Summary
このプロトコールの目的は、前庭神経鞘腫およびシュワン細胞研究における複数の下流適用のためのヒト外科用サンプルの収集および処理を概説することである。
Abstract
前庭神経鞘腫は、脳脊髄の角度の最も一般的な新生物であり、すべての頭蓋内成長の6-8％を占める。これらの腫瘍は、冒された個体の最大95％において感音難聴を引き起こすが、この難聴の根底にある分子メカニズムは依然として分かり難い。この資料では、前庭神経鞘腫の研究に不可欠な下流の研究アプリケーションのための様々な初代ヒト組織サンプルの収集と処理を容易にするために、私たちの研究室で確立された手順を概説します。具体的には、この研究は、外科用試料からのシュワン細胞およびシュワン細胞腫細胞の収集、処理および培養のための統一された方法論的枠組みを記載する。これは、現在の研究にとって不可欠である平行処理工程と統合されています：腫瘍および神経分泌の収集、RNAの保存および収集された組織からのタンパク質の抽出、切片の調製のための組織の固定、d遺伝子療法への適用のためのアデノ随伴ウイルスへの一次ヒト細胞の曝露。さらに、この研究は、内耳および外リンパからヒトの感覚上皮を得る独特な機会として、この腫瘍を採取するためのトランスアラインメント手術アプローチを強調している。実験的品質を改善するためのヒントが提供され、一般的な落とし穴が強調表示されます。
Introduction
前庭神経鞘腫（VS）は小脳門角の最も一般的な新生物であり、10万人に1人と診断されている。非転移性ではあるが、これらの腫瘍は、患者の生活の質に1,2,3,4,5,6に深刻な影響を与える。冒された個人は、通常、難聴、耳鳴り、および聴覚充満の感覚で生きる。腫瘍が成長するにつれて症状がますます衰弱し、バランスの問題、顔面の麻痺、および他の脳神経機能の障害を引き起こす。脳幹圧迫による生命を脅かす複雑な合併症も起こり得る7 。
VSの管理オプションは、本質的に静的腫瘍および定位放射線療法または成長する腫瘍のための外科的切除を待つことに制限されている VSは末梢感覚神経（ すなわち、前庭神経）から生じるので、VS関連の観察を、人間の大耳神経（GAN）などの適切な制御神経から得られたものと比較することが重要である。健康なGANは、胸腺摘除術または頸部切開の間に定期的に屠殺され、健康なシュワン細胞生理学の頑強なモデルとして使用することができる9 。 散発性VSの治療または予防のためのFDA認可の薬物は存在しないため、研究者は根底にある分子メカニズムを解明することが不可欠です治療標的を同定するために疾患の病因を同定する。 VEGF、シクロオキシゲナーゼ2（COX-2）、核因子κB（NF-κB）、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、胃腸管壊死因子α（TNF-α）などのVS病因に役割を果たすことが示されているタンパク質は、 、表皮成長因子受容体（EGFR）、および関連するシグナル伝達分子10,11,12,13,14,15,16,17が含まれる。 最近の進歩は、初代ヒト前庭神経鞘腫および健康な神経組織の収集、処理、培養、および下流の調査のためのプロトコールを拡大および改良した18,19 。しかし、ほとんどの既存のプロトコルは、単一の下流の研究適用（ すなわち、細胞培養のみ）のためのそのような組織の導入。この記事では、細胞型特異的培養、タンパク質抽出、RNA保存、腫瘍分泌回収、および組織固定など、複数の下流アプリケーションのための単一の初代ヒトVSまたはGANサンプルの同時処理のための統一された方法論的フレームワークを提示します。これらの密接に関連した組織は、VSに対するバイオマーカーの重要な供給源として役立つ可能性があるので、この研究は、トランスアライントリンVS切除の間のヒト脳脊髄液（CSF）および外リンパ球の外科的採取および処理について詳述する。最後に、このプロトコールは、遺伝子治療に使用するためのこの組織の新規適用として、培養における初代ヒトVS細胞のウイルス形質導入のためのステップを提示する。
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Protocol
手術前にすべてのサンプルを収集するための書面による同意が得られ、実験は世界医師会（ヘルシンキ宣言）の倫理規定に従って実施された。研究プロトコールのすべてのセクションは、マサチューセッツ州眼科学部審査委員会、マサチューセッツ総合病院によって承認された。
