Summary
A infusão do ducto pancreático é uma técnica importante que pode permitir o rastreamento de linhagem, introdução genética e segmentação específica da linha celular. Uma técnica de infusão de dutos pancreáticos para a entrega de drogas e virais para células pancreáticas é apresentada aqui.
Abstract
O pâncreas é um órgão bifuncional com componentes endócrinos e exócrinos. Várias patologias podem afligir o pâncreas, incluindo diabetes, pancreatite e câncer de pâncreas. Todas essas três doenças marcam áreas ativas de estudo, não apenas para desenvolver terapia imediata, mas também para entender melhor sua fisiopatologia. Existem poucas ferramentas para promover essas áreas de estudo. A infusão do ducto pancreático é uma técnica importante que pode permitir o rastreamento de linhagem, introdução genética e segmentação específica da linha celular. A técnica requer a dissecação intrincada da segunda porção do duodeno e da ampola, seguida pela oclusão do ducto biliar e pela canulação do ducto pancreático. Embora a técnica seja tecnicamente desafiadora no início, as aplicações são miríades. A ambiguidade nas especificidades do procedimento entre os grupos destacou a necessidade de um protocolo padrão. Este trabalho descreve a expressão de uma proteína fluorescente verde (GFP) dentro do pâncreas após a infusão do ducto pancreático de um vetor viral expressando GFP versus uma cirurgia falsa. A infusão e, portanto, a expressão é específica para o pâncreas, sem expressão presente em qualquer outro tipo de tecido.
Introduction
O pâncreas é um órgão bifuncional, com componentes endócrinos e exócrinos. Uma série de patologias podem afligir o pâncreas, incluindo diabetes, pancreatite e câncer de pâncreas1. Todas essas três doenças marcam áreas ativas de estudo, não apenas para desenvolver terapia imediata, mas também para entender melhor sua fisiopatologia.
Um método de entrega terapêutica direcionado seria benéfico. Desenvolvemos uma técnica de infusão de dutos pancreáticos que é um método eficaz e seletivo para a entrega de drogas e virais para células pancreáticas. Neste modelo, o ducto pancreático é seletivamente cânulado, e o ducto biliar comum é ocluído, permitindo a entrega exclusivamente ao pâncreas.
Essa técnica pode permitir o rastreamento de linhagem de tipos celulares específicos para elucidar ainda mais as vias de desenvolvimento importantes para o desenvolvimento pancreático e patologia2,3. Diferentes promotores em vetores virais permitem o direcionamento específico das linhas celulares e para a introdução de genes nessas linhas celulares4,5. Este trabalho demonstra a expressão de uma proteína fluorescente verde (GFP) dentro do pâncreas após a infusão do ducto pancreático de um vetor viral expressando GFP versus uma cirurgia falsa.
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Pesquisa e Cuidado Animal do Hospital Infantil de Pittsburgh e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh.
1. Preparação pré-operatória
- Administrar isoflurano inalado (1 - 3% para manutenção e até 5% para indução) através de um cone de nariz a um nível anestésico apropriado. Monitore a adequação da anestesia por beliscão do dedo do dedo com fórceps. A falta de resposta é considerada adequada, e certifique-se de não se sobremedicar, pois pode ocorrer depressão respiratória.
- Coloque o animal de costas no estágio de dissecador do microscópio, com o abdômen centrado em vista do objetivo. Imobilize o animal com fita cirúrgica. Aplique pomada oftalmica aos olhos do animal para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia.
- Aplique uma camada lisa e grossa de creme de depilação e deixe-o no lugar por 3 minutos. Verifique uma pequena área para depilação. Limpe suavemente o creme e o cabelo com 70% de gaze encharcada de etanol.
- Limpe e desinfete o abdômen do animal limpando-o com uma gaze 70% encharcada de etanol, seguida de uma gaze encharcada de betadina. Mantenha condições estéreis durante todo o procedimento cirúrgico.
