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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Un cadre méthodologique unifié pour la recherche sur le schwannome vestibulaire

Published: June 20, 2017 doi: 10.3791/55827
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4, 1,4, 1,2, 1,2, 1,2,4
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Le but de ce protocole est de décrire la collecte et le traitement des échantillons chirurgicaux humains pour de multiples applications en aval dans le schwannome vestibulaire et la recherche de cellules Schwann.

Abstract

Les schwannomes vestibulaires sont les néoplasmes les plus courants de l'angle de la cerebellopontine, ce qui représente 6 à 8% de toutes les croissance intracrânienne. Bien que ces tumeurs provoquent une perte auditive sensiveureure chez 95% des personnes affectées, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent cette perte auditive demeurent insaisissables. Cet article décrit les étapes établies dans notre laboratoire pour faciliter la collecte et le traitement de divers échantillons primaires de tissus humains pour les applications de recherche en aval intégrées à l'étude des schwannomes vestibulaires. Plus précisément, ce travail décrit un cadre méthodologique unifié pour la collecte, le traitement et la culture des cellules Schwann et Schwannoma à partir d'échantillons chirurgicaux. Ceci est intégré aux étapes de traitement en parallèle, maintenant considérées comme essentielles pour la recherche actuelle: la collecte des sécrétions tumorales et nerveuses, la préservation de l'ARN et l'extraction des protéines des tissus collectés, la fixation du tissu pour la préparation des sections,D l'exposition des cellules humaines primaires aux virus adéno-associés pour l'application à la thérapie génique. En outre, ce travail met en évidence l'approche chirurgicale translymérine pour collecter cette tumeur comme une occasion unique d'obtenir l'épithélium sensoriel humain de l'oreille interne et de la périlymph. Des conseils pour améliorer la qualité expérimentale sont fournis et les pièges courants sont mis en évidence.

Introduction

Les schwannomes vestibulaires (VS) sont les néoplasmes les plus fréquents de l'angle de la cerebellopontine, diagnostiqués chez 1 sur 100 000 individus. Bien que non métastatiques, ces tumeurs affectent sévèrement la qualité de vie du patient 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Les personnes touchées vivent généralement avec une perte auditive, un acouphène et un sentiment de plénitude auditive. Les symptômes deviennent de plus en plus débilitants à mesure que la tumeur augmente, provoquant des problèmes d'équilibre, une paralysie faciale et une altération d'autres fonctions du nerf crânien. Des complications potentiellement mortelles dus à la compression du tronc cérébral peuvent également entraîner 7 .

Les options de gestion des VS sont essentiellement limitées à l'attente vigilante de tumeurs statiques et de radiothérapie stéréotaxique ou de résection chirurgicale pour les tumeurs croissantes

Parce que les VS proviennent d'un nerf sensoriel périphérique ( c.-à-d. Le nerf vestibulaire), il est important de comparer les observations associées aux VS avec celles issues d'un nerf témoin approprié, comme le nerf auriculaire humain (GAN) humain. Les GAN sains sont régulièrement sacrifiés lors de la parotidectomie ou des dissections cervicales et peuvent être utilisés comme modèles robustes pour la physiologie des cellules Schwann saines 9 .

Étant donné qu'il n'y a pas de médicaments approuvés par la FDA pour le traitement ou la prévention de VS sporadiques, il est impératif que les chercheurs élucient les mécanismes moléculaires sous-jacentsNismes de la maladie pour identifier les cibles thérapeutiques. Les protéines qui ont montré qu'ils jouent un rôle dans la pathogenèse VS comprennent le Merlin, le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), la cyclooxygénase 2 (COX-2), le facteur nucléaire kappa B (NF-κB), le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) , Le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), et les molécules de signalisation connexes 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Des avancées récentes ont élargi et amélioré les protocoles pour la collecte, le traitement, la culture et l'étude en aval des schwannomes vestibulaires humains primaires et des tissus nerveux sains 18 , 19 . Cependant, la plupart des protocoles existants sont conçus pour accueillir la préparationDe ces tissus pour une seule demande de recherche en aval ( c.- à-d. Culture cellulaire seule). Cet article présente un cadre méthodologique unifié pour le traitement simultané d'un seul échantillon VS ou GAN humain primaire pour de multiples applications en aval: culture spécifique au type de cellule, extraction de protéines, préservation de l'ARN, collecte de la sécrétion tumorale et fixation des tissus. Ce travail décrit également la collecte et le traitement chirurgicaux du liquide céphalo-rachidien humain (CSF) et du perilymph lors de la résection VS de translabyrinthine, car ces tissus étroitement apparentés peuvent servir de sources importantes de biomarqueurs pour VS. Enfin, ce protocole présente des étapes pour la transduction virale de cellules VS humaines primaires en culture comme une nouvelle application de ce tissu pour une utilisation en thérapie génique.