注：以下のセクション1-7は、手術室からの一次ヒトVSまたはGANサンプルの受領時に順次実行されるように設計されています。処理は常にセクション1から開始する必要があります。次に、原則として、RNAを最初に保存し（セクション2）、次に分泌物の収集（セクション3）およびタンパク質抽出（セクション4）のための組織の調製を行う。培養される組織（VSについてはセクション5、GANについてはセクション6）は、補充された培養培地中に置かれ、セクション2,3および4が行われる。切片化（セクション7）のための組織の固定は非常に短く、c任意の遠心分離工程中に実施され得る。トランスアラインメントVS切除の間、手術室からの外リンパまたはCSFの受け取り時に、セクション8（外リンパ処理）およびセクション9（CSF処理）を行うことができる。セクション10（ウイルス形質導入）は、培養中の増殖するVS細胞またはシュワン細胞上で行うことができる。
1.手術用サンプルの準備と受領
注：以下のステップは、組織培養フードまたは層流フードなどの滅菌環境で行われます。基本的な滅菌技術に精通していることが期待される。
- 初代ヒトVSまたはシュワン細胞培養用培地の調製
- 37℃の水浴中で凍結ウシ胎児血清（FBS）の50mLアリコートを解凍する。
- 5mLのペニシリン/ストレプトマイシン混合物を500mLのDMEM / F-12ボトルに加え、最終希釈を1：100とする。
- 50mLの融解したFBSをDMEM / F-12の500mLボトルに添加し、1:10の最終希釈をもたらす。
- ボトルに日付、研究者のイニシャル、補足情報（ 例： 1％P / S、10％FBS）を記入してください。
- 新しい培地を冷蔵庫に入れます（4℃）。
- VSまたはGANサンプルの受け取りと清掃
- 手術室で、採取したばかりのVSまたはGANサンプルを検体容器内の滅菌生理食塩水に入れます。サンプルを氷上で手術室から実験室の層流フードに移す。
注：サンプルサイズおよび体重は、関連する腫瘍のサイズまたは切除された神経の量に基づいて患者間で著しく異なる。 - 冷凍庫からのヒアルロニダーゼ（25,000U / mL）およびコラゲナーゼ（3,200U / mL）のストック溶液アリコートを除去し、酵素が室温で解凍されるようにする（試料の有無に応じてステップ5.1.4または6.1.6で必要とされる）。 VSまたはGAN）。
注：凍結乾燥酵素iの再懸濁詳細は製品情報シートに記載されています。コラーゲナーゼは、0.02Mリン酸緩衝液（pH7.0）、77mM NaCl、および0.01％1mg / mLウシ血清アルブミンの溶液中のカルシウム非含有平衡塩溶液およびヒアルロニダーゼに再懸濁することができる。各凍結乾燥酵素の比活性はロットによって異なり、再懸濁前に確認する必要があります。 - 1.4 mLの1×滅菌PBSで満たした一連の1.5 mLチューブ3本を使用して、VSまたはGAN検体を3回洗浄する。滅菌鉗子を用いて、チューブからチューブへ検体を注意深く移す。試験片が入ったら各チューブを閉じ、静かに振とうして洗浄する。
注：1.5 mLのチューブに溢れないようにするには、腫瘍片が大きい場合は、チューブあたり1.4 mL未満のPBSを使用できます。 - サンプルを乾燥した60mmのペトリ皿に入れ、鉗子を使って死んだ組織（通常は白色または不透明な焼灼部分）および顕著な血管がある部分をすべて除去する。
- fを使うサンプルをRNA保存、タンパク質抽出、分泌収集、固定、および細胞培養のために別々の断片に分割するためのオーペスまたはメスブレード（下記のセクション2〜6参照）。
- 5〜8mLの冷たい補充DMEM / F-12培地を含む新しい60mm培養皿に、細胞培養用に指定された標本片（セクション5/6）を移す（あるいは、最初の培養皿の蓋は、このステップで使用されます）。
注：必要なDMEM / F-12培地の量（ステップ1.1から）は、腫瘍または神経の大きさに依存しますが、5〜8 mLにする必要があります。この断片は、その後の工程が行われている間に培地中に置かれ得る。
- 手術室で、採取したばかりのVSまたはGANサンプルを検体容器内の滅菌生理食塩水に入れます。サンプルを氷上で手術室から実験室の層流フードに移す。
2. VSおよびGAN組織のRNA保存（ヒト感覚上皮でも有効）
- 層流フードの下で、1.5mLチューブにRNA安定化溶液を1〜2mL移す。
- PBSで検体を洗浄した後（ステップ1.2.3）、小さなパイRNA保存用に設計された組織（VSの約3mm 3またはGANの5mm長）をRNA安定化溶液に添加した。試験片が溶液に完全に浸漬されていることを確認する。
