Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat-Propidium-Iodid-Doppelfärbung in Cerebellar-Granulat-Neuron-Kultur

Lin Jiajia; Mak Shinghung; Zheng Jiacheng; Wang Jialing; Xu Dilin; Hu Shengquan; Zhang Zaijun; Wang Qinwen; Han Yifan; Cui Wei

doi:10.3791/55442

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Methodenartikel

Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat-Propidium-Iodid-Doppelfärbung in Cerebellar-Granulat-Neuron-Kultur

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DOI:

10.3791/55442

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10. Mai 2017

Lin Jiajia^*¹ , Mak Shinghung^*² , Zheng Jiacheng¹ , Wang Jialing¹ , Xu Dilin¹ , Hu Shengquan² , Zhang Zaijun³ , Wang Qinwen¹ , Han Yifan²^,⁴ , Cui Wei¹^,²

¹Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, ²Department of Applied Biology and Chemistry Technology, Institute of Modern Chinese Medicine, The Hong Kong Polytechnic University, ³Institute of New Drug Research, Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmacodynamic, Constituents of Traditional Chinese Medicine & New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, ⁴International Joint Laboratory (SYSU-PolyU HK) of Novel Anti-Dementia Drugs of Guangdong

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die genaue Messung der neuronalen Lebensfähigkeit mit Fluorescein-Diacetat (FDA) und Propidium-Iodid (PI) Doppelfärbung in kultivierten Zerebellar-Granulat-Neuronen, einer primären neuronalen Kultur, die als in vitro- Modell in der Neurowissenschaften und der Neuropharmakologieforschung verwendet wird.

Zusammenfassung

Primärkultivierte Cerebelläre Granulatneuronen (CGNs) wurden weithin als In-vitro- Modell in der Neurowissenschaften und der Neuropharmakologieforschung verwendet. Allerdings könnte die Koexistenz von Gliazellen und Neuronen in der CGN-Kultur zu Vorspannungen bei der genauen Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit führen. Fluorescein-Diacetat (FDA) und Propidium-Iodid (PI) -Phasenfärbung wurde verwendet, um die Zelllebensfähigkeit durch gleichzeitiges Auswerten der lebensfähigen und toten Zellen zu messen. Wir verwendeten FDA-PI-Doppelfärbung, um die Empfindlichkeiten der kolorimetrischen Assays zu verbessern und die neuronale Lebensfähigkeit in CGNs zu bewerten. Darüber hinaus haben wir blau fluoreszierende DNA-Flecken ( zB Hoechst) hinzugefügt, um die Genauigkeit zu verbessern. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Genauigkeit der Bewertung der neuronalen Lebensfähigkeit durch die Verwendung dieser Methoden in CGN Kultur zu verbessern. Mit diesem Protokoll kann die Anzahl der Gliazellen durch die Fluoreszenzmikroskopie ausgeschlossen werden. Eine ähnliche Strategie kann angewendet werden, um das unerwünschte Gli zu unterscheidenAl-Zellen aus Neuronen in verschiedenen gemischten Zellkulturen, wie primäre kortikale Kultur und Hippocampalkultur.

Einleitung

Farbmetrische zytotoxische Assays, wie der 3- (4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromid (MTT) -Assay, werden üblicherweise zur Messung der Zelllebensfähigkeit in vitro verwendet. Primäre kultivierte Cerebelläre Granulatneuronen (CGNs) von Ratten sind empfindlich gegenüber verschiedenen Neurotoxinen, einschließlich 1-Methyl-4-phenylpyridiniumionen, Wasserstoffperoxid und Glutamat ¹ ^, ² . Daher können CGN-Kulturen als In-vitro- Modell im Bereich der Neurowissenschaften eingesetzt werden. CGN-Kulturen können eine Vielzahl von Zellen enthalten, einschließlich Neuronen und ....