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Protocol

Un consentement éclairé écrit pour la collecte de tous les échantillons a été obtenu avant la chirurgie, et les expériences ont été réalisées selon le Code de déontologie de l'Association médicale mondiale (Déclaration d'Helsinki). Toutes les sections du protocole d'étude ont été approuvées par le Conseil d'examen institutionnel de Massachusetts Eye and Ear et Massachusetts General Hospital.

REMARQUE: Les sections 1 à 7 ci-dessous sont conçues pour être exécutées séquentiellement lors de la réception d'un échantillon humain principal VS ou GAN de la salle d'opération. Le traitement doit toujours commencer par la section 1. Ensuite, en règle générale, l'ARN doit être conservé en premier (section 2), suivi de la préparation de tissu pour la collecte des sécrétions (section 3) et de l'extraction des protéines (section 4). Les tissus à culture (section 5 pour VS, section 6 pour GAN) peuvent s'asseoir dans un milieu de culture supplémenté tandis que les sections 2, 3 et 4 sont effectuées. La fixation du tissu pour la coupe (section 7) est très courte et cOn peut effectuer pendant toute étape de centrifugation. L'article 8 (traitement de perilymph) et la section 9 (traitement CSF) peuvent être effectués lors de la réception de perilymph ou CSF de la salle d'opération pendant une résection VS translabyrinthine. La section 10 (transduction virale) peut être réalisée sur des cellules VS ou Schwann en culture.

1. Préparation et réception d'un échantillon chirurgical

REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées dans un environnement stérile, tel qu'un capot de culture tissulaire ou un capot d'écoulement laminaire. La connaissance de la technique stérile basique est attendue.

  1. Préparation du milieu pour la culture cellulaire primaire VS ou Schwann humaine
    1. Décongeler une portion aliquote de 50 ml de sérum bovin fœtal congelé (FBS) dans un bain d'eau à 37 ° C.
    2. Ajouter 5 ml de mélange de pénicilline / streptomycine dans une bouteille de DMM / F-12 de 500 ml, ce qui donne une dilution finale de 1: 100.
    3. Ajouter les 50 ml de FBS décongelés à la bouteille de 500 mL de DMEM / F-12,Résultant en une dilution finale de 1:10.
    4. Écrivez la date, les initiales du chercheur et les informations supplémentaires ( par exemple, 1% P / S, 10% FBS) sur la bouteille.
    5. Placez le nouveau milieu de culture au réfrigérateur (4 ° C).
  2. Réception et nettoyage de l'échantillon VS ou GAN
    1. Dans la salle d'opération, placer l'échantillon VS ou GAN fraîchement récolté dans une solution salée stérile dans un récipient d'échantillon. Transporter l'échantillon sur la glace de la salle d'opération à un capot de flux laminaire dans le laboratoire.
      NOTE: Les tailles et les poids des échantillons varient considérablement d'un patient à l'autre en fonction de la taille de la tumeur pertinente ou de la quantité de nerf excisé.
    2. Retirer les aliquotes stock-solution d'hyaluronidase (25 000 U / mL) et de collagénase (3 200 U / mL) du congélateur et laisser refroidir les enzymes à température ambiante (requis pour l'étape 5.1.4 ou 6.1.6, selon que l'échantillon est Un VS ou un GAN).
      NOTE: La resuspension des enzymes lyophilisées iS décrit en détail les fiches d'information du produit. La collagénase peut être remise en suspension dans une solution saline équilibrée sans calcium et une hyaluronidase dans une solution de tampon phosphate 0,02 M (pH 7,0), NaCl 77 mM et 0,01% de 1 mg / ml de sérum albumine bovine. L'activité spécifique pour chaque enzyme lyophilisée varie avec le lot et devrait être vérifiée avant la resuspension.
    3. En utilisant une série de trois tubes de 1,5 mL remplis de 1,4 mL de 1x PBS stérile, laver l'échantillon VS ou GAN trois fois. Transférer soigneusement l'échantillon de tube en tube avec des pinces stériles. Fermez chaque tube une fois qu'il contient l'échantillon et secouez doucement pour le laver.
      REMARQUE: Pour éviter d'inonder les tubes de 1,5 mL, moins de 1,4 ml de PBS peut être utilisé par tube si la pièce tumorale est grande.
    4. Mettez l'échantillon dans une boîte de Petri sec de 60 mm et utilisez une pince pour enlever tous les morceaux ( c.-à-d., Les portions cautérisées, généralement blanches ou opaques) et les zones avec des vaisseaux sanguins éminents.
    5. Utiliser fOrceps ou une lame de scalpel pour diviser l'échantillon en pièces séparées pour la conservation de l'ARN, l'extraction des protéines, la collecte des sécrétions, la fixation et la culture cellulaire (voir les sections 2 à 6 ci-dessous).
    6. Transférer la pièce de l'échantillon désigné pour la culture cellulaire (section 5/6) dans un nouveau plat de culture de 60 mm contenant 5 à 8 ml de milieu DMEM / F-12 froid et additionné (en variante, le couvercle du premier plat de culture peut être Utilisé pour cette étape).
      NOTE: La quantité de milieu DMEM / F-12 nécessaire (à partir de l'étape 1.1) dépend de la taille de la tumeur ou du nerf, mais elle devrait tomber entre 5 et 8 mL. Cette pièce peut s'asseoir en milieu de culture pendant que les étapes suivantes sont effectuées.

