Summary
עירוי צינור הלבלב היא טכניקה חשובה שיכולה לאפשר מעקב אחר שושלת, הקדמת גנים, פילוח ספציפי לקו התא. טכניקת עירוי צינור הלבלב עבור משלוח סמים ויראלי לתאי הלבלב מוצג כאן.
Abstract
הלבלב הוא איבר ביפון עם מרכיבים אנדוקריניים ואקסוקריניים כאחד. מספר פתולוגיות עלולות להכאיב ללבלב, כולל סוכרת, דלקת לבלב וסרטן הלבלב. כל שלוש המחלות הללו מסמנות תחומי מחקר פעילים, לא רק כדי לפתח טיפול מיידי, אלא גם כדי להבין טוב יותר את הפתופיזיולוגיה שלהם. ישנם מעט כלים לקידום תחומי לימוד אלה. עירוי צינור הלבלב היא טכניקה חשובה שיכולה לאפשר מעקב אחר שושלת, הקדמת גנים, פילוח ספציפי לקו התא. הטכניקה דורשת את הניתוח המורכב של החלק השני של התריסריון והאמפולה, ואחריו החסם של צינור המרה ואת cannulation של צינור הלבלב. למרות הטכניקה היא מבחינה טכנית מאתגר בהתחלה, היישומים הם רבים. העמימות בפרטי ההליך בין הקבוצות הדגישה את הצורך בפרוטוקול סטנדרטי. עבודה זו מתארת את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בתוך הלבלב לאחר עירוי צינור הלבלב של וקטור ויראלי המבטא GFP לעומת ניתוח מזויף. עירוי ולכן הביטוי הוא ספציפי ללבלב, ללא ביטוי נוכח בכל סוג רקמה אחר.
Introduction
הלבלב הוא איבר בימפונקציוני, עם מרכיבים אנדוקריניים ואקסוקריניים כאחד. מספר פתולוגיות יכולות לייעל את הלבלב, כולל סוכרת, דלקת לבלב וסרטן הלבלב1. כל שלוש המחלות הללו מסמנות תחומי מחקר פעילים, לא רק כדי לפתח טיפול מיידי, אלא גם כדי להבין טוב יותר את הפתופיזיולוגיה שלהם.
שיטת משלוח טיפולי ממוקדת תועיל. פיתחנו טכניקת עירוי צינור הלבלב כי היא שיטה יעילה סלקטיבית עבור משלוח סמים ויראלי לתאי הלבלב. במודל זה, צינור הלבלב הוא cannulated באופן סלקטיבי, ואת צינור המרה הנפוצה הוא נאטם, המאפשר משלוח אך ורק ללבלב.
טכניקה זו יכולה לאפשר מעקב שושלת של סוגי תאים ספציפיים כדי לפרט עוד יותר את המסלולים ההתפתחותיים החשובים להתפתחות הלבלב ופתולוגיה2,3. מקדמים שונים בווקטורים ויראליים מאפשרים פילוח ספציפי של קווי תאים ולהכנסת גנים לקווי תאים אלה4,5. עבודה זו מדגימה את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בתוך הלבלב לאחר עירוי צינור הלבלב של וקטור ויראלי המבטא GFP לעומת ניתוח מזויף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לחקר וטיפול בבעלי חיים בבית החולים לילדים של פיטסבורג ובאוניברסיטת פיטסבורג מוסדית לטיפול בבעלי חיים והוועדה לטיפול ושימוש.
1. הכנה טרום הניתוחית
- יש לנהל איזופלוראן בשאיפה (1 - 3% לתחזוקה ועד 5% לאינדוקציה) באמצעות חרוט אף לרמת הרדמה מתאימה. לפקח על ההוות של הרדמה על ידי צביטת בוהן עם מלקחיים. היעדר תגובה נחשב הולם, והקפידו לא לקחת יתר על המידה, שכן עלול להתרחש דיכאון נשימתי.
- מניחים את החיה על גבו על במת המיקרוסקופ הניתוח, כאשר הבטן מרוכזת לאור המטרה. לשתק את החיה עם סרט ניתוחי. יש למרוח משחה עיניים על עיני החיה כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
- יש למרוח שכבה חלקה ועבה של קרם להסרת שיער ולהשאיר אותו במקומו למשך 3 דקות. בדוק אזור קטן להסרת שיער. יש לנגב בעדינות את השמנת והשיער עם גזה ספוגה באתנול ב-70%.
- יש לנקות ולחטא את בטנו של החיה על ידי ניגובה עם גזה ספוגה באתנול 70% ואחריה גזה ספוגה בטדין. לשמור על תנאים סטריליים לאורך כל ההליך הכירורגי.