- 新しい1.5 mLチューブを準備し、ラベルを貼ります。 RNA安定化溶液から検体を回収し、新しいチューブに移し、-80℃の冷凍庫に保存します。
3. VSおよびGAN分泌物の収集
- 1日目
- PBSで検体を洗浄した後（ステップ1.2.3）、分泌物収集用に指定したVSまたはGANのピースを空の1.5mLチューブに入れます。
- 2つの追加の1.5mLチューブを準備し、500μLのDMEM（FBSを補充しない）を各チューブにピペットで入れる。
注：DMEMの最初のチューブは腫瘍分泌物を収集するために使用され、DMEMの第2のチューブは適合したコントロールとして役立つ。分泌物は、DMEM、他の典型的な培地血清、またはPBSを補充した。 - DMEMを含むチューブの1つを較正されたデジタルスケールに置きます。チューブを目盛りの上に置くと、0mgが読み込まれるように目盛りをつけます。
- スケールからDMEMのチューブを取り出し、分泌物の採取のために指定された検体片をチューブに入れ、計量する。その結果は組織の重量だけを表します。
- 層流フードの下で、チューブ内のDMEMの容量を検体10mgあたり100μLに調整する。
- この実験の計画と一致する期間インキュベーター（37℃、5％CO 2 ）に、組織サンプルとその適合対照（DMEM単独）を入れたチューブを置く。生物学的に有用な量の腫瘍または神経分泌物を収集するために、少なくとも72時間組織をインキュベートする。
- 4日目
- 72時間のインキュベーション後、分泌物含有培地を1mLのピペットを用いて検体（ すなわち、組織馴化培地）に移した。反復凍結融解サイクルを防ぐために、計画された下流分析（ 例えば、 50μLを必要とする4つのウェルを有するELISAを実行するために、210μLのアリコートを調製することができる）に従って培地を新しいチューブに等分する。
- 必要に応じて、元のチューブ（すでに1日目に表示されている）に残っている組織片を-80℃で凍結させて、DNA抽出などの追加分析を行います。
- 下流のアプリケーションが開始されるまで、組織、分泌物およびコントロールDMEMを-80°Cの冷凍庫に保存します（ELISA、LC-MS / MS、サイトカインアレイなど ）。
4. VSまたはGAN組織からのタンパク質抽出
- 強化RIPA緩衝液の調製
- ホスファターゼ阻害剤1錠およびプロテアーゼ阻害剤1錠を、15mLチューブ中の10mLのRIPA緩衝液に添加する。これは強化されているRIPAバッファ。
注：RIPAバッファーを4℃で保存し、使用直前に錠剤を加えます。
- ホスファターゼ阻害剤1錠およびプロテアーゼ阻害剤1錠を、15mLチューブ中の10mLのRIPA緩衝液に添加する。これは強化されているRIPAバッファ。
- タンパク質抽出
- 強化されたRIPAバッファー（ステップ4.1.1）210μLを新しい1.5mLチューブに移す。
- PBSで検体を洗浄した後（ステップ1.2.3）、タンパク質抽出用に指定された小片の組織（VSの約3mmまたはGANの5mmの長さ）をRIPA緩衝液含有チューブに移し、氷上に置きます少なくとも10分間。リン酸化された形態のタンパク質を研究する場合は、RIPAバッファーにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を補充する。その間に、固定（セクション7）のような組織処理の他の成分のためのステップを実施することができる。
- 遠心分離機を4℃に予冷します。
- プラスチック製の乳棒を使用して、RIPA緩衝液含有チューブ内の組織を均質化する。 20％振幅で10-15秒間組織を超音波処理する。試験片超音波処理中でさえ、氷上に残る。
- 15,000 xgおよび4℃で10分間遠心分離する。
- 上清を新しい0.5mLチューブに50μLずつ分注します（目的の下流アプリケーションに応じて、任意の増分サイズを選択できます）。
- 下流のアプリケーションが開始されるまで、タンパク質溶解物のアリコートを-80℃の冷凍庫に保存する（ 例えば、 ELISAまたはウエスタンブロット） 20,21 。
5.一次ヒトVS培養
- 1日目
- 各手の一対の鉗子を使用して、細胞培養（ステップ1.2.6に記載されているように培地中に座っている）用に指定されたVS組織を約1mm 3個に分離する。
- 10mLの血清学的ピペットで腫瘍片含有培地を吸引し、すべての内容物を15mLコニカルチューブに移す。