2. Conservation de l'ARN des tissus VS et GAN (également valable pour l'épithélium sensoriel humain)

  1. Sous le capot de flux laminaire, transférer 1-1.2 mL de solution de stabilisation d'ARN dans un nouveau tube de 1,5 mL.
  2. Après avoir lavé l'échantillon avec du PBS (étape 1.2.3), immergez brièvement la petite tarteCé de tissu désigné pour la conservation de l'ARN (environ 3 mm 3 de VS ou une longueur de 5 mm de GAN) dans la solution de stabilisation d'ARN. Assurez-vous que l'échantillon est complètement immergé dans la solution.
  3. Préparer et étiqueter un nouveau tube de 1,5 mL. Récupérez le spécimen de la solution de stabilisation d'ARN, transférez-le au nouveau tube et rangez-le dans un congélateur de -80 ° C.

3. Collecte des sécrétions VS et GAN

  1. Jour 1
    1. Après avoir lavé l'échantillon avec du PBS (étape 1.2.3), placez le morceau de VS ou GAN désigné pour la collecte des sécrétions dans un tube vide de 1,5 ml.
    2. Préparez deux tubes supplémentaires de 1,5 mL et pipettez 500 μL de DMEM (non complété par FBS) dans chaque tube.
      NOTE: Le premier tube de DMEM sera utilisé pour recueillir les sécrétions tumorales, et le second tube de DMEM servira de témoin assorti. Les sécrétions peuvent être collectées dans le DMEM, tout autre milieu de culture typique nonComplété par du sérum, ou PBS.
    3. Placez l'un des tubes contenant du DMEM sur une balance numérique calibrée. Tare l'échelle, de sorte que lorsque le tube se trouve au sommet de la balance, il lit 0 mg.
    4. Retirez le tube de DMEM de l'échelle, placez le morceau d'échantillon désigné pour la collecte des sécrétions dans le tube et pesez-le. Notez le résultat, qui représentera le poids du tissu seul.
    5. Sous un capot à écoulement laminaire, ajuster le volume de DMEM dans le tube à 100 μL par 10 mg d'échantillon.
    6. Placez le tube contenant l'échantillon de tissu et son contrôle apparié (DMEM seul) dans l'incubateur (37 ° C, 5% de CO 2 ) pendant une période compatible avec les plans de cette expérience. Incuber le tissu pendant au moins 72 h pour recueillir des quantités biologiques utiles de sécrétions tumorales ou nerveuses 15 .
  2. Jour 4
    1. Après incubation pendant 72 h, retirer le milieu contenant la sécrétion de laSpécimen ( c'est -à- dire un milieu conditionné aux tissus) en utilisant une pipette de 1 ml. Pour éviter les cycles répétés de congélation-décongélation, aliquotez le milieu dans de nouveaux tubes selon les analyses aval prévues ( par exemple, pour exécuter un ELISA avec 4 puits nécessitant 50 μL chacun, des portions aliquotes de 210 μL peuvent être préparées).
    2. Si nécessaire, congéler le morceau de tissu restant dans le tube d'origine (déjà étiqueté le jour 1) à -80 ° C pour des analyses supplémentaires, telles que l'extraction de l'ADN, à une date ultérieure.
    3. Stocker les tissus, les sécrétions et contrôler le DMEM dans un congélateur de -80 ° C jusqu'à ce que les applications en aval soient initiées ( p. Ex. ELISA, LC-MS / MS, tableaux de cytokines, etc. ).