2. חשיפה נכונה
- לעשות חתוך קו האמצע בעור מתהליך xyphoid אל הטבור באמצעות אזמל. הרם את צפק עם מלקחיים אדסון ולעשות חור קטן בקו האמצע באמצעות מספריים.
- להרחיב את החתיכה צפק לאורך חתכת העור, דואג להישאר על קו האמצע (לינאה אלבה).
הערה: זה ייצור לפרוסטומיה בטן קו האמצע העליון. - להעלות את הכבד עם מפסקים קהים כדי לחשוף את צינור המרה המשותף. מהדק את צינור המרה המשותף עם מלחצי כלי דם בולדוג מעוקלים.
הערה: תמרון זה מונע עירוי לא רצוי לתוך הכבד.
3. זיהוי של פפילה הלבלב ותריסאודנוטומיה
- זהה את התריסריון, ועם מלקחיים Arruga, לחזור בו בקול רם כדי להציג את הפפילה.
הערה: הפפילה היא נקודה לבנה על המשטח החלק החלקי של החלק השני של התריסריון. - לסגת התריסריון cauddenum caudally, המאפשר זיהוי של מהלך צינור הלבלב. עם מחט 301/2-מד, לנקב את הקיר של התריסריון משיק, ישירות מול הפפילה.
הערה: המחט צריכה לעקוב אחר אותה זווית כמו הצינור כפי שהוא נכנס התריסריון.
4. עירוי.
- מעבירים את הצנתר דרך התריסריון שנוצר בשלב 3.2 עד שהקטטר נראה בתוך הצינור. לקדם את הקטטר לתוך הצינור לא יותר מ 1 ס"מ כדי למנוע את המעקף של יובלים דביקים קטנים.
- מהדקים את הצנתר במקום עם מהדק כלי דם בולדוג מעוקל שני. הפעל את המשאבה והחדיר את עוצמת הקול שנבחרה. נפח חדורים עשוי לנוע בין 25 - 250 μL, עם נפח אידיאלי של כ 150 μL.
- לנהל הזרקה תוך-איפריטונית של כ 1.5 מ"ל של מלוחים כדי לקזז הפסדים. לכסות את המעי החשוף עם גזה לחה כדי למנוע ייבוש.
- בסיום העירוי, להסיר את מלחצי הבולדוג שהחזיק את הקטטר במקום. השתמש מהדק הבולדוג כדי להסיר בעדינות את הצנתר מצינור הלבלב. שחררו את המלחציים מצינור המרה המשותף.
- סוגרים את צפק ואת העור בשכבות אחת או שתיים באמצעות תפוי פועל.
הערה: אין צורך לסגור את התריסריון, שכן הוא ייאטם בכוחות עצמו. - כמו מכאלגזיה לאחר הניתוח, לנהל מנה של קטופן ב 5 מ"ג/ קילוגרם במהלך ההליך ואחד למחרת.
- החזר את העכבר לכלוב שלו תחת מנורת חום עד שהוא מתאושש. ספק לעכבר מזון ומים ad libitum.
- אין להשאיר את החיה ללא השגחה עד שהיא תחזור להכרה מספקת כדי לשמור על נסיגה ב לעצם החזה. אין להחזיר בעל חיים שעבר ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים עד להחלמתו המלאה.
5. הכנת מדגם
- מניחים את החיה בתא דו תחמוצת הפחמן או לבצע נקע צוואר הרחם.
- קצירת הלבלב, עם הטחול, הכבד והתריסריון כבקרות. לתקן את הרקמות paraformaldehyde לילה ב 4 °C (50 °F). Cryoprotect המדגם ב 30% סוכרוז לילה, כפי שתואר בעבר6.
- הצמד-להקפיא את הדגימות. חלק את הרקמה בעובי של 6 מיקרומטר באמצעות microtome. בצע הדמיה על מיקרוסקופ עם הדמיית פלואורסצנטיות, כפי שתואר בעבר7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עם תרגול וטכניקה כירורגית זהירה, שיעור ההישרדות של עכברים אלה צריך להיות גדול מ 95%. שבוע לאחר עירוי, ההשפעה הרצויה צריכה להיות ניכרת בלבלב. עכברים בגיל 10 עד 12 שבועות נוצלו עבור חליטות צינור הלבלב. כאן אנו משתמשים בסרוטיפ וירוסים הקשורים לאדנו 8 (AAV8) עם מקדם CMV כדי לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), בהשוואה לניתוח מזויף. לבלב עכברים נקצר 7 ימים לאחר חליטות. חלקים מהלבלב, הטחול והתריסריון הוכתמו בנוגדן אינסולין ובהושט. איור 1 מראה כי יש ביטוי נרחב של GFP ברחבי הלבלב בעכברים שעברו עירוי צינור הלבלב עם AAV8, בניגוד לאלה שעברו ניתוח מזויף. אין ביטוי בכבד, טחול, או התריסריון בעכברים אלה, ובכך לתעד את האופי הסלקטיבי של עירוי. נתונים אלה ניתנים לאישור במספר שיטות אחרות, כולל פרופילי ביטוי DNA ו- RNA.