- 3分間遠心分離する。1,000 xgおよび25℃。
- 補充されたDMEM / F-12培地4.7mLとコラゲナーゼ（最終濃度160U / mL）250μLとヒアルロニダーゼ（最終濃度250U / mL）50μLを混合することにより、新しい60mm培養皿で崩壊培地を調製する。最終容量は5mLとした。
注：両方の酵素は-20℃の冷凍庫に保存する必要がありますが、この培地を調製する前に解凍してください（ステップ1.2.2）。 - 遠心分離後、腫瘍片は円錐管の底にペレットを形成する。慎重にピペットで取り出し、上清を捨てる。
- 新たに作製した酵素含有崩壊培地（ステップ5.1.4）2mLを腫瘍ペレットに加える。ピペットを数回上下に動かして組織を動員し、腫瘍片含有培地を60mm培養皿に移す。
- 培養皿をインキュベーター（37℃、5％CO 2 ）に18時間置く。
- 2日目
- 温かいD37℃の水浴中で10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシン（工程1.1で調製した）を添加したMEM / F-12培地中で培養した。
- インキュベーターからVS培養液を含むペトリ皿を取り除く（ステップ5.1.7）。 6 mLのシリンジに取り付けられた22 Gの針を使用して、培養液を吸引し、新しい15 mLコニカルチューブに移す。
- 1000 xgおよび37℃で5分間遠心分離する。
- その間に、滅菌鉗子を使用して、必要な数のポリ-D-リシン - およびラミニン - 被覆ガラスカバースリップを24ウェル培養プレートに入れる。
注：培養するウェルの数は、検体のサイズに依存します。 1cm 3の腫瘍から約24〜32ウェルを培養することができるので、ほとんどのより小さな腫瘍では、8〜16ウェルの培養細胞を計画することが適切である。 - 遠心分離後、上清（ すなわち、酵素が豊富な培地）を捨て、新鮮な補充DMEM / F-12培地に残存細胞ペレットを再懸濁し、予め温めておくステップ5.2.1でed。
注：ペレットを再懸濁する容量は、5.2.4で計画されたウェルの数によって決定され、1ウェル当たりの培地1mLを見積もります。 - 5mLの血清学的ピペットを用いて、再懸濁した細胞培地（ステップ5.2.5）2mLを吸引する。腫瘍細胞含有培地1mLを24ウェルプレートの各調製ウェルに寄託する。
- 腫瘍細胞懸濁液が調製された全てのウェルの間で均等に分割されるまで、腫瘍細胞含有培地を吸引して析出させる（1mLを各ウェルに入れ、2mL刻みで吸引する）。
- 24ウェルプレートを37℃のインキュベーターに一晩置いてください。
- 3日目
- 有意な破片がウェルの底に記載されている場合は、接着細胞を除去しないよう注意しながら、各ウェルの培地を新しい補充DMEM / F-12培地に注意深く交換してください。そうでない場合は、インキュベーターにプレートを戻し、5日目に初めて培地に添加した。
- 5〜7日後
- 3日ごとに培地を交換する。
注：初代ヒトVS細胞およびGAN細胞は、一般に、14日齢またはそれ以降の川下での使用まで、培養中で維持される。この後に培養純度が低下する19 。
- 3日ごとに培地を交換する。
6.一次ヒトGAN培養
- 1日目
- 解剖顕微鏡の下で、GAN培養（ステップ1.2.6に概説されるように培養培地中に座っている）に指定された組織からファンシクルを単離する。
- epineuriumと線維鞘から皮を単離してください。 5つの鉗子を使用してepineuriumをつかみながら。 3鉗子。
- 包皮が周囲のエピネウムから十分に単離されたら、それらを2mLの新鮮なsupを含む新しい培養皿に移す。補完された培地。
- メスを使って1〜2 mmのセグメントに束を切断します。
- 15mLのチューブの総容量が5mLになるように、新鮮な補充培地3mLを含む15mLのチューブに、小さな包皮片および周囲の培地をピペットで入れる。
- 1,000×gおよび25℃で3分間試料を遠心分離する。
- その間に、補充されたDMEM / F-12培地4.7mL、コラゲナーゼ250μLおよびヒアルロニダーゼ50μLを最終容量5mLに合わせて新しい60mmペトリ皿にシュワン細胞培養培地を作製する。
注：両方の酵素を-20℃で保存する。この培地を調製する前にそれらを室温で解凍する（工程1.2.2）。 - 検体を遠心分離した後、束はコニカルチューブ内の小さなペレットに凝縮する。上清を捨てる。
- 新たに作製した酵素含有崩壊培地（ステップ6.1.6）2mLを神経ペレットに加える。ピペットアップとd組織を動員し、それを新しい60mm培養皿に移すために何回か所有する。
