Summary
Pankreas kanalı infüzyonu, soy izleme, gen girişi ve hücre hattına özgü hedeflemeye izin verebilen önemli bir tekniktir. Pankreas hücrelerine ilaç ve viral doğum için pankreas kanalı infüzyon tekniği burada sunulmuştur.
Abstract
Pankreas, hem endokrin hem de ekzokrin bileşenlere sahip iki fonksiyonlu bir organdır. Diyabet, pankreatit ve pankreas kanseri de dahil olmak üzere bir dizi patoloji pankreası üzebilir. Bu hastalıkların üçü de sadece acil tedavi geliştirmek için değil, aynı zamanda patofizyolojilerini daha iyi anlamak için aktif çalışma alanlarını işaretler. Bu çalışma alanlarını ilerletmek için çok az araç vardır. Pankreas kanalı infüzyonu, soy izleme, gen girişi ve hücre hattına özgü hedeflemeye izin verebilen önemli bir tekniktir. Teknik, duodenum ve ampullanın ikinci kısmının karmaşık diseksiyonunu ve ardından safra kanalının tıkanması ve pankreas kanalının canülasyonunu gerektirir. Teknik olarak ilk başta zorlayıcı olsa da, uygulamalar sayısızdır. Gruplar arasındaki yordamın özelliklerindeki belirsizlik, standart bir protokole duyulan ihtiyacı vurgulamıştır. Bu çalışma, GFP'yi ifade eden viral bir vektörün pankreas kanalı infüzyonunun sahte bir ameliyata karşı pankreas içinde yeşil bir floresan proteinin (GFP) ekspresyonunu açıklar. İnfüzyon ve dolayısıyla ifade, başka bir doku tipinde ifade olmadan pankreasa özgüdür.
Introduction
Pankreas, hem endokrin hem de ekzokrin bileşenlere sahip iki fonksiyonlu bir organdır. Diyabet, pankreatit ve pankreas kanseri de dahil olmak üzere bir dizi patoloji pankreasıüzebilir 1. Bu hastalıkların üçü de sadece acil tedavi geliştirmek için değil, aynı zamanda patofizyolojilerini daha iyi anlamak için aktif çalışma alanlarını işaretler.
Hedefli bir terapötik doğum yöntemi faydalı olacaktır. Pankreas hücrelerine ilaç ve viral doğum için etkili ve seçici bir yöntem olan pankreas kanalı infüzyon tekniği geliştirdik. Bu modelde, pankreas kanalı seçici olarak konserve edilir ve ortak safra kanalı tıkanır ve sadece pankreasa teslim edilir.
Bu teknik, pankreas gelişimi ve patolojisi2,3için önemli olan gelişim yollarını daha da aydınlatmak için belirli hücre tiplerinin soy izlemesine izin verebilir. Viral vektörlerdeki farklı promotörler, hücre hatlarının spesifik olarak hedeflilmesine ve genlerin bu hücre hatlarına girmesine izin verir4,5. Bu çalışma, GFP'yi ifade eden viral bir vektörün pankreas kanalı infüzyonunun sahte bir ameliyata karşı pankreas içinde yeşil bir floresan protein (GFP) ifadesini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Pittsburgh Çocuk Hastanesi Hayvan Araştırma ve Bakım Komitesi ve Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Ameliyat Öncesi Hazırlık
- Burun konisi aracılığıyla uygun bir anestezik seviyeye solunan izofluran (bakım için % 1 - 3 ve indüksiyon için% 5'e kadar) verin. Anestezinin yeterliliğini ayak parmaklarıyla kıstırarak izleyin. Yanıt eksikliği yeterli kabul edilir ve solunum depresyonu olabileceğinden aşırı meditasyon yapmamayı unutmayın.
- Hayvanı, karın hedefi göz önünde bulundurularak ortalanmış olarak, diseksiyon mikroskop aşamasına sırt üstüne yerleştirin. Hayvanı cerrahi bantla hareketsiz hale ederim. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için hayvanın gözlerine oftalmik merhem uygulayın.
- Pürüzsüz, kalın bir epilasyon kremi tabakası uygulayın ve 3 dakika boyunca yerinde bırakın. Epilasyon için küçük bir alanı kontrol edin. Kremi ve saçı% 70 etanol batırılmış gazlı bezle hafifçe silin.
- Hayvanın karnını% 70 etanol batırılmış gazlı bez ve ardından betadin batırılmış bir gazlı bezle silerek temizleyin ve dezenfekte edin. Cerrahi prosedür boyunca steril koşulları koruyun.
