן.
- בידוד של אבות CD133 +
- לאחר שלב 5.9, לספור את התאים, כמתואר בשלב 3, ו resuspend עד 10 6 תאים (בדרך כלל איגום 4-6 דגימות כבדות בריאות) ב 100 μL של RB.
- להוסיף אנטי CD64 1: 100 ואנטי-CD16 / 32 1: 100 אל התאים incubאכלו אותם על קרח למשך 5 דקות. הוסף 1: 100 נוגדן biotinylated אנטי-CD133 לתאים דגירה אותם על קרח למשך 10 דקות נוספות.
- הוסף 5 מ"ל של RB צנטריפוגות במשך 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת האצה / 4 האטה / 2).
- Resuspend התאים 400 μL של RB ולהוסיף 10 μL של microbeads אנטי ביוטין. דגירה המדגם במשך 15 דקות ב 4 ° C.. אין לעבור על זמן הדגירה, כמו זה מקטין את הטוהר של הדגימות.
- הוסף 5 מ"ל של RB צנטריפוגות במשך 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת האצה / 4 האטה / 2). Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של RB.
- בידוד של gp38 + אבות
- לאחר שלב 5.9, לספור את התאים, כמתואר בשלב 3, ו resuspend עד 10 6 תאים (בדרך כלל איגום 4-6 דגימות כבדות בריאות) ב 100 μL של RB.
- להוסיף אנטי CD64 1: 100 ואנטי-CD16 / 32 1: 100 על תאי דגירה אותם על קרח למשך 5 דקות. לאחר מכן, להוסיף 1:100 אנטי-gp38 biotinylated נוגדנים לתאי דגירה אותם על קרח למשך 10 דקות נוספות.
- הוסף 5 מ"ל של RB צנטריפוגות במשך 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת האצה / 4 האטה / 2).
- Resuspend התאים 400 μL של RB ולהוסיף 5 μL של microbeads אנטי ביוטין. דגירה המדגם במשך 15 דקות ב 4 ° C.. אין לעבור על זמן הדגירה, כמו זה מקטין את הטוהר של הדגימות.
- הוסף 5 מ"ל של RB צנטריפוגות במשך 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת האצה / 4 האטה / 2).
- Resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל של RB.
- צעדים משותפים אחרי צעד 6.1 או 6.2
- מניח את צינור צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר המכיל השעיות התא המתויגות המגנטי על מדף צמרמורת 5 עם שני צינורות ריקים נוספים לאיסוף שברים החיוביים ושליליים. מניח את מתלת הצמרמורת בפלטפורמת הפרדת המפריד.
- השתמש בתכנית הסלקציה החיובית(Possel_d2) עם צעד כביסה נרחב בין כל (אפשרות שטיפה) מדגם.
הערה: שימוש הפרדה ידנית מבוסס עמודה של תאים במקום המפריד אוטומטית יפחית את הטוהר של המדגם. - אסוף את שבריר צנטריפוגות החיובי עבור 8 דקות ב 180 XG ו -4 ° C (באמצעות מופחת אצה / 4 האטה / 2).
- Resuspend התא גלולה או ב RB או חיץ ST, בהתאם ההליך ניסויים נוספים.
- לבדיקה טוהר, לקחת aliquot של תאים להכתים אותם כמתואר בשלב 4.
7. מיון תא cytometry הזרימה
הערה: מין טוהר גבוה של כל תת-קבוצה של תאי אב יכולה להיות מושג עם הפרוטוקול המתואר להלן. התשואה הכוללת של תאים היא נמוכה בהרבה מזה שמתואר בשלב 6 והוא טוב ביותר עבור ניתוח ביטוי גנים.
פָּרָמֶטֶר הגדרה גודל נחיר 85 מיקרומטר תדירות 46.00 - 46.20 אמפליטודה 38,30 - 55,20 שלב 0 זרוק עיכוב 28,68 - 28.84 הַדלָלָה כבוי ירידה ראשונה 284 - 297 גאפ יעד 9.-14 לַחַץ 45 psi טבלה 3.
- רוכשת תאים מן העשרה המגנטי מבוסס (כמתואר בשלב 5); לספור אותם, כמתואר בשלב 3; ו להכתים אותם סמנים אב (CD133, gp38), CD31, ASGPR1 ו CD45, כמוסבר בשלב 4.