- インキュベーター（37℃、5％CO 2 ）に20〜22時間皿を置きます。
注：これは、VSサンプル（ステップ5.1.7）に必要なインキュベーションより長いインキュベーションです。
- 解剖顕微鏡の下で、GAN培養（ステップ1.2.6に概説されるように培養培地中に座っている）に指定された組織からファンシクルを単離する。
- 2日目
- 37℃の水浴中で補充したDMEM / F-12培地を温める。
- 6mLシリンジに取り付けられた22G針を用いて、細胞培養液を吸引し、新しい15mLコニカルチューブに移す。
- 1000 xgおよび37℃で5分間遠心分離する。
- 上清を捨て、予熱して補充した新しいDMEM / F-12培地にサンプルを再懸濁する。
- 滅菌鉗子を使用して、必要な数のコーティングされたカバースリップを24ウェル培養プレートのウェルに置く。
注：1cmの神経標本あたりの培養細胞の2つのウェルを計算することにより、丈夫な培養増殖が促進される。 - 各培地に1mLの培養液を加え24ウェルプレートでよく指定された。
- 37℃および5％CO 2インキュベーターに24ウェルプレートを置きます。
- 3日目
- 重大な破片がウェルに記載されている場合は、付着した細胞を除去しないよう注意しながら、培地を新しい補充DMEM / F-12培地で注意深く交換してください。そうでない場合は、インキュベーターにプレートを戻し、5日目に初めて培地を交換する。
- 5〜7日後
- 3日ごとに培地を交換する。
VS＆GAN組織固定
- 新しい1.5mLチューブに4％パラホルムアルデヒド（PFA;注意）1.1.2mLをピペットで注入する。
- PBS（ステップ1.2.3）で腫瘍または神経を洗浄した後、4％PFAに小片の組織（VSの約3mm 3またはGANの5mm長さ）を移し、4°の振とう器C.試料が完全に浸漬されていることを確認する彼の解決策。
- 少なくとも2時間の固定後、シェーカーからチューブを取り出し、さらなる処理（ 例えば、その後の免疫組織化学または免疫蛍光のためにパラフィンまたは最適切断温度化合物（OCT） に埋め込む） 22,23,24を続ける。あるいは、前述のように組織をスナップ凍結することができる（ 25,26） 。
Translabrinthine VS切除術の間のヒトの外リンパの採取と保存
- 氷上に3本の滅菌1.5mLチューブを置きます。
注：汚染の場合は、1本のチューブをバックアップとして保管します。 - 0.22μmフィルターを使用して2回ろ過されたPBS溶液約1.2 mLを1本の1.5 mLチューブに満たします。
注：translabyrinthine VS切除の間に外リンパを収集するためには、外科医は、まず外科医カルフィールドは骨の塵、血液、または生理食塩水を含まない。外科医は、この目的のために非支配的な手でSchuknecht 21または24 G吸引チューブを使用することができる。
外リンパを抽出する典型的な場所は、外側の半円形の管である（ただし、外科医の好みに応じて、後方の半円形の管または円形の窓の膜にアクセスすることもできる）。外科医は、半円形の管の青い線（ すなわち、膜状の迷路）を識別するために、ダイヤモンドバーで迷路骨を注意深く除去しなければならない（連続吸引灌流を使用している間）。半円形の管は、1mLのツベルクリン注射器に取り付けられた長い27Gの針を使用して、青い線を貫通する。 - 外科医に、少量の外リンパを静かに吸引し、注射器と付属の針を外科看護師に渡すように依頼します。
注：一般的に、外リンパ液滴またはそれ以下の液滴が集められる。観察された体積が大きい場合、試料は他のfルイード。 - 調製した空の1.5mLチューブを開き、使用前にチューブをPBSで満たしてください。チューブのふたを開けているときは、チューブのふたの内側に触れないように注意してください。
- 外科用看護師から注射器と付属の針を受け取り、針で管自体に触れないよう注意しながら、液体を空の管に完全にパージします。
- 針を注射器から慎重に外す。針の先端を汚染しておらず、片手で持ち続けてください。
注：非常に少量の外リンパが収集されているため、針の長い先端に液体が残ることがあります。 - 一方、シリンジ自体（針なし）を使用して、調製したチューブから0.2mLの濾過したPBS溶液を注射器の本体に吸引する。
- シリンジに針を取り付けます。針の先端を洗い流すために滅菌PBSを使用して、外リムを含むチューブに注射器を完全に排気する。