4. Extraction de protéines à partir de tissu VS ou GAN

  1. Préparation du tampon RIPA enrichi
    1. Ajouter un comprimé d'inhibiteur de phosphatase et un comprimé d'inhibiteur de protéase à 10 mL de tampon RIPA dans un tube de 15 mL; C'est fortifiéRIPA buffer.
      REMARQUE: conservez le tampon RIPA à 4 ° C et ajoutez les comprimés juste avant utilisation.
  2. Extraction de protéines
    1. Transférer 210 μL de tampon RIPA enrichi (étape 4.1.1) sur un nouveau tube de 1,5 mL.
    2. Après avoir lavé l'échantillon avec du PBS (étape 1.2.3), transférez le petit morceau de tissu désigné pour l'extraction de protéines (environ 3 mm 3 de VS ou 5 mm de longueur de GAN) au tube contenant le tampon RIPA et placez-le sur de la glace Pendant au moins 10 min. Si vous étudiez des formes phosphorylées de protéines, complétez le tampon RIPA avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase 14 . Dans l'intervalle, des étapes pour d'autres composants du traitement des tissus, telles que la fixation (section 7), peuvent être effectuées.
    3. Pré-refroidir la centrifugeuse à 4 ° C.
    4. En utilisant un pilon en plastique, homogénéiser le tissu dans le tube contenant le tampon RIPA. Sonicate le tissu pour 10-15 s à une amplitude de 20%. S'assurer que le spécimenReste sur la glace, même pendant la sonication.
    5. Centrifugez pendant 10 min à 15 000 xg et 4 ° C.
    6. Aliquoter le surnageant dans des incréments de 50 μl dans de nouveaux tubes de 0,5 mL (selon les applications en aval prévues, toute taille d'incrémentation peut être choisie).
    7. Stockez les parties aliquotes du lysat de protéines dans un congélateur de -80 ° C jusqu'à ce que les applications en aval soient initiées ( p. Ex. ELISA ou Western Blots) 20 , 21 .