2. Uygun Pozlama
- Neşter kullanarak ksifoid işleminden umbilicus'a kadar ciltte bir orta çizgi kesisi yapın. Peritonları Adson tokmalarıyla kaldırın ve makas kullanarak orta çizgide küçük bir delik açın.
- Periton kesisini cilt kesisinin uzunluğuna kadar uzatın, orta hatta kalmaya özen gösterin (linea alba).
NOT: Bu bir üst orta hat abdominal laparotomi üretecektir. - Ortak safra kanalını ortaya çıkarmak için karaciğeri künt retraktörlerle yükseltin. Ortak safra kanalını kavisli bir bulldog vasküler kelepçe ile kelepçeleyin.
NOT: Bu manevra karaciğere istenmeyen infüzyonu önler.
3. Pankreas Papilla ve Duodenotomi Tanımlaması
- Duodenumu tanımlayın ve Arruga tokaları ile papillayı görüntülemek için kaudally geri çek.
NOT: Papilla, duodenumun ikinci bölümünün ön yüzeyinde beyaz bir noktadır. - Pankreas kanalının seyrinin tanımlanmasına izin vererek duodenumu kaudally geri çekin. 301/2-gauge iğne ile duodenumun duvarını teğetsel olarak, papillanın tam karşısında delin.
NOT: İğne, duodenuma girerken kanalla aynı açıyı izlemelidir.
4. infüzyon.
- Kateteri kanal içinde görünene kadar adım 3.2'de oluşturulan duodenotomiden geçirin. Küçük düktal kolların atlanmasını önlemek için kateteri kanala en fazla 1 cm ilerletin.
- Kateteri ikinci bir kavisli bulldog vasküler kelepçe ile yerine kelepçeleyin. Pompayı açın ve seçilen hacmi demleyin. Aşılanan hacim 25 - 250 μL arasında değişebilir ve ideal hacim yaklaşık 150 μL'dir.
- Kayıpları dengelemek için yaklaşık 1,5 mL salin intraperitoneal enjeksiyonu uygulayın. Açıkta kalan bağırsağı, desiccation önlemek için nemli bir gazlı bezle örtün.
- infüzyonun sonunda, kateteri yerinde tutan bulldog kelepçesini çıkarın. Kateteri pankreas kanalından nazikçe çıkarmak için bulldog kelepçesini kullanın. Kelepçeyi ortak safra kanalından serbest bırakın.
- Çalışan bir dikiş kullanarak periton ve cildi bir veya iki katman halinde kapatın.
NOT: Duodenotomiyi kapatmaya gerek yoktur, çünkü kendi başına mühürleyecektir. - Ameliyat sonrası analjezi olarak, işlem sırasında 5 mg / kg'da ve ertesi gün bir doz ketofen uygulayın.
- Fareyi iyileşene kadar bir ısı lambası altında kafesine geri döndürün. Fareye yiyecek ve su reklam libitum sağlayın.
- Sternal rekumbensi korumak için yeterli bilinci kazanana kadar hayvanı başıboş bırakmayın. Ameliyat olan bir hayvanı tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine iade etmeyin.
5. Örnek Hazırlama
- Hayvanı bir karbondioksit odasına yerleştirin veya servikal çıkık gerçekleştirin.
- Pankreası, dalak, karaciğer ve duodenum ile kontrol olarak hasat edin. Dokuları paraformaldehitte gece boyunca 4 °C'de sabitle. Örneği daha önce açıklandığı gibi bir gecede% 30 sakkarozda kriyoprotect6.
- Örnekleri yasla. Bir mikrotom kullanarak dokuyu 6 μm kalınlığında bölümler. Daha önce açıklandığı gibi floresan görüntüleme ile mikroskopta görüntüleme gerçekleştirin7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pratik ve dikkatli cerrahi teknik ile bu farelerin hayatta kalma oranı% 95'ten fazla olmalıdır. infüzyondan bir hafta sonra pankreasta istenilen etki belirgin olmalıdır. Pankreas kanalı infüzyonları için 10 ila 12 haftalık fareler kullanılmıştır. Burada, sahte bir ameliyata kıyasla yeşil floresan proteini (GFP) ifade etmek için CMV promotörü ile adeno ilişkili bir virüs serotip 8 (AAV8) kullanıyoruz. Fare pankreasları infüzyonlardan 7 gün sonra hasat edildi. Pankreas, dalak ve duodenum bölümleri insülin antikor ve Hoescht ile lekelendi. Şekil 1, AAV8 ile pankreas kanalı infüzyonu yapılan farelerde pankreas boyunca GFP'nin geniş bir ifadesi olduğunu göstermektedir. Bu farelerde karaciğer, dalak veya duodenumda bir ifade yoktur, böylece infüzyonun seçici doğasını belgelemektedir. Bu veriler DNA ve RNA ifade profilleri de dahil olmak üzere diğer birçok yöntemle doğrulanabilir.
