Summary
अग्नाशय वाहिनी जलसेक एक महत्वपूर्ण तकनीक है कि वंश ट्रेसिंग, जीन परिचय, और सेल लाइन विशिष्ट लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति दे सकते है । अग्नाशय की कोशिकाओं को दवा और वायरल वितरण के लिए एक अग्नाशय वाहिनी जलसेक तकनीक यहां प्रस्तुत की जाती है।
Abstract
अग्न्याशय एंडोक्राइन और एक्सोक्राइन दोनों घटकों के साथ एक द्विअध्यशील अंग है। कई विकृतियां अग्न्याशय को पीड़ित कर सकती हैं, जिनमें मधुमेह, अग्नाशय की बीमारी और अग्नाशय का कैंसर शामिल है। इन बीमारियों के सभी तीन अध्ययन के सक्रिय क्षेत्रों को चिह्नित, न केवल तत्काल चिकित्सा विकसित करने के लिए, लेकिन यह भी बेहतर उनके रोग विज्ञान को समझने के लिए । अध्ययन के इन क्षेत्रों को आगे बढ़ाने के लिए कुछ उपकरण हैं । अग्नाशय वाहिनी जलसेक एक महत्वपूर्ण तकनीक है कि वंश ट्रेसिंग, जीन परिचय, और सेल लाइन विशिष्ट लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति दे सकते है । तकनीक के लिए डुओडेनम और एम्पुला के दूसरे हिस्से के जटिल विच्छेदन की आवश्यकता होती है, जिसके बाद पित्त वाहिनी के ऑक्सीकरण और अग्नाशय वाहिनी के कैनुलेशन होते हैं। हालांकि तकनीक तकनीकी रूप से पहली बार में चुनौतीपूर्ण है, अनुप्रयोगों असंख्य हैं । समूहों के बीच प्रक्रिया की बारीकियों में अस्पष्टता एक मानक प्रोटोकॉल की आवश्यकता पर प्रकाश डाला । यह काम एक वायरल वेक्टर के अग्नाशय वाहिनी अर्क के बाद अग्न्याशय के भीतर एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) की अभिव्यक्ति का वर्णन करता है एक नकली सर्जरी बनाम GFP व्यक्त । जलसेक और इसलिए अभिव्यक्ति अग्न्याशय के लिए विशिष्ट है, किसी भी अन्य ऊतक प्रकार में मौजूद अभिव्यक्ति के बिना।
Introduction
अग्न्याशय एक द्विअध्यकार अंग है, जिसमें एंडोक्राइन और एक्सोक्राइन दोनों घटक होते हैं। कई विकृतियां अग्न्याशय को पीड़ित कर सकती हैं, जिनमें मधुमेह, अग्नाशय की बीमारी और अग्नाशय का कैंसर1शामिल है। इन बीमारियों के सभी तीन अध्ययन के सक्रिय क्षेत्रों को चिह्नित, न केवल तत्काल चिकित्सा विकसित करने के लिए, लेकिन यह भी बेहतर उनके रोग विज्ञान को समझने के लिए ।
एक लक्षित चिकित्सीय वितरण विधि फायदेमंद होगी। हमने एक अग्नाशय वाहिनी जलसेक तकनीक विकसित की है जो अग्नाशय की कोशिकाओं को दवा और वायरल वितरण के लिए एक प्रभावी और चयनात्मक विधि है। इस मॉडल में, अग्नाशय की नली चुनिंदा कैनुलेटेड है, और आम पित्त वाहिनी को ऑक्सलाइड किया जाता है, जो विशेष रूप से अग्न्याशय को वितरण के लिए अनुमति देता है।
यह तकनीक विशिष्ट कोशिका प्रकारों के वंश का पता लगाने की अनुमति दे सकती है ताकि अग्नाशय के विकास और विकृति 2,3के लिए महत्वपूर्ण विकासात्मकरास्तोंको और स्पष्ट किया जा सके । वायरल वैक्टर में विभिन्न प्रवर्तक कोशिका रेखाओं के विशिष्ट लक्ष्यीकरण और इन कोशिका रेखाओं में जीन की शुरूआत के लिए अनुमति देते हैं4,5. यह काम एक वायरल वेक्टर के अग्नाशय वाहिनी अर्क के बाद अग्न्याशय के भीतर एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) की अभिव्यक्ति को दर्शाता है एक नकली सर्जरी बनाम GFP व्यक्त ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी पशु प्रयोगों पिट्सबर्ग के बच्चों के अस्पताल और पिट्सबर्ग संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय में पशु अनुसंधान और देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. प्रीऑपरेटिव तैयारी
- नाक शंकु के माध्यम से इनसोफलुरेन (रखरखाव के लिए 1 - 3% और प्रेरण के लिए 5% तक) को उचित एनेस्थेटिक स्तर पर प्रशासित करें। संदंश के साथ अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की पर्याप्तता की निगरानी करें। प्रतिक्रिया की कमी को पर्याप्त माना जाता है, और सुनिश्चित करें कि अधिक ध्यान न दिया जाए, क्योंकि श्वसन अवसाद हो सकता है।