2. Exposição adequada
- Faça uma incisão midline na pele desde o processo xifoide até o umbigo usando um bisturi. Levante o peritônio com fórceps de Adson e faça um pequeno furo na linha média usando uma tesoura.
- Estender a incisão peritoneal ao comprimento da incisão da pele, tomando cuidado para permanecer na linha média (linea alba).
NOTA: Isso produzirá uma laparotomia abdominal média superior. - Eleve o fígado com retráteis sem cortes para expor o ducto biliar comum. Fixar o ducto biliar comum com um grampo vascular de buldogue curvo.
NOTA: Esta manobra evita a infusão indesejada no fígado.
3. Identificação da Papila Pancreática e Duodenotomia
- Identifique o duodeno e, com asseps arruga, retraia-o caudally para exibir a papila.
NOTA: A papila é uma mancha branca na superfície anterior da segunda porção do duodeno. - Retraia o duodeno caudalmente, permitindo a identificação do curso do ducto pancreático. Com uma agulha calibre 301/2, puna a parede do duodeno tangencialmente, diretamente em frente à papila.
NOTA: A agulha deve seguir o mesmo ângulo do duto ao entrar no duodeno.
4. Infusão.
- Passe o cateter através da duodenotomia criada na etapa 3.2 até que o cateter esteja visível dentro do duto. Avance o cateter para dentro do duto não mais do que 1 cm para evitar o desvio de pequenos afluentes ductais.
- Fixar o cateter no lugar com um segundo grampo vascular de buldogue curvo. Ligue a bomba e infunda o volume selecionado. O volume infundido pode variar de 25 a 250 μL, com um volume ideal de aproximadamente 150 μL.
- Administre uma injeção intraperitoneal de aproximadamente 1,5 mL de soro fisiológico para compensar as perdas. Cubra o intestino exposto com uma gaze úmida para evitar a proficação.
- Ao final da infusão, remova o grampo bulldog que estava segurando o cateter no lugar. Use o grampo do buldogue para remover suavemente o cateter do ducto pancreático. Solte o grampo do ducto biliar comum.
- Feche o peritônio e a pele em uma ou duas camadas usando uma sutura de corrida.
NOTA: Não há necessidade de fechar a duodenotomia, pois ela sela por conta própria. - Como analgesia pós-operatória, administre uma dose de cetofen a 5 mg/kg durante o procedimento e uma no dia seguinte.
- Devolva o mouse à sua gaiola sob uma lâmpada de calor até que ele se recupere. Forneça ao rato comida e ad libitum de água.
- Não deixe o animal desacompanhado até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a recumbência severa. Não devolva um animal que tenha sido submetido a uma cirurgia na companhia de outros animais até que ele tenha se recuperado totalmente.
5. Preparação da amostra
- Coloque o animal em uma câmara de dióxido de carbono ou realize a luxação cervical.
- Colhe o pâncreas, com o baço, fígado e duodeno como controles. Fixar os tecidos em paraformaldeído durante a noite a 4 °C. Crioprotetor a amostra em 30% de sacarose durante a noite, como descrito anteriormente6.
- Congele as amostras. Selar o tecido a uma espessura de 6 μm usando um microtome. Realize imagens em um microscópio com imagens de fluorescência, como descrito anteriormente7.