- 外リンパ液およびPBS含有チューブを閉じて、それは氷の上にある。
- 針をシャープ容器に入れて廃棄してください。
- できるだけ早く、外リンパを含むチューブを-80℃の冷凍庫に入れます。
9.ヒトCSFの採取と保存
- 氷上に3本（またはそれ以上）の滅菌1.5mLチューブを置きます。
注：1本のチューブは、汚染されている場合、またはサンプル量が予想よりも多い場合にバックアップになります。 - 硬膜を開けたら、外科医にCSFを3 mL注射器（針が付いていない）で採取するように頼んでください。
注：汚染を防ぐために、脳脊髄液の採取は硬膜を開けた直後に行うべきである。 - 外科医に注射器を外科看護師に渡すように依頼します。
- 外科用看護師から注射器を受け取り、必要な量のCSFをチューブに完全に排出させます。
- チューブを閉じて氷上に置きます。
- チューブをできるだけ早く-80°Cの冷凍庫に入れてください。
- ウイルスストック濃度を基準として、提案された形質導入実験に必要な所望のゲノム数（gc）数および感染多重度（MOI）を計算する。ウイルスストックを補充された培地に直接希釈することができる。
注：一次細胞形質導入に適したウイルスベクターを用いることができる。 Landegger et al。 （2017）、6つの異なるアデノ随伴ウイルス血清型の詳細な比較27 。さらに、初代ヒト細胞を培養する場合、細胞数は、カバーグラス上にプレーティングする前に典型的に決定されない。一次VS細胞は、トリプシン処理および継代にはうまく反応しないので、信頼できるMOI計算のために、ウェル当たりの接着細胞の数は、位相差顕微鏡を用いて推定することができる。あるいは、細胞がコンフルエントに近い場合、それらの数は、標準的な細胞密度値を用いて24ウェルプレート（ 例えば、 1ウェルあたり5×10 4個の細胞）。 - 層流フードの下で、15mLコニカルラボチューブ中の所望量のウイルスを含む補充培地を調製し、1mLのウイルス含有培地を形質導入される細胞の各ウェルに対して調製する。ウイルスを含む培地を上下にピペットで静かに徹底的に混合する。
- 滅菌鉗子を使用して、元の24穴プレートから新しい24穴プレートに一次VS細胞（ステップ5.2.8）を含むカバースリップを移す。各カバースリップを移した後、1mLのウイルス含有培地を加える。細胞がウイルスで均一にコーティングされるように培地を添加するたびにプレートを渦巻きにします。
- 計画された実験期間中、37℃、5％CO 2でインキュベートする。
注：48〜120時間のインキュベーションは、すべて有望な形質導入結果を示している27 。
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Representative Results
セクション5で確立されているように、培養中の初代ヒトVS細胞は、多くの下流の研究アプリケーション（ 図1 ）において疾患関連プロセスの有益なモデルとして扱うことができる。第6節で培養された健康なシュワン細胞は、直接的で教示的な比較点を提供する。以下に概説するように、統一された方法論的フレームワークに従って処理されたVSおよびGANからの広範なデータは、以前に公開された12,13,14,15,27の複数の記事で利用可能である。
遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスによる初代VS細胞の形質導入が初めて成功した（ 図2 ）。一次VS細胞を培養液で形質導入したアデノ随伴ウイルスの予測祖先であるGFP発現Anc80 28 。 Anc80は、インビトロおよびインビボでネズミの蝸牛組織における遺伝子伝達のための最大効率的なベクターであることが示されている27 。このベクターを用いた初代ヒト細胞の効果的な形質導入は、VSのための遺伝子治療への将来の進出に重要な意味を有する。
図1：初代ヒト前庭シュワン細胞腫培養の明視野画像。
培養中のVS細胞の組織における典型的なパターンを同定することができる。スケールバー=200μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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図2：250,000の感染多重度（MOI）で48時間、GFP発現Anc80に暴露した後の初代ヒト前庭シュワン細胞腫培養物の代表的な免疫蛍光画像。