- उद्देश्य को ध्यान में रखते हुए पेट के साथ, विच्छेदन माइक्रोस्कोप चरण पर जानवर को अपनी पीठ पर रखें। सर्जिकल टेप के साथ जानवर को स्थिर करें। संज्ञाहरण के नीचे रहते हुए सूखापन को रोकने के लिए जानवर की आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं।
- बालों को हटाने क्रीम की एक चिकनी, मोटी परत लागू करें और इसे 3 मिनट के लिए जगह में छोड़ दें। बालों को हटाने के लिए एक छोटे से क्षेत्र की जांच करें। धीरे-धीरे 70% इथेनॉल से लथपथ धुंध के साथ क्रीम और बालों को मिटा दें।
- जानवर के पेट को 70% इथेनॉल से लथपथ धुंध से पोंछकर शुद्ध और कीटाणुरहित करें जिसके बाद बीटाडीन से लथपथ धुंध होती है। सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान बाँझ स्थितियों को बनाए रखें।
2. उचित एक्सपोजर
- एक स्केलपेल का उपयोग करके जाइफोड प्रक्रिया से लेकर एम्बिलिमिकस तक त्वचा में मिडलाइन चीरा लगाएं। एडसन संदंश के साथ पेरिटोनम उठाएं और कैंची का उपयोग करके मिडलाइन में एक छोटा छेद बनाएं।
- पेरिटोनियल चीरा को त्वचा चीरा की लंबाई तक बढ़ाएं, मिडलाइन (लाइना अल्बा) पर बने रहने का ख्याल रखते हुए।
नोट: यह एक ऊपरी मिडलाइन पेट लेप्रोटॉमी का उत्पादन करेगा। - आम पित्त वाहिनी को बेनकाब करने के लिए कुंद रिट्रैक्टर्स के साथ जिगर तरक्की। एक घुमावदार बुलडॉग वैस्कुलर क्लैंप के साथ आम पित्त वाहिनी क्लैंप करें।
नोट: यह पैंतरेबाज़ी जिगर में अवांछित जलसेक को रोकता है ।
3. अग्नाशय के पैपिला और डुओडेनोटॉमी की पहचान
- डुओडेनम की पहचान करें और, अरुगा संदंश के साथ, पैपिला प्रदर्शित करने के लिए इसे वापस लें।
नोट: पैपिला ग्रहणेर के दूसरे भाग की पूर्वकाल सतह पर एक सफेद स्थान है। - अग्नाशय वाहिनी के पाठ्यक्रम की पहचान के लिए अनुमति देते हुए, डुओडेनम कौडली को वापस लें। एक 301/2 गेज सुई के साथ, डुओडेनम की दीवार को सीधे पैपिला के सामने पंचर करें।
नोट: सुई वाहिनी के रूप में एक ही कोण का पालन करना चाहिए के रूप में यह duodenum में प्रवेश करती है ।
4. जलसेक।
- कैथेटर को चरण 3.2 में बनाए गए डुओडेनोटॉमी के माध्यम से पास करें जब तक कि कैथेटर वाहिनी के भीतर दिखाई न दे। मामूली डक्टल सहायक नदियों के बाईपास को रोकने के लिए कैथेटर को 1 सेमी से अधिक नहीं वाहिनी में आगे बढ़ाएं।
- एक दूसरे घुमावदार बुलडॉग वैस्कुलर क्लैंप के साथ कैथेटर को एक जगह पर क्लैंप करें। पंप चालू करें और चयनित मात्रा को डालने दें। संचार की मात्रा 25 - 250 माइक्रोन से हो सकती है, जिसमें लगभग 150 माइक्रोन की आदर्श मात्रा है।
- नुकसान की भरपाई के लिए खारा के लगभग 1.5 एमएल का इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन प्रशासित करें। आँभने की रोकथाम के लिए उजागर आंत्र को नम धुंध से ढकें।
- जलसेक के समापन पर, जगह में कैथेटर पकड़ रहा था कि बुलडॉग क्लैंप को हटा दें। अग्नाशय की नली से कैथेटर को धीरे-धीरे हटाने के लिए बुलडॉग क्लैंप का उपयोग करें। आम पित्त वाहिनी से क्लैंप जारी करें।
- पेरिटोनम और त्वचा को एक या दो परतों में एक चल रहे सीवन का उपयोग करके बंद करें।
नोट: डुओडेनोटॉमी को बंद करने की कोई आवश्यकता नहीं है, क्योंकि यह अपने आप सील कर देगा। - पश्चात एनाल्जेसिया के रूप में, प्रक्रिया के दौरान 5 मिलीग्राम/किलोग्राम पर केनोफेन की खुराक और अगले दिन एक को प्रशासित करें।
- माउस को एक गर्मी दीपक के नीचे अपने पिंजरे में तब तक लौटाएं जब तक कि यह ठीक न हो जाए। माउस को भोजन और पानी विज्ञापन लिबिटम प्रदान करें।
- जानवर को तब तक उपेक्षित न छोड़ें जब तक कि यह स्टर्नल रेक्यूबेंसी बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले। एक जानवर है कि अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी की गई है जब तक यह पूरी तरह से बरामद किया है वापस मत करो।