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Representative Results
Com a prática e técnica cirúrgica cuidadosa, a taxa de sobrevivência desses camundongos deve ser superior a 95%. Uma semana após a infusão, o efeito desejado deve ser evidente no pâncreas. Camundongos com idade entre 10 e 12 semanas foram utilizados para infusões de dutos pancreáticos. Aqui usamos um sorotipo 8 (AAV8) associado ao vírus adeno com um promotor de CMV para expressar proteína fluorescente verde (GFP), em comparação com uma cirurgia falsa. Os pâncreas dos ratos foram colhidos 7 dias após as infusões. Seções de pâncreas, baço e duodeno foram manchadas com anticorpo de insulina e Hoescht. A Figura 1 mostra que há uma expressão extensiva de GFP em todo o pâncreas nos camundongos que foram submetidos à infusão do ducto pancreático com AAV8, ao contrário daqueles que foram submetidos a uma cirurgia falsa. Não há expressão no fígado, baço ou duodeno nesses camundongos, documentando assim a natureza seletiva da infusão. Esses dados podem ser confirmados com vários outros métodos, incluindo perfis de expressão de DNA e RNA.
Figura 1. Expressão de GFP após infusão do ducto pancreático. a Cirurgia de sham em comparação com (b) infusão do ducto pancreático com AAV8 expressando GFP. A barra de escala representa 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este trabalho descreve em detalhes a metodologia por trás da infusão do ducto pancreático, um modelo eficaz de camundongos para a entrega de genes e outras moléculas especificamente e efetivamente no pâncreas. A ambiguidade nas especificidades do procedimento entre vários grupos destacou a necessidade de um protocolo padronizado8,9,10.
Existem várias etapas críticas do procedimento, começando pela seleção de camundongos jovens e saudáveis. A perfuração do duodeno, por menor que seja, é um evento traumático no camundongo que, sem dúvida, leva ao recrutamento de citocinas inflamatórias e outros fatores que não foram completamente caracterizados. Portanto, uma dissecção delicada é crucial, assim como criar a menor duodenotomia possível para a introdução do cateter. O passo mais importante de todo o procedimento é a cannulação do duto pancreático com o sistema de entrega.
Podem surgir dificuldades com o rompimento excessivo da papila pancreática, levando a uma resposta inflamatória sistêmica esmagadora. O pâncreas é um órgão delicado; na comunidade cirúrgica, é coloquialmente descrito como um órgão para não "mexer". As taxas de sucesso variam apenas ligeiramente com o nível de habilidade do praticante. Enquanto o ducto biliar estiver devidamente ocluído, a infusão será 100% específica apenas para o pâncreas.
A curva de aprendizado para o procedimento é bastante íngreme, e a principal limitação é superada com a prática. Como dito anteriormente, a manipulação excessiva do duodeno e do pâncreas pode levar a uma resposta inflamatória esmagadora que deve ser evitada.
O procedimento tem ampla aplicabilidade em muitas disciplinas diferentes. Pode ser utilizado como um método para entrega de genes direcionados através do uso de vetores virais específicos11. O procedimento também pode permitir a infusão específica de moléculas que auxiliam na elucidação da função celular pancreática. A entrega específica de certas moléculas é um método atraente para modificar as vias de sinalização dentro das ilhotas para produzir proliferação12. O sistema também pode evitar a necessidade de reprodução transgênica, produzindo diretamente um genótipo e fenótipo desejados dentro do pâncreas. As aplicações são miríades.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores não têm reconhecimentos. O financiamento foi recebido da Fundação de Saúde e Planejamento Familiar da Província de Zhejiang (Grant 20146242) e da Fundação wenzhou Science & Technology Bureau (Grant Y20140248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (25 - 30g, 8-12 weeks old) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Ethanol (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Sterile Saline Solution | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Protective Equipment | |||
| Hair Removal Product | Nair or trimmer | ||
| Gauze Pads 2in x 2in | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Needles (30.5G and 25G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 and 305122 | |
| Syringe for Ketofen and Saline | Becton Dicksinson and Co. | 309657 | |
| Syringe for Pump | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Infusion Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Infusion Catheter | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Curved Bulldog Clamps (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Arruga Forceps | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Forcep | Roboz | RS-5234 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7882 | |
| Scissor | Roboz | RS-5982 | |
| Cotton Tip Applicators | Physician Sales and Services | 22-9988 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Suture | Owens and Minor | SXMD1B402 |
References
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