- כן בינוני מיון (SM): אדום-פנול חינם Dulbecהנשר שונה של שיתוף של בינוני (DMEM) המכיל 0.5% (v / v) BSA ו 0.01% (v / v) אזיד הנתרן. Resuspend התאים מוכתם ב SM, ולהעביר אותם לתוך צינור פוליפרופילן מסביב לתחתית, ומניחים אותם על הקרח.
הערה: אזיד הנתרן היא רעילה ביותר. יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים, כגון כפפות ניטריל, מעיל מעבדה, מסיכת פנים. אין להשתמש יזיד הנתרן אם תאי ממוינים משמשים מבחנים תפקודיים. - השתמש בתוכנה המתאימה לסוג של סדרן המשמש בידוד התא. פתח את התוכנה ובצע את הוראות היצרן כדי להגדיר את הפרמטרים מיון ומפרטים המכונה.
הערה: המפרטים המכונית מסוכמים בטבלה 3. בעוד מפרטי המכונה יכולים להיות שונים במוסדות שונים, חשוב לציין כי הפחתת לחץ מיון בגודל פיה גדולה יותר יש צורך (45 psi זרבובית 85 מיקרומטר) כדי להגדיל את הכדאיות של תאים ובתאי populatיון ואת האיכות של רנ"א המוכן מן התאים הממוינים. חשוב להשתמש ובתאים כבדים מועשרים לקביעת הפיצוי. אוכלוסיות כבדות או לויקוציטים אחרות יש פלואורסצנציה אוטומטית ו תוצאה אחרת בהחלטה הכי מוצלחת של האוכלוסייה סטרומה באסטרטגית gating שווא. - כייל את המכשיר ומניחים צינור 5 מ"ל פוליפרופילן מסביב לתחתית המכיל 350 μL של SM במכשיר אוסף כזה. התחל רכישת מדגם ולמיין. אסוף 1,000 אירועים של תת-האוכלוסייה ולעצור את זרימת המדגם.
- קח את הצינור מתוך מכשיר המיון ולמדוד את התאים הממוינים על cytometer את הזרימה. זהה את אחוז אוכלוסיית תא המיון הנוכח בין תאי חיים. אחוז זה נותן את הטוהר של תאים ממוינים.
- אם טוהר מיין עולה 95%, להציב צינור מסביב לתחתית פוליפרופילן 5 מ"ל המכיל 350 μL של חיץ RLT תמוגה במכשיר אוסף כזה.
- התחל מהסוג ולאסוף 7,000-10,000 אירועים לכל תת-אוכלוסייה סטרומה.
- מעבירים את חיץ RLT תמוגה המכיל את התאים מסודרים בתוך שפופרת התגובה DNase- ו RNase ללא ולאחסן את דגימות ב -80 ° C עד לניתוח נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הנוהל שהוצג כאן לעיכול של הכבד באמצעות תערובת הרומן של תוצאות אנזימים בתוך ההשעיה תא בודד המכיל parenchymal ותאי הכבד הלא parenchymal (איורים 1 ו 2 א). לאחר ACK-lysing של כדוריות דם אדומות, הזרימה הישירה cytometry ניתוח של השעית התא היחיד אפשרי (איורים 1 ו -2). אסטרטגית gating כרוכה הדרת כפילויות ותאים מתים (איור 2 א). התאים כי הם שליליים עבור CD45, CD31, ו ASGPR1 הם מגודרים. אוכלוסייה זו כוללת תאי הכבד ובתאים ויכול להיות מקובצים על בסיס gp38 שלהם וביטוי CD133 (איור 2 א). Gp38 + CD133 + ואת gp38 - CD133 + תאים מייצגים אוכלוסיות התאים הנפוצות ביותר בקרב CD45 - CD31 - ASGPR1 - תאי ליב עכבר בוגר הבריא אה (איור 2 א, ב). תת אלה שונים בביטוי של סמנים משטח נוספים שהיו משוייכים ובתאים, כגון EpCAM, SCA-1, ו CD34 (איור 2 ג).