Şekil 1. Pankreas Kanalı İnfüzyon sonrası GFP ekspresyonu. (a) GFP ifade eden AAV8 ile (b) pankreas kanalı infüzyonu ile karşılaştırıldığında sham cerrahisi. Ölçek çubuğu 50 μm'yi temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, genlerin ve diğer moleküllerin pankreasa özel ve etkili bir şekilde teslimi için etkili bir fare modeli olan pankreas kanalı infüzyonunun arkasındaki metodolojiyi ayrıntılı olarak açıklar. Çeşitli gruplar arasındaki prosedürün özelliklerindeki belirsizlik, standartlaştırılmış bir protokol 8,9,10ihtiyacını vurgulamıştır.
Genç, sağlıklı farelerin seçiminden başlayarak prosedürün birkaç kritik adımı vardır. Duodenumun delinmesi, ne kadar küçük ve kontrollü olsa da, farede şüphesiz enflamatuar sitokinlerin ve tamamen karakterize olmayan diğer faktörlerin işe alınmasına yol açan travmatik bir olaydır. Bu nedenle, kateterin tanıtımı için mümkün olan en küçük duodenotomiyi oluşturmak gibi hassas bir diseksiyon çok önemlidir. Tüm prosedürün en önemli adımı pankreas kanalının doğum sistemi ile canülasyonudur.
Pankreas papillasının aşırı bozulmasıyla zorluklar ortaya çıkabilir ve bu da ezici bir sistemik enflamatuar yanıta yol açabilir. Pankreas hassas bir organdır; cerrahi toplulukta, "bulaşmamak" için bir organ olarak tanımlanır. Başarı oranları uygulayıcı beceri seviyesine göre sadece biraz değişecektir. Safra kanalı düzgün bir şekilde tıkandığı sürece, infüzyon sadece pankreasa% 100 spesifik olacaktır.
Prosedür için öğrenme eğrisi oldukça diktir ve ana sınırlama pratikle aşılır. Daha önce de belirtildiği gibi, duodenum ve pankreasın aşırı manipülasyonu, kaçınılması gereken ezici bir enflamatuar yanıta yol açabilir.
Prosedür birçok farklı disiplinde geniş uygulanabilirliğe sahiptir. Belirli viral vektörlerin kullanımı ile hedeflenen gen iletimi için bir yöntem olarak kullanılabilir11. Prosedür ayrıca pankreas hücre fonksiyonunun aydınlatılmasına yardımcı olan moleküllerin spesifik infüzyonuna izin verebilir. Bazı moleküllerin spesifik teslimatı, çoğalma üretmek için adacıklar içindeki sinyal yollarını değiştirmek için çekici bir yöntemdir12. Sistem ayrıca pankreas içinde istenen bir genotip ve fenotip üreterek transgenik üreme ihtiyacını ortadan getirebilir. Başvurular sayısız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarların hiçbir onayı yok. Fon, Zhejiang Eyaleti Sağlık ve Aile Planlama Komisyonu Vakfı (Grant 20146242) ve Wenzhou Bilim ve Teknoloji Bürosu Vakfı'ndan (Grant Y20140248) alındı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (25 - 30g, 8-12 weeks old) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Ethanol (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Sterile Saline Solution | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Protective Equipment | |||
| Hair Removal Product | Nair or trimmer | ||
| Gauze Pads 2in x 2in | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Needles (30.5G and 25G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 and 305122 | |
| Syringe for Ketofen and Saline | Becton Dicksinson and Co. | 309657 | |
| Syringe for Pump | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Infusion Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Infusion Catheter | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Curved Bulldog Clamps (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Arruga Forceps | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Forcep | Roboz | RS-5234 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7882 | |
| Scissor | Roboz | RS-5982 | |
| Cotton Tip Applicators | Physician Sales and Services | 22-9988 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Suture | Owens and Minor | SXMD1B402 |
References
- Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells. Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).
- Raper, S. E., DeMatteo, R. P. Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas. Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).
- Xiao, X., et al. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).
- Song, Z., et al. EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice. J Biol Chem. 291 (43), (2016).
- Xiao, X., et al. M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).
- Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate. Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).
- Lichtenstein, A., et al. Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct. Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).
- Guo, P., et al. Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts. Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).
- Xiao, X., et al. Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas. J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).
