Summary
La infusión del conducto pancreático es una técnica importante que puede permitir el rastreo del linaje, la introducción de genes y la orientación específica de la línea celular. Aquí se presenta una técnica de infusión del conducto pancreático para la administración de fármacos y virus a las células pancreáticas.
Abstract
El páncreas es un órgano bifuncional con componentes endocrinos y exocrinos. Una serie de patologías pueden afectar el páncreas, incluyendo diabetes, pancreatitis y cáncer de páncreas. Estas tres enfermedades marcan áreas activas de estudio, no solo para desarrollar una terapia inmediata, sino también para comprender mejor su fisiopatología. Hay pocas herramientas para promover estas áreas de estudio. La infusión del conducto pancreático es una técnica importante que puede permitir el rastreo del linaje, la introducción de genes y la orientación específica de la línea celular. La técnica requiere la disección intrincada de la segunda porción del duodeno y la ampolla, seguida de la oclusión del conducto biliar y la canulación del conducto pancreático. Aunque la técnica es técnicamente desafiante al principio, las aplicaciones son innumerables. La ambigüedad en los detalles del procedimiento entre los grupos puso de relieve la necesidad de un protocolo estándar. Este trabajo describe la expresión de una proteína fluorescente verde (GFP) dentro del páncreas después de la infusión del conducto pancreático de un vector viral que expresa GFP versus una cirugía simulada. La infusión y por lo tanto la expresión es específica del páncreas, sin expresión presente en ningún otro tipo de tejido.
Introduction
El páncreas es un órgano bifuncional, con componentes endocrinos y exocrinos. Una serie de patologías pueden afectar al páncreas, incluyendo diabetes, pancreatitis y cáncer de páncreas1. Estas tres enfermedades marcan áreas activas de estudio, no solo para desarrollar una terapia inmediata, sino también para comprender mejor su fisiopatología.
Un método de administración terapéutica dirigida sería beneficioso. Hemos desarrollado una técnica de infusión del conducto pancreático que es un método eficaz y selectivo para la administración de fármacos y virus a las células pancreáticas. En este modelo, el conducto pancreático se canula selectivamente y el conducto biliar común se ocluye, lo que permite la entrega exclusivamente al páncreas.
Esta técnica puede permitir el rastreo del linaje de tipos celulares específicos para dilucidar aún más las vías de desarrollo importantes para el desarrollo pancreático y la patología2,3. Diferentes promotores en vectores virales permiten la focalización específica de líneas celulares y la introducción de genes en estas líneas celulares4,5. Este trabajo demuestra la expresión de una proteína verde fluorescente (GFP) dentro del páncreas después de la infusión del conducto pancreático de un vector viral que expresa GFP versus una cirugía simulada.
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Investigación y Cuidado de Animales del Hospital de Niños de Pittsburgh y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh.
1. Preparación preoperatoria
- Administrar isoflurano inhalado (1 - 3% para el mantenimiento y hasta el 5% para la inducción) a través de un cono nasal a un nivel anestésico apropiado. Controlar la adecuación de la anestesia mediante pellizco del dedo del dedo del día con pinzas. La falta de respuesta se considera adecuada, y asegúrese de no sobremedicarse, ya que puede ocurrir depresión respiratoria.
- Coloque al animal de espaldas en la etapa del microscopio de disección, con el abdomen centrado a la vista del objetivo. Inmovilizar al animal con cinta quirúrgica. Aplique ungüento oftálmico en los ojos del animal para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
- Aplique una capa suave y gruesa de crema depilatoria y déjela en su lugar durante 3 minutos. Revise un área pequeña para la depilación. Limpie suavemente la crema y el cabello con una gasa empapada en etanol al 70%.
- Limpie y desinfecte el abdomen del animal limpiándolo con una gasa empapada en etanol al 70% seguida de una gasa empapada en betadina. Mantener condiciones estériles durante todo el procedimiento quirúrgico.
2. Exposición adecuada
- Haga una incisión en la línea media de la piel desde el proceso xifoideo hasta el ombligo con un bisturí. Levante el peritoneo con las pórceps Adson y haga un pequeño agujero en la línea media con tijeras.