5. Culture humaine primaire

  1. Jour 1
    1. Séparez le tissu VS désigné pour la culture cellulaire (qui a été assis dans un milieu de culture, comme décrit à l'étape 1.2.6) dans environ 1 mm 3 en utilisant une paire de pinces dans chaque main.
    2. Aspirer le milieu contenant une tumeur avec une pipette sérologique de 10 ml et transférer tous les contenus dans un tube conique de 15 ml.
    3. Centrifugeuse pendant 3 min à1000 xg et 25 ° C.
    4. Préparer un milieu de désintégration dans un nouveau plat de culture de 60 mm en combinant 4,7 ml de milieu DMEM / F-12 supplémenté avec 250 μL de collagénase (concentration finale: 160 U / mL) et 50 μL de hyaluronidase (concentration finale: 250 U / mL) , Pour un volume final de 5 ml.
      REMARQUE: Les deux enzymes doivent être stockées dans un congélateur de -20 ° C mais décongelées avant la préparation de ce milieu (étape 1.2.2).
    5. Après centrifugation, les morceaux de tumeur formeront une pastille au fond du tube conique. Faire pipeter avec précaution et jeter le surnageant.
    6. Ajouter 2 ml du milieu de désintégration contenant une enzyme fraîchement préparé (étape 5.1.4) dans la pastille tumorale. Pipeter plusieurs fois vers le haut et vers le bas pour mobiliser le tissu et transférer le morceau de tumeur contenant le milieu au plat de culture de 60 mm.
    7. Placer le plat de culture dans l'incubateur (37 ° C, 5% de CO 2 ) pendant 18 h.
  2. Jour 2
    1. D chaudLe milieu MEM / F-12 complété par 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine (préparé à l'étape 1.1) dans un bain d'eau à 37 ° C.
    2. Enlevez la boîte à pétres contenant la culture VS de l'incubateur (étape 5.1.7). En utilisant une aiguille de 22 G attachée à une seringue de 6 mL, aspirer le milieu contenant de la culture et le transférer dans un nouveau tube conique de 15 mL.
    3. Centrifugez pendant 5 min à 1000 xg et 37 ° C.
    4. En attendant, utilisez des pinces stériles pour placer le nombre requis de lamelles de verre en poly-D-lysine et lamellés dans une plaque de culture à 24 puits.
      NOTE: Le nombre de puits à cultiver dépend de la taille de l'échantillon; Environ 24-32 puits peuvent être cultivés à partir d'une tumeur de 1 cm 3 , donc pour la plupart des tumeurs plus petites, la planification de 8-16 puits de cellules cultivées est appropriée.
    5. Après centrifugation, jeter le surnageant ( c. -à- d., Milieu enrichi en enzyme) et remettre en suspension le culot cellulaire résiduel dans du milieu DMEM / F-12 frais, additionné, préchaufféÀ l'étape 5.2.1.
      REMARQUE: Le volume dans lequel la remise en suspension de la pastille est déterminé par le nombre de puits prévus à l'étape 5.2.4, en estimant 1 mL de moyen par puits planifié.
    6. Aspirer 2 ml du milieu cellulaire remis en suspension (étape 5.2.5) en utilisant une pipette sérologique de 5 mL. Déposer 1 ml du milieu contenant une cellule tumorale dans chaque puits préparé de la plaque à 24 puits.
    7. Continuer à aspirer et à déposer un milieu contenant des cellules tumorales (aspirer par incréments de 2 ml, dont 1 ml est déposé dans chaque puits planifié) jusqu'à ce que la suspension de cellules tumorales soit également répartie entre tous les puits préparés.
    8. Placer la plaque à 24 puits dans l'incubateur à 37 ° C toute la nuit.
  3. Jour 3
    1. Si des débris importants sont notés au fond des puits, modifiez soigneusement le milieu dans chaque puits vers un nouveau milieu de culture DMEM / F-12 supplémenté, en prenant soin de ne pas déloger les cellules adhérentes. Sinon, retournez la plaque à l'incubateur et changez-laE medium pour la première fois le jour 5.
  4. Jours 5-7 et après
    1. Changez le support tous les 3 jours.
      NOTE: Les cellules VS et GAN humaines primaires sont généralement maintenues en culture jusqu'à leur utilisation dans les applications en aval, à environ 14 jours d'âge. La pureté de la culture diminue après 19 .