ובתאים יכול להיות מדולדל מתאי hematopoietic ו parenchymal, כגון hepatocytes ותאי האנדותל סינוסי הכבד (LSECs) (איורים 1 ו 3), ו ובתאים יכול להיות מטוהרים נוספת עם בידוד microbead מבוססי מגנטי (איור 3 א, ב) או עם טוהר גבוה מיון (איורים 1 ו -4). הבידוד מגנטי מבוססי microbead של CD133 + או gp38 + תוצאות תאים ביותר מ -90% טוהר (איור 3 א, ב) לגבי כל מזהם CD45, CD31, או ASGPR1 + תאים, התאים נשארים מאוד קיימא (איור 3 א, ב).
gether.within-page = "1"> המכשול העיקרי בביולוגיה של התא ובתאים הוא כי התאים המייצגים אוכלוסיות תאים נדירות, גם במקרה של דלקת. מצד השני, מגוון טכניקות בידוד הזמין יכול נבדל בהרכב ואת הכדאיות הסלולר של תאי כבד מבודדים 2. זה רלוונטי במיוחד עבור הבחירה של תערובת אנזים מנוצל עבור דיסוציאציה רקמות. הנה, collagenase P במקום collagenase D שימש הכבד 1, 2, 8. חשוב לציין, את רמת הביטוי של CD133 על ובתאים לבין התשואה של אוכלוסיות תאים מבודדים הופחתו באופן משמעותי בנוכחות collagenase D (איור 5 א, ב). בנוסף לכך, התערובת שלנו הכילה dispase, אשר מתאים מאוד עבור חלוקה עדינה subculturing של סוגי תאים שונים 13. Collagenase P יחד עם dispase מייצגשילוב אידיאלי עבור תא דיסוציאציה של הכבד לניתוח תא אב. שילוב זה היה גם מעולה טריפסין או עיכול מבוסס pronase של הכבד (מידע לא מוצג). זה חשוב לא פחות לציין כי צנטריפוגה צפיפות, כגון העשרה מבוססת Percoll 2, 14, לא היה נחוץ עבור האב ניתוחי שהוצג בפרוטוקול זה.
איור 1: Workflow של הפרוטוקול המתואר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: סיווג רומן של תת ובתאים בכבד. A-תא בודדהשעיה הוכנה מ כבד בריאים ובהמשך מוכתמת פנל של סמני משטח: CD45, CD31, CD133 ו gp38 (א). לקבלת הדרת תאים מתה, יודיד propidium (PI) נוצל. מגרשי נקודת נציג אחד עם אסטרטגית gating מתוארים. שערי המשמשים cytometry זרימת נחישות ספירת תאים גם מסומנים. האחוזים (ב ') המספר המוחלט של תאים הנמצאים לכל גרם של רקמת כבד של תת תאים השונים סטרומה בין תאי CD45 שלילי בחי מטופל wild-type מוצגים. (ג) היסטוגרמות להציג מאפייני סמן היכר של תת תאי סטרומה ב כבד בריא. התבטאות גבוהה של CD90.2 ואת הנוכחות של CD157 הן ספציפיות עבור A, בעוד CD34 הוא ספציפי עבור תת-אוכלוסייה ב SCA-1 שוהה B, C, D ו- EpCAM קיים רק האוכלוסייה C ו- D ממוצע ± SEM; הנתונים (AC) מייצגים 2-3 ניסויים עצמאיים עם n = 3-4 לכל ניסוי. Wer הנתוניםדואר בהשוואה באמצעות P * מבחן T מזווג, שני זנב <0.05, ** P <0.005, *** p <0.0001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: העשרת microbead מבוסס מגנטי וטיהור תא אוטומטי. (א) עשרה microbead המבוסס מגנטיים של CD45 -, CD31 - ו ASGPR1 - תאים מתוארים לפני ואחרי העשרה. (ב) מגרש נקודת נציג של isolations תא microbead המבוסס האוטומטי מתוארים עבור CD133 + ו- gp38 + תאים, מצד השמאל. מימין, את הכדאיות של אוכלוסיות תאים לפני ואחרי העשרה מוצגת כאחוז יודיד propidium (PI) תאים -שלילית. ממוצע ± SEM; הנתונים (AB) מייצגים 3 ניסויים בלתי תלויים עם n = 3 לכל ניסוי. הנתונים הושוו באמצעות P * מבחן T מזווג, שני זנב <0.05, ** P <0.005, *** p <0.0001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: Cytometry זרימה מעין תת ובתאים עם טוהר גבוה. מגרשי דוט מתארים את הטוהר של אוכלוסיות תאים בדגימות המסודרות (פוסט-המין). הנתונים מייצגים 3 ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
= "1"> 
איור 5: השוואה בין אנזימים לעיכול. ההשעיה תא בודד הוכן באמצעות collagenase P (כמתואר בשלב 2) או D collagenase (1 מ"ג / מ"ל + DNase-I 0.1 מ"ג / מ"ל) מ כבדי בריא ובהמשך היה מוכתם פאנל של סמנים משטח: CD45, CD31, CD133, ו gp38 (א). האחוזים של תאים הנמצאים לכל גרם של רקמת כבד של תת תאים השונים סטרומה בין תאי CD45 שלילי בחי מטופל wild-type מוצגים. (ב) עוצמת הקרינה החציונית של CD133 מתואר עבור אוכלוסיית תאים + CD133. ממוצע ± SEM; הנתונים (AB) מייצגים 2 ניסויים בלתי תלויים עם n = 3 לכל ניסוי. הנתונים הושוו באמצעות P * מבחן T מזווג, שני זנב <0.05, ** P <0.005, *** p <0.0001.Target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דלקת כבד ופציעתם של מקורות שונים לעורר תהליכי התחדשות בכבד אשר מלווה בהרחבת תא אב והפעלה 2, 3. ובתאים בכבד אלה יש גזע אופייני תא סביר לשחק תפקיד משמעותי pathomechanism של מחלות כבד שונות.