5. नमूना तैयार करना
- जानवर को कार्बन डाइऑक्साइड के कक्ष में रखें या सर्वाइकल अव्यवस्था करें।
- अग्न्याशय को, तिल्ली, यकृत और ग्रहणेन्म के साथ नियंत्रण के रूप में फसल करें। रात भर पैराफॉर्मल्डिहाइड में ऊतकों को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें। क्रायोप्रोटेक्ट नमूने को रातभर 30% सुक्रोज में, जैसा कि पहले6वर्णित था।
- स्नैप-नमूनों को फ्रीज करें। एक माइक्रोटॉम का उपयोग कर 6 माइक्रोन की मोटाई पर ऊतक अनुभाग। फ्लोरेसेंस इमेजिंग के साथ एक माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग करें, जैसा कि पहले7वर्णित है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
अभ्यास और सावधान शल्य चिकित्सा तकनीक के साथ, इन चूहों की जीवित रहने की दर 95% से अधिक होनी चाहिए। जलसेक के एक सप्ताह बाद, वांछित प्रभाव अग्न्याशय में स्पष्ट होना चाहिए। 10 से 12 सप्ताह की उम्र में चूहों का उपयोग अग्नाशय वाहिनी इन्फ्यूजन के लिए किया गया था। यहां हम एक नकली सर्जरी की तुलना में ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करने के लिए सीएमवी प्रमोटर के साथ एडेनो से जुड़े वायरस से जुड़े वायरस सेरोटाइप 8 (AAV8) का उपयोग करते हैं। चूहों अग्न्याशय को इन्फ्यूजन के 7 दिन बाद काटा गया था। अग्न्याशय, तिल्ली और डुओडेनम के वर्गों को इंसुलिन एंटीबॉडी और होश के साथ दाग दिया गया था। चित्रा 1 से पता चलता है कि चूहों में अग्न्याशय भर में GFP की व्यापक अभिव्यक्ति है कि AAV8 के साथ अग्नाशय वाहिनी जलसेक से गुजरना पड़ा, के रूप में उन है कि नकली सर्जरी से गुजरना करने का विरोध किया । इन चूहों में जिगर, तिल्ली या डुओडेनम में कोई अभिव्यक्ति नहीं है, इस प्रकार जलसेक की चयनात्मक प्रकृति का दस्तावेजीकरण होता है। इन डेटा डीएनए और आरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइल सहित कई अन्य तरीकों के साथ पुष्टि की जा सकती है।
चित्रा 1. अग्नाशय वाहिनी जलसेक के बाद जीएफपी की अभिव्यक्ति। (क) जीएफपी व्यक्त करने वाले एएवी8 के साथ अग्नाशय वाहिनी जलसेक की तुलना में शाम की सर्जरी । स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यह काम अग्नाशय वाहिनी जलसेक के पीछे की कार्यप्रणाली का विस्तार से वर्णन करता है, जो जीन और अन्य अणुओं के वितरण के लिए एक प्रभावी माउस मॉडल है, विशेष रूप से और प्रभावी रूप से अग्न्याशय के लिए। विभिन्न समूहों के बीच प्रक्रिया की बारीकियों में अस्पष्टता ने मानकीकृत प्रोटोकॉल 8 , 9,10की आवश्यकता पर प्रकाश डाला ।
प्रक्रिया के कई महत्वपूर्ण कदम हैं, जो युवा, स्वस्थ चूहों के चयन से शुरू होते हैं। डुओडेनम का छिद्र, हालांकि छोटा और नियंत्रित, माउस में एक दर्दनाक घटना है जो निस्संदेह भड़काऊ साइटोकिन्स और अन्य कारकों की भर्ती की ओर ले जाती है जिन्हें पूरी तरह से विशेषता नहीं दी गई है। इसलिए, एक नाजुक विच्छेदन महत्वपूर्ण है, जैसा कि कैथेटर की शुरुआत के लिए सबसे छोटी डुओडेनोटॉमी संभव बना रहा है। पूरी प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण कदम वितरण प्रणाली के साथ अग्नाशय वाहिनी का कैनुलेशन है।
अग्नाशय के पिपिला में अत्यधिक व्यवधान के साथ कठिनाइयां उत्पन्न हो सकती हैं, जिससे भारी प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया होती है। अग्न्याशय एक नाजुक अंग है; सर्जिकल समुदाय में, यह बोलचाल की तरह एक अंग के रूप में वर्णित है कि इसके साथ "गड़बड़" नहीं है। सफलता की दर केवल व्यवसाई कौशल स्तर के साथ थोड़ा भिन्न होगा। जब तक पित्त वाहिनी ठीक से ओक्लेड है, जलसेक अकेले अग्न्याशय के लिए विशिष्ट १००% हो जाएगा ।