グリーン= GFP;赤色=ファロイジン/ F-アクチン（細胞骨格を染色する）。青色= DAPI（核を染める）。スケールバー=50μm（A）および100μm（B）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この原稿は、VS研究のための統一された方法論的枠組みを記述し、下流の研究の応用のためにヒトVSとGAN標本の同時処理を概説している。 VS研究が精密医学の時代に入っても、多数の研究問題に答えることができる形で同じサンプルを調製することで、個々の患者に特有の分子、細胞、遺伝子、プロテオームの洞察を発見することができます。
ヒトSchwann細胞およびVS培養物の純度は、S100マーカーについて陽性である細胞とDAPI核染色で陽性である細胞の比を用いて、免疫細胞化学法により経時的に徹底的に評価された19 。したがって、これらの細胞の純度がこの期間中最高であるため、細胞をプレーティングした後最初の2週間以内に初代ヒトシュワン細胞培養物について実験を行うことが推奨される。その後、線維芽細胞様細胞が優勢となる。あなたgh VS細胞培養物もまた培養中2週間で最大限に純粋であり、VS細胞は接触媒介性阻害を欠き、後期段階で増殖を継続する。さらに、VS組織からのタンパク質発現（セクション4）および同じ腫瘍由来の培養におけるVS細胞（セクション5）の直接的なマイクロアレイ比較は、VS培養物が、それらのそれぞれの親腫瘍と満足できる高レベルの生物学的類似性を示すことを首尾よく示した19 。関心のあるタンパク質の定量化は、セクション4で生成したタンパク質溶解物のウェスタンブロットと、RNA安定化溶液（セクション2）12,13,14で保存した組織から抽出したRNAのqRT-PCRによるRNA転写物の定量化によって行うことができます。
培養中のVSおよびGAN細胞は、化学的に活性な物質、例えば非ステロイド系抗炎症薬、（siRNA）、または天然有機化合物を用いて疾患特異的分子メカニズムを解明するか、または治療標的を試験することができる13,14,29。目的の化合物は、通常の補充培養培地中で適切に希釈した後、培養中の細胞に直接添加することができる。細胞生理学の重要な局面におけるこのような物質の影響を評価するために、増殖のためのブロモデオキシウリジン（BrdU）標識、アポトーシスのための末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識（TUNEL）、および3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）代謝生存性のための2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）の還元は、これらの細胞19に対して信頼性をもって使用できる信頼できるアッセイである。処理された細胞からの培養培地も注意深く吸引し、-20℃で保存し、プロスタグランジンE2のような分泌物質の相対レベルを定量するために試験する。薬物治療の影響を受ける13 。さらに、組織固定（セクション7）およびその後のOCTまたはパラフィンへの埋め込みは、免疫蛍光アッセイ13,14のための堅牢な基質を提供する。
セクション3で生成された腫瘍または神経馴化培地は、VS分泌された可溶性分子を評価し、細胞外小胞を抽出するための単純で効果的な方法を提供する。サイトカインアレイまたはELISAは、2つの公表された研究9,12に概説されている製造業者のプロトコールに示されているように、これらの分泌物に対して実施することができる。細胞外小胞は、以前の刊行物30に詳述されているように、超遠心分離を用いてこれらの分泌物から精製することができる。あるいは、分泌物自体は、下流の研究用途のための患者特異的試薬として使用することができる。たとえば、VSに関連する感音難聴の根底にある新たなメカニズムの中で、聴覚の悪い患者のVS組織およびDMEM中で72時間のインキュベーション後の良好な聴力を有するVS患者から分泌物を収集した（セクション3）。これらの腫瘍分泌物をネズミの蝸牛外植片に適用したところ、聴力の低いVS患者の腫瘍分泌物は、聴覚が良好なVS患者の分泌物よりも、蝸牛外植片に大きな損傷を与えた。重要なことに、72時間前の時点で収集された分泌物は、実質的な損傷をもたらさなかった。
translabyrinthine VS切除（セクション8）を受けている患者から収集されたヒトの外リンパは、VSバイオマーカーの発見のための刺激的な新しい道筋を表す。第8章で採取した検体を液体リンパ液のタンデム質量分析法（LC-MS / MS）により分析し、ヒト外リンパのプロテオームをマッピングし、VSのバイオマーカー候補のうち15個歯科医31 。 VS患者から採取したヒトCSFを用いて同様の分析が可能であった（セクション9）。