ההטרוגניות של תאי כבד ובתאים ארוכים הוצעה. הרביזיה של תת ובתאים בכבדים באמצעות שילוב סמן משטח רומן של CD133 ו gp38 יכול לזהות תת שנושאים סמנים שונים על פני שטח ולהביע קבוצה ייחודית של גנים הקשורים לדלקת במהלך פגיעה בכבד 12. השיטה המתוארת כאן מאפשרת את הזרימה הישירה cytometry ניתוח של תאים נדירים וההשוואה הישירה שלהם במודלים פגיעים בכבד שונים. זה רלוונטי במיוחד, כמו פציעות שונות לעורר את ההפעלה של s אב המרובהubsets שיכול להיות רעיוני של ההטרוגניות הסלולר שנצפתה תגובות ductular 3, 4, 11, 12. יש לציין, חלק קטן של רקמת כבד בעכברים (0.2 גר ') הוא מספיק כדי לבודד תאים מספיק עבור ניתוח התזרים cytometry של אבות בשיטה המתוארת.
Cytometry זרימה ומיון מתן אוכלוסיות טוהרות הגבוהה של תת יש צורך לבדוק פרופילי ביטוי גנים הייחודיים שלהם. דיווחים קודמים זרימה תארה cytometry מבוסס בידוד תא אב 15, 16. אף על פי כן, הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטת אופטימיזציה המבטיחה את הטוהר הגבוה כדאיות של תאים אלה. יש לציין, במבחנת טכניקות culturing והרחבה שתוארו לעיל ניתן לשלב יפה עם הפרוטוקול המובא כאן 15
סוגים רבים של זרימת cytometry ממיינים זמינים במוסדות שונים, כלי המדידה המסוימת שלהם עשויה להיות שונה מעט. עם זאת, העקרונות הכלליים עבור מיון תא מוצגים הפרוטוקול המתואר. באופן כללי, לחץ נמוך וגודל זרבובית גדול הם הכרחיים, עצמאיים של סוגי המחשבים ומפרטים. יתר על כן, הניצול של מדיום מיון מתאים יכול להגביר את הכדאיות משמעותית את איכות RNA של התאים הממוינים, אשר מהווה גורם חשוב, במיוחד עבור ביטוי במחקרי גן. המיון ובתאים, אולם מפחית כדאיויות תא מאוד, ואת התשואה של תאים לאחר המיון היא נמוכה יחסית (עבור סוג טוהר גבוה של 7-10,000 אירועים / תת-אוכלוסייה, 4-5 כבד בריאים צריך להיות ונקווה). זה יכול להיות גורם מגביל נוסף במבחנת ניתוחים. אנו מציעים בידוד microbead מבוסס מגנטי במבחני חוץ גופית, בגלל הכדאיות תשואה ותא גבוה שלה, וזרימה cytometry מיון ניתוח ביטוי גנים, במיוחד כאשר משנה מנתח הבידודים צויין עוד נדרשים.
בהתבסס על העובדה כי הכדאיות של תאים מופחתת במידה ניכרת לאחר cytometry זרימת מיון, בידוד מבוסס microbead מגנטי אוטומטי של ובתאים פותח והציג כאן. זה מאפשר הבידוד של מספר רב יותר של ובתאים עם טוהר גבוה (שילוב כבד מרובים). יתר על כן, את הכדאיות של התאים נשמרה, מאז הזמן הדרוש לתהליך הבידוד מופחת במידה ניכרת. בעוד מספרים נמוכים יותר של ובתאים ניתן להרחיב במבחנה 1, 2, 15, 16, מומלץ לשקול כיצד מניפולציות במבחנה אלה יכולים לשנות תכונות הסלולר של גזע / ProGenתאי itor תארו עבור אוכלוסיות תאי mesenchymal סטרומה אחרות 17, 18.