6. Culture primaire du GAN humain

  1. Jour 1
    1. Sous un microscope de dissection, isoler les fascicules du tissu désigné pour la culture GAN (qui a été assise en milieu de culture, comme indiqué à l'étape 1.2.6).
      1. Isoler les fascicules de l'épinéure et de la gaine fibreuse en tirant sur le périneurium en utilisant le n. 5 pinces tout en serrant l'épinéure avec le n. 3 pinces.
    2. Une fois que les fascicules sont suffisamment isolés de l'épinéure environnant, transférez-les dans un nouveau plat de culture contenant 2 ml de sucre fraisPlissé moyen.
    3. Couper les fascicules dans des segments de 1 à 2 mm à l'aide de la lame du scalpel.
    4. Pipettez les petites pièces de fascicule et le milieu environnant dans un tube de 15 mL contenant 3 mL de milieu de culture complémenté frais, de sorte que le volume total dans le tube de 15 mL devient 5 mL.
    5. Centrifuger l'échantillon pendant 3 min à 1000 xg et 25 ° C.
    6. En attendant, faites un milieu de culture cellulaire de Schwann dans une nouvelle boîte de Petri de 60 mm en combinant 4,7 ml de milieu DMEM / F-12 supplémenté, 250 μL de collagénase et 50 μL de hyaluronidase, pour un volume final de 5 mL.
      REMARQUE: Conserver les deux enzymes à -20 ° C; Décongeler à température ambiante avant de préparer ce milieu (étape 1.2.2).
    7. Après la centrifugation de l'échantillon, les fascicules se condensent dans une petite pastille dans le tube conique. Jeter le surnageant.
    8. Ajouter 2 ml du milieu de désintégration contenant une enzyme fraîchement préparé (étape 6.1.6) dans la pastille de nerf. Pipeter et dPossèdent plusieurs fois pour mobiliser le tissu et le transférer dans un nouveau plat de culture de 60 mm.
    9. Placer le plat dans l'incubateur (37 ° C, 5% de CO 2 ) pendant 20-22 h.
      NOTE: Il s'agit d'une incubation plus longue que nécessaire pour les échantillons VS (étape 5.1.7).
  2. Jour 2
    1. Méthode DMEM / F-12 additionnée de chaleur dans un bain d'eau à 37 ° C.
    2. En utilisant une aiguille de 22 G attachée à une seringue de 6 ml, aspirer le milieu contenant une culture cellulaire et le transférer dans un nouveau tube conique de 15 ml.
    3. Centrifugez pendant 5 min à 1000 xg et 37 ° C.
    4. Jeter le surnageant et remettre en suspension l'échantillon dans un milieu de culture nouveau, préchauffé, additionné de DMEM / F-12.
    5. Utilisez des pinces stériles pour placer le nombre requis de lamelles couchées dans les puits d'une plaque de culture à 24 puits.
      NOTE: Le calcul de deux puits de cellules cultivées par spécimen de nerf de 1 cm favorise une croissance robuste de la culture.
    6. Ajouter 1 mL du milieu contenant une culture à chaqueBien désigné dans la plaque à 24 puits.
    7. Placez la plaque à 24 puits dans l'incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2 .
  3. Jour 3
    1. Si des débris importants sont notés dans les puits, remplacer soigneusement le milieu par un nouveau milieu de culture supplémenté DMEM / F-12, en prenant soin de ne pas déloger les cellules adhérentes. Sinon, retournez la plaque à l'incubateur et changez le milieu pour la première fois le jour 5.
  4. Jours 5-7 et après
    1. Changez le support tous les 3 jours.

7. Fixation des tissus VS & GAN

  1. Pipetter 1-1.2 mL de paraformaldéhyde à 4% (PFA, ATTENTION) dans un nouveau tube de 1,5 mL.
  2. Après avoir lavé la tumeur ou le nerf avec PBS (étape 1.2.3), transférez un petit morceau de tissu (environ 3 mm 3 de VS ou 5 mm de longueur de GAN) dans 4% de PFA et placez le tube sur un agitateur à 4 ° C. Assurez-vous que l'échantillon est complètement immergé dans tSa solution.
  3. Après au moins 2 h de fixation, récupérer le tube du shaker et procéder à un traitement ultérieur ( p. Ex., Incorporer dans la paraffine ou un composé de température de coupe optimal (OCT) pour une immunohistochimie ou une immunofluorescence ultérieure 22 , 23 , 24 . En variante, le tissu peut être gelé, comme décrit précédemment 25 , 26 .