- Extienda la incisión peritoneal a la longitud de la incisión en la piel, teniendo cuidado de permanecer en la línea media (línea alba).
NOTA: Esto producirá una laparotomía abdominal de la línea media superior. - Eleve el hígado con retractores romos para exponer el conducto biliar común. Pinza el conducto biliar común con una pinza vascular de bulldog curvada.
NOTA: Esta maniobra evita la infusión no deseada en el hígado.
3. Identificación de la papila pancreática y duodenotomía
- Identificar el duodeno y, con arrugas, retraerlo caudalmente para mostrar la papila.
NOTA: La papila es una mancha blanca en la superficie anterior de la segunda porción del duodeno. - Retraiga el duodeno caudalmente, lo que permite la identificación del curso del conducto pancreático. Con una aguja de calibre 301/2, perfore la pared del duodeno tangencialmente, directamente opuesta a la papila.
NOTA: La aguja debe seguir el mismo ángulo que el conducto a medida que ingresa al duodeno.
4. Infusión.
- Pase el catéter a través de la duodenotomía creada en el paso 3.2 hasta que el catéter sea visible dentro del conducto. Avance el catéter hacia el conducto no más de 1 cm para evitar el bypass de afluentes ductales menores.
- Sujete el catéter en su lugar con una segunda pinza vascular de bulldog curvada. Encienda la bomba e infunda el volumen seleccionado. El volumen infundido puede variar de 25 a 250 μL, con un volumen ideal de aproximadamente 150 μL.
- Administrar una inyección intraperitoneal de aproximadamente 1,5 ml de solución salina para compensar las pérdidas. Cubra el intestino expuesto con una gasa húmeda para evitar la desecación.
- Al final de la infusión, retire la pinza bulldog que sostenía el catéter en su lugar. Use la pinza bulldog para retirar suavemente el catéter del conducto pancreático. Suelte la abrazadera del conducto biliar común.
- Cierre el peritoneo y la piel en una o dos capas con una sutura corriente.
NOTA: No es necesario cerrar la duodenotomía, ya que se sellará por sí sola. - Como analgesia postoperatoria, administrar una dosis de ketofeno a 5 mg/kg durante el procedimiento y una al día siguiente.
- Devuelva el ratón a su jaula bajo una lámpara de calor hasta que se recupere. Proporcione al ratón comida y agua ad libitum.
- No deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la reclinación esternal. No devuelva un animal que se haya sometido a cirugía a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo.
5. Preparación de la muestra
- Coloque al animal en una cámara de dióxido de carbono o realice una dislocación cervical.
- Cosechar el páncreas, con el bazo, el hígado y el duodeno como controles. Fije los tejidos en paraformaldehído durante la noche a 4 °C. Crioproteger la muestra en sacarosa al 30% durante la noche, como se describió anteriormente6.
- Congele las muestras. Seccionar el tejido a un grosor de 6 μm utilizando un microtomo. Realizar imágenes en un microscopio con imágenes de fluorescencia, como se describió anteriormente7.
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Representative Results
Con práctica y técnica quirúrgica cuidadosa, la tasa de supervivencia de estos ratones debe ser superior al 95%. Una semana después de la infusión, el efecto deseado debe ser evidente en el páncreas. Los ratones de 10 a 12 semanas de edad se utilizaron para infusiones de conductos pancreáticos. Aquí utilizamos un serotipo 8 del virus adenoaso asociado (AAV8) con un promotor de CMV para expresar la proteína verde fluorescente (GFP), en comparación con una cirugía simulada. Los páncreas de los ratones fueron cosechados 7 días después de las infusiones. Las secciones de páncreas, bazo y duodeno se tiñeron con anticuerpos de insulina y Hoescht. La Figura 1 muestra que existe una amplia expresión de GFP en todo el páncreas en los ratones que se sometieron a infusión del conducto pancreático con AAV8, a diferencia de aquellos que se sometieron a una cirugía simulada. No hay expresión en el hígado, el bazo o el duodeno en estos ratones, documentando así la naturaleza selectiva de la infusión. Estos datos se pueden confirmar con varios otros métodos, incluidos los perfiles de expresión de ADN y ARN.