प्रक्रिया के लिए सीखने की अवस्था काफी खड़ी है, और मुख्य सीमा अभ्यास के साथ दूर है। जैसा कि पहले कहा गया है, डुओडेनम और अग्न्याशय के अत्यधिक हेरफेर से भारी भड़काऊ प्रतिक्रिया हो सकती है जिसे टाला जाना चाहिए।
प्रक्रिया में कई अलग-अलग विषयों में व्यापक प्रयोज्यता है। इसका उपयोग विशिष्ट वायरल वैक्टर11के उपयोग के माध्यम से लक्षित जीन वितरण के लिए एक विधि के रूप में किया जा सकता है । प्रक्रिया अणुओं के विशिष्ट जलसेक के लिए भी अनुमति दे सकती है जो अग्नाशय कोशिका समारोह के स्पष्टीकरण में सहायता करते हैं। कुछ अणुओं का विशिष्ट वितरण12प्रसार का उत्पादन करने के लिए आइलेट्स के भीतर सिग्नलिंग रास्तों को संशोधित करने के लिए एक आकर्षक तरीका है । यह प्रणाली अग्न्याशय के भीतर सीधे वांछित जीनोटाइप और फेनोटाइप का उत्पादन करके ट्रांसजेनिक प्रजनन की आवश्यकता का भी निराकरण कर सकती है । आवेदन असंख्य हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों के पास कोई पावती नहीं है । वित्त पोषण झेजियांग प्रांत के स्वास्थ्य और परिवार नियोजन आयोग (अनुदान 20146242) और वेनझोउ विज्ञान और प्रौद्योगिकी ब्यूरो (अनुदान Y20140248) के फाउंडेशन से प्राप्त हुआ था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (25 - 30g, 8-12 weeks old) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Ethanol (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Sterile Saline Solution | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Protective Equipment | |||
| Hair Removal Product | Nair or trimmer | ||
| Gauze Pads 2in x 2in | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Needles (30.5G and 25G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 and 305122 | |
| Syringe for Ketofen and Saline | Becton Dicksinson and Co. | 309657 | |
| Syringe for Pump | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Infusion Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Infusion Catheter | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Curved Bulldog Clamps (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Arruga Forceps | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Forcep | Roboz | RS-5234 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7882 | |
| Scissor | Roboz | RS-5982 | |
| Cotton Tip Applicators | Physician Sales and Services | 22-9988 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Suture | Owens and Minor | SXMD1B402 |
References
- Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells. Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).
- Raper, S. E., DeMatteo, R. P. Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas. Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).
- Xiao, X., et al. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).
- Song, Z., et al. EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice. J Biol Chem. 291 (43), (2016).
- Xiao, X., et al. M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).
- Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate. Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).
- Lichtenstein, A., et al. Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct. Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).
- Guo, P., et al. Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts. Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).
- Xiao, X., et al. Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas. J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).