VS研究における重要な考慮点は、適切な制御組織の選択である。以前の研究では、蝸牛神経、前庭神経、無関係の末梢神経（坐骨神経など）を用いて様々な効果が得られている22,32 。しかし、いくつかの理由は、最大限に関連するコントロールとしてのGANの使用を支持する15 。前庭神経と同様に、GANは、末梢感覚神経であり、軸索はシュワン細胞によって覆われている。重要なことに、文献検索により、シュワン細胞腫がGANから発生することは決して見出されておらず、この組織における新生物の変化は起こりえないことが明らかになった。さらに、より深い首の構造にアクセスするときには、GANは定期的に犠牲になり、病院に拠点を置く研究者は健康に簡単にアクセスできます頸部の切開および耳下腺摘除術の間に採取した。蝸牛神経は、VS手術中にしばしば犠牲にされ、容易に利用可能であるが、前庭神経に近接することは、同じ微小環境の共有を危険にさらし、前腫瘍性分子変化を示す可能性がある33 。他の研究所も、VS研究の適切なコントロールとしてGANをうまく利用しており、このプラクティスを20,21,22,34続けることが推奨されています。
細胞型特異的培養プロトコール（第5章および第6章）内で重要であるがしばしば見過ごされているステップの1つは、生存不能な組織および血管の適切な除去である。これらの非腫瘍組織の除去は、最大の純度の堅牢な培養物を生成するために重要である。さらに、カバーガラス上に細胞含有培地をプレーティングする場合、各ウェルに移された組織の量に細心の注意を払う。各ウェル中の密度の高い組織の少数の「チャンク（chunks）」を含む細胞の均一で、穏やかな密度分布を達成することは、繁殖するのに十分な数の接着細胞を必要とするシュワン細胞にとって特に重要である。カバースリップをポリ-D-リジンおよびラミニンで被覆することによって、細胞の効率的な増殖が可能になる。市販のプレコート製品と比較して、カバースリップが実験室でコーティングされた場合、細胞はより強固に増殖する。
高品質のタンパク質とRNAの抽出を確実に行うためには、組織がセクション2と4の間で4℃以下の温度にとどまることを確認する。さらに、VS分泌の分析に関する文献は不十分であるため（セクション3）、新しいプロジェクトではさらなる革新とインキュベーションの異なる長さ。
VSの病原体を扱う方法が進歩し続ける中、このstrの使用基本的な技術の組み合わせにより、単一のヒト試料から最大量の情報を収集することが可能になる。 VSおよびGAN組織の情報に基づく同時処理は、この衰弱性腫瘍に対する効果的な薬理学的および遺伝的療法の生成にとって不可欠であることが証明される。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この作業は、国立難聴者協会のR01DC015824（KMS）およびT32DC00038（JESおよびSDをサポート）、国防総省のグラントW81XWH-14-1-0091（KMS）、Bertarelli財団（KMS） 、ナンシーセイレスデー財団（KMS）、ラウアー耳鳴り研究センター（KMS）、およびバーンズ財団（KMS）が含まれます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 mL | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0 mL Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline - 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 mL | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 mL, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 mL | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 mL | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
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