איור 1. ביטוי של GFP לאחר עירוי צינור הלבלב. (א) ניתוח מזויף בהשוואה (ב) עירוי צינור הלבלב עם AAV8 מבטא GFP. סרגל קנה המידה מייצג 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבודה זו מתארת בפירוט את המתודולוגיה שמאחורי עירוי צינור הלבלב, מודל עכבר יעיל להעברת גנים ומולקולות אחרות באופן ספציפי ויעיל ללבלב. עמימות בפרטי ההליך בין קבוצות שונות הדגישה את הצורך בפרוטוקול סטנדרטי8,9,10.
ישנם מספר שלבים קריטיים של ההליך, החל בבחירת עכברים צעירים ובריאים. ניקוב התריסריון, קטן ומבוקר ככל שיהיה, הוא אירוע טראומטי בעכבר, שללא ספק מוביל לגיוס ציטוקינים דלקתיים וגורמים אחרים שלא התאפיינו לחלוטין. לכן, ניתוח עדין הוא קריטי, כמו גם יצירת התריסריון הקטן ביותר האפשרי להקדמת הצנתר. השלב החשוב ביותר של ההליך כולו הוא cannulation של צינור הלבלב עם מערכת המסירה.
קשיים יכולים להתעורר עם הפרעה מוגזמת של פפילה הלבלב, המוביל תגובה דלקתית מערכתית מכריע. הלבלב הוא איבר עדין; בקהילה הכירורגית, הוא מתואר באופן קולוני כאיבר שלא "להתעסק" איתו. שיעורי ההצלחה ישתנו רק במעט עם רמת המיומנות של המטפל. כל עוד צינור המרה הוא נאטם כראוי, עירוי יהיה 100% ספציפי ללבלב בלבד.
עקומת הלמידה של ההליך תלולה למדי, והמגבלה העיקרית היא להתגבר על התרגול. כאמור, מניפולציה מוגזמת של התריסריון והלבלב יכולה להוביל לתגובה דלקתית מכריעה שיש להימנע ממנה.
להליך יש ישימות רחבה על פני דיסציפלינות רבות ושונות. זה יכול להיות מנוצל כשיטה להעברת גנים ממוקדים באמצעות וקטורים ויראליים ספציפיים11. ההליך יכול גם לאפשר עירוי ספציפי של מולקולות המסייעות בהבהרת תפקוד תאי הלבלב. המסירה הספציפית של מולקולות מסוימות היא שיטה מושכת לשינוי מסלולי האיתות בתוך האיים כדי לייצרהתפשטות 12. המערכת יכולה גם לטשטש את הצורך הרבייה מהונדסת על ידי ייצור ישיר של גנוטיפ ופנוטיפ רצויים בתוך הלבלב. היישומים הם רבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
למחברים אין הכרות. המימון התקבל מהוועדה לבריאות ולתכנון המשפחה של מחוז ג'ה-ג'יאנג (מענק 20146242) ומקרן הלשכה למדע וטכנולוגיה של וונג'ואו (מענק Y20140248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (25 - 30g, 8-12 weeks old) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Ethanol (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Sterile Saline Solution | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Protective Equipment | |||
| Hair Removal Product | Nair or trimmer | ||
| Gauze Pads 2in x 2in | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Needles (30.5G and 25G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 and 305122 | |
| Syringe for Ketofen and Saline | Becton Dicksinson and Co. | 309657 | |
| Syringe for Pump | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Infusion Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Infusion Catheter | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Curved Bulldog Clamps (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Arruga Forceps | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Forcep | Roboz | RS-5234 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7882 | |
| Scissor | Roboz | RS-5982 | |
| Cotton Tip Applicators | Physician Sales and Services | 22-9988 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Suture | Owens and Minor | SXMD1B402 |
References
- Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells. Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).
- Raper, S. E., DeMatteo, R. P. Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas. Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).
- Xiao, X., et al. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).
- Song, Z., et al. EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice. J Biol Chem. 291 (43), (2016).
- Xiao, X., et al. M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).
- Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate. Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).
- Lichtenstein, A., et al. Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct. Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).
- Guo, P., et al. Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts. Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).
- Xiao, X., et al. Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas. J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).