המגבלה העיקרית של בידוד microbead מבוסס מגנטי המוצג הנה כי CD133 + ואת אוכלוסיות gp38 + תא מייצגות תאים הטרוגנית. סמני משטח נוספים עשויים להיות נחוצים כדי לזהות אוכלוסיות תאים קטנות.
ההבנה כיצד תאי גזע כבדים ואת אבות מתייחסים זה לזה היא רחוק מלהיות מלא, למרות מחקרים מצוינים על ידי לולה ריד ואחרים 1, 8, 19. לפיכך, שיקול זהיר של טכניקות וכתוצאה מכך תשואות גבוהות יותר ואת הכדאיות, כמו שמוצע כאן, יכול לעזור להאריך את הניתוחים של תת אבי ואת ההבנה של מערכות היחסים שלהם מחוברים.
בסך הכל, שתיארנו tהפירט לבודד ולנתח את ההשפעה תת ובתאים כבדים כי נבדלו לאחרונה 12. יתר על כן, על ידי העסקת שילוב אנזים רומן, אבות נדירים יכולים להיות מנותח על ידי מדידות cytometry הזרימה ישירות. בנוסף, הפרוטוקול ממחיש כיצד להעשיר ובתאים עם טוהר גבוה, תוך שימוש בפורמט מיון תא או טכניקת microbead המבוסס אוטומטית.
פתרון תקלות:
חלקם של פסולת תא והתאים מתים הם גבוהים
אם, במהלך העיכול (שלב 2), pipetting של הדגימות הכבדות מדי קשה, האחוז למות תאי עליות השעית התא הבודד. אם הכבד לחתוך לחתיכות גדולות מאשר הציע, לעיכול הוא פחות יעיל ותוצאות מוות של תאים יותר במהלך ההכנה.
לאחר השלים ההליך בשלב 5, את הטוהר של הדגימות אינו מספיק
אם percenTages של פסולת תא ותאים מתים השעית תא יחיד מוכן בשלב 2 גבוהים מדי, את microbeads לאגד unspecifically, ולכן, את הטוהר של הבידוד מופחת במידה ניכרת.
מספר תאים נמוך לאחר טיהור microbead המבוסס
על ההצלחה של הפרוטוקול המתואר, חשוב כי היחס בין תאי microbeads הוא אופטימלי, כפי שהוצע בפרוטוקול. ניצול יותר microbeads מפחית את הטוהר מקטין את התשואה ואת הכדאיות של התאים המבודדים. אם סמני משטח אחרים מאלה שהוצגו בפרוטוקול משמשים לבידוד משנה אב, היחס האופטימלי של תאי microbeads חייב להיות נחוש.
בידוד מבוסס microbead מגנטית של gp38 + CD133 - אוכלוסייה
בצע את השלבים בסעיף 5. בשלב 5.3 להוסיף גם 10 μL אנטי-CD133 + microbeads, ולאחר מכן בצע שלבים 5, 6.2 ו -6.3 כמו לתארד.
חישוב מספרים מוחלטים לתא
המשקל הכבד משמש לחישוב כיצד תאים רבים של תת-קבוצה מסוימת נוכחים לכל רקמת כבד גרם.
(% של תת-האוכלוסייה בתאים חי (מבוסס על cytometry זרימה) / 100) x מספר תא חי הכולל מבודד מן היצירה כבדה = Z
(1 / משקל של חתיכה כבדה) x Z = מספר תא / g רקמת כבד
אוכלוסיות תאים אחרים כי יכול להיות מבודד עם שיטה זו
אפשר לבודד את תאי הכבד הבאים באמצעות פרוטוקול עיכול זה: תאי CD45 + (או תת-אוכלוסיות של תאי היווצרות דם, תאי Kupffer למשל, תאים דנדריטיים, תאי T, תאי NK, וכו ') ואת LSECs. פרוטוקול העיכול אינו מתאים בידוד של hepatocytes או תאי stellate כבדים. תאים אלה נוכחי מספרים סלולריים נמוכים יחסית והם מראים כדאיות מופחתת לעומת וטיהורr משיטות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרס אלכסנדר פון הומבולדט קרן Sofja Kovalevskaja כדי VLK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
- Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
- Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
- Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
- Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
- Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
- Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
- Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
- Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
- Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
- Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
- Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
- Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
- Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
- Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).