8. Collecte et entreposage de Perilymph humain pendant la résection de Translabyrinthine VS

  1. Placez trois tubes stériles de 1,5 mL sur de la glace.
    REMARQUE: Un tube sera conservé en sauvegarde en cas de contamination.
  2. Remplir un tube de 1,5 ml avec environ 1,2 ml de solution de PBS qui a été filtré deux fois à l'aide d'un filtre de 0,22 μm.
    REMARQUE: Pour recueillir le perilymph lors d'une résection VS translabyrinthine, le chirurgien doit d'abord s'assurer que le surgiLe champ cal est exempt de poussière d'os, de sang ou de solution saline. Le chirurgien peut utiliser un tube d'aspiration Schuknecht 21 ou 24 G dans la main non dominante à cette fin.
    Un endroit typique pour extraire le perilymph est le canal latéral semi-circulaire (cependant, le canal semi-circulaire postérieur ou la membrane de la fenêtre ronde peut également être accédé, selon la préférence du chirurgien). Le chirurgien doit retirer soigneusement l'os labyrinthique avec une fraise diamantée (tout en utilisant une irrigation par aspiration continue) pour identifier la ligne bleue ( c'est-à-dire le labyrinthe membraneux) du canal semi-circulaire. Le canal semi-circulaire est pénétré par la ligne bleue en utilisant une longue aiguille de 27 G attachée à une seringue de tuberculine de 1 ml.
  3. Demandez au chirurgien d'aspirer doucement une petite quantité de périlymph puis de passer la seringue et l'attache de l'aiguille à l'infirmière chirurgicale.
    REMARQUE: En règle générale, une goutte de perilymph ou moins est collectée. Si le volume observé est plus grand, l'échantillon est probablement contaminé par d'autres fLuid.
  4. Ouvrez le tube vide de 1,5 ml préparé et le tube rempli de PBS directement avant utilisation. Veillez à ne pas toucher l'intérieur des couvercles du tube tout en les ouvrant.
  5. Recevez la seringue et attachez l'aiguille de l'infirmière chirurgicale et purgez complètement le fluide dans le tube vide, en prenant soin de ne pas toucher le tube lui-même avec l'aiguille.
  6. Détachez soigneusement l'aiguille de la seringue. Ne pas contaminer la pointe de l'aiguille et continuer à la maintenir dans une main.
    REMARQUE: Un très petit volume de perilymph a été recueilli, de sorte qu'un certain liquide peut rester dans la longue pointe de l'aiguille.
  7. D'autre part, utiliser la seringue elle-même (sans l'aiguille) pour aspirer 0,2 ml de solution de PBS filtrée du tube préparé dans le corps de la seringue.
  8. Rebranchez l'aiguille à la seringue. Évacuer complètement la seringue dans le tube contenant du périlymph, en utilisant le PBS stérile pour rincer la pointe de l'aiguille.
  9. Fermer le tube contenant le périlymph et le PBS et le placer C'est sur la glace.
  10. Éliminer l'aiguille dans un récipient à objets tranchants.
  11. Placez le tube contenant perilymph dans le congélateur -80 ° C dès que possible.

9. Collecte et entreposage de CSF humain

  1. Placez trois (ou plus) tubes stériles de 1,5 mL sur de la glace.
    REMARQUE: Un tube sera une sauvegarde en cas de contamination ou un volume d'échantillon plus grand que prévu.
  2. Après avoir ouvert la dure-mère, demandez au chirurgien de collecter du CSF avec une seringue de 3 mL (sans aiguille attachée).
    REMARQUE: Pour prévenir la contamination, la collecte du LCR devrait avoir lieu immédiatement après l'ouverture de la dure-mère.
  3. Demandez au chirurgien de remettre la seringue à l'infirmière chirurgicale.
  4. Recevez la seringue de l'infirmière chirurgicale et évacuez complètement le volume nécessaire de CSF dans le (s) tube (s).
  5. Fermez le (s) tube (s) et placez-les sur de la glace.
  6. Placez le (s) tube (s) dans le congélateur -80 ° C dès que possible.
E "> 10. Expériences de transduction virale pour les cellules VS primaires

  1. En utilisant la concentration de stock viral comme référence, calculez le nombre de génome souhaité (gc) et la multiplicité d'infection (MOI) nécessaires à l'expérience de transduction proposée; Le stock de virus peut être dilué directement dans un milieu de culture supplémenté.
    NOTE: Tout vecteur viral approprié pour la transduction de cellules primaires peut être utilisé; Voir Landegger et al. (2017) pour une comparaison détaillée de six sérotypes de virus adéno-associés différents 27 . De plus, lors de la culture de cellules humaines primaires, le nombre de cellules n'est généralement pas déterminé avant de se plaquer sur des lamelles. Les cellules VS primaires ne répondent pas bien à la trypsinisation et au passage, de sorte que pour un calcul MOI fiable, le nombre de cellules adhérentes par puits peut être estimé à l'aide d'un microscope à contraste de phase. Alternativement, si les cellules sont proches de la confluence, leurs nombres peuvent être estimés de manière fiable en utilisant des valeurs de densité cellulaire standard pourUne plaque de 24 puits ( par exemple, 5 x 10 4 cellules par puits).
  2. Sous un capuchon à flux laminaire, préparer un milieu additionné contenant la quantité désirée de virus dans un tube de laboratoire conique de 15 ml, de sorte que 1 mL de milieu contenant du virus soit préparé pour chaque puits de cellules à transduire. Pipettez le milieu contenant du virus vers le haut et vers le bas pour mélanger doucement mais complètement.
  3. En utilisant des pinces stériles, transférez les lamelles contenant des cellules VS primaires (étape 5.2.8) de la plaque d'origine de 24 puits à une nouvelle plaque à 24 puits. Après le transfert de chaque lamellette individuelle, ajouter 1 mL de milieu contenant du virus. Faire tourbillonner la plaque chaque fois que le milieu est ajouté pour s'assurer que les cellules sont revêtues uniformément avec le virus.
  4. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pour la durée de l'expérience prévue.
    NOTE: Les incubations allant de 48 à 120 h ont tous montré des résultats prometteurs de transduction 27 .