Figura 1. Expresión de GFP después de la infusión del conducto pancreático. (a) Cirugía simulada en comparación con (b) infusión del conducto pancreático con AAV8 que expresa GFP. La barra de escala representa 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este trabajo describe en detalle la metodología detrás de la infusión del conducto pancreático, un modelo de ratón eficaz para la entrega de genes y otras moléculas de manera específica y efectiva al páncreas. La ambigüedad en los detalles del procedimiento entre varios grupos puso de relieve la necesidad de un protocolo estandarizado8,9,10.
Hay varios pasos críticos del procedimiento, comenzando con la selección de ratones jóvenes y sanos. La perforación del duodeno, por pequeña y controlada que sea, es un evento traumático en el ratón que sin duda conduce al reclutamiento de citoquinas inflamatorias y otros factores que no han sido completamente caracterizados. Por lo tanto, una disección delicada es crucial, al igual que la creación de la duodenotomía más pequeña posible para la introducción del catéter. El paso más importante de todo el procedimiento es la canulación del conducto pancreático con el sistema de administración.
Las dificultades pueden surgir con la interrupción excesiva de la papila pancreática, lo que lleva a una respuesta inflamatoria sistémica abrumadora. El páncreas es un órgano delicado; en la comunidad quirúrgica, se describe coloquialmente como un órgano con el que no hay que "meterse". Las tasas de éxito variarán solo ligeramente con el nivel de habilidad del practicante. Siempre que el conducto biliar esté ocluido adecuadamente, la infusión será 100% específica solo para el páncreas.
La curva de aprendizaje para el procedimiento es bastante empinada, y la principal limitación se supera con la práctica. Como se dijo anteriormente, la manipulación excesiva del duodeno y el páncreas puede conducir a una respuesta inflamatoria abrumadora que debe evitarse.
El procedimiento tiene una amplia aplicabilidad en muchas disciplinas diferentes. Se puede utilizar como un método para la entrega dirigida de genes mediante el uso de vectores virales específicos11. El procedimiento también puede permitir la infusión específica de moléculas que ayudan en la elucidación de la función de las células pancreáticas. La entrega específica de ciertas moléculas es un método atractivo para modificar las vías de señalización dentro de los islotes para producir proliferación12. El sistema también puede obviar la necesidad de reproducción transgénica al producir directamente un genotipo y fenotipo deseados dentro del páncreas. Las aplicaciones son innumerables.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores no tienen reconocimientos. Se recibieron fondos de la Fundación de la Comisión de Salud y Planificación Familiar de la provincia de Zhejiang (Grant 20146242) y la Fundación de la Oficina de Ciencia y Tecnología de Wenzhou (Grant Y20140248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (25 - 30g, 8-12 weeks old) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Ethanol (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Sterile Saline Solution | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Protective Equipment | |||
| Hair Removal Product | Nair or trimmer | ||
| Gauze Pads 2in x 2in | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Needles (30.5G and 25G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 and 305122 | |
| Syringe for Ketofen and Saline | Becton Dicksinson and Co. | 309657 | |
| Syringe for Pump | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Infusion Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Infusion Catheter | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Curved Bulldog Clamps (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Arruga Forceps | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Forcep | Roboz | RS-5234 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7882 | |
| Scissor | Roboz | RS-5982 | |
| Cotton Tip Applicators | Physician Sales and Services | 22-9988 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Suture | Owens and Minor | SXMD1B402 |
References
- Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells. Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).
- Raper, S. E., DeMatteo, R. P. Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas. Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).
- Xiao, X., et al. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).
- Song, Z., et al. EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice. J Biol Chem. 291 (43), (2016).
- Xiao, X., et al. M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).
- Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate. Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).
- Lichtenstein, A., et al. Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct. Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).
- Guo, P., et al. Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts. Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).
- Xiao, X., et al. Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas. J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).