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Representative Results

Les cellules VS humaines primaires en culture, telles qu'établies dans la section 5, peuvent être traitées comme des modèles informatifs pour les processus associés à la maladie dans de nombreuses applications de recherche en aval ( Figure 1 ). Les cellules Schwann saines cultivées dans la section 6 fournissent un point de comparaison direct et instructif. Comme indiqué ci-dessous, des données étendues de VS et GAN traitées selon ce cadre méthodologique unifié sont disponibles dans plusieurs articles précédemment publiés 12 , 13 , 14 , 15 , 27 .

La transduction réussie de cellules VS primaires avec des virus adéno-associés pour la thérapie génique est présentée pour la première fois ( figure 2 ). Les cellules VS primaires ont été transduites en culture w Ith Anc80 exprimant la GFP, ancêtre prédit de virus adéno-associés 28 . Anc80 s'est révélé être un vecteur efficace au maximum pour le transfert de gènes dans les tissus cochléaires murins in vitro et in vivo 27 . La transduction efficace des cellules humaines primaires avec ce vecteur comporte des implications importantes pour les incursions futures dans la thérapie génique pour VS.

Figure 1
Figure 1: Images sur les champs lumineux des cultures primaires de Schwannoma vestibulaire humain.
Les modèles typiques dans l'organisation des cellules VS en culture peuvent être identifiés. Barre d'échelle = 200 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 2: Image Immunofluorescente représentative des cultures primaires de Schwannoma vestibulaire humain après exposition à Anc80 exprimant la GFP pendant 48 h à une multiplicité d'infection (MOI) de 250 000.
Vert = GFP; Rouge = phalloidine / F-actine (taches du cytosquelette); Bleu = DAPI (taches du noyau). Barres d'échelle = 50 μm (A) et 100 μm (B). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Ce manuscrit décrit un cadre méthodologique unifié pour la recherche VS, décrivant le traitement simultané de spécimens humain VS et GAN pour les applications de recherche en aval. À mesure que la recherche VS entre dans l'âge de la médecine de précision, la préparation du même échantillon sous des formes capables de répondre à de nombreuses questions de recherche permettra la découverte d'idées moléculaires, cellulaires, génétiques et protéomiques spécifiques aux patients individuels.

La pureté des cultures de cellules et de VS humaines de Schwann a été évaluée à fond au moyen de l'immunocytochimie, en utilisant le rapport des cellules positives pour le marqueur S100 à celles positives pour la tache nucléaire DAPI 19 . En conséquence, il est recommandé d'effectuer des expériences sur des cultures de cellules Schwann humaines primaires au cours des deux premières semaines après le placage des cellules, car la pureté de ces cellules est la plus élevée pendant cette période; Par la suite, les cellules semblables aux fibroblastes commencent à prédominer. TuLes cultures cellulaires de gh VS sont également maximalement pures à deux semaines en culture, les cellules VS n'ont pas d'inhibition médiée par contact et continueront à proliférer à des stades ultérieurs. En outre, une comparaison directe de microarray de l'expression de protéines à partir du tissu VS (section 4) et des cellules VS en culture à partir des mêmes tumeurs (section 5) a montré avec succès que les cultures VS démontrent un niveau de similarité biologique satisfaisant à leurs tumeurs parentales respectives 19 . La quantification réussie des protéines d'intérêt peut être effectuée par Western Blot de lysats de protéines générés dans la section 4 et la quantification des transcrits d'ARN via qRT-PCR d'ARN extrait de tissus conservés avec une solution de stabilisation d'ARN (section 2) 12 , 13 , 14 .

Les cellules VS et GAN en culture peuvent être exposées à des substances chimiquement actives, telles que des anti-inflammatoires non stéroïdiens, smalLes ARN interférants (siRNA) ou les composés organiques naturels pour élucider les mécanismes moléculaires spécifiques à la maladie ou pour tester une cible thérapeutique 13 , 14 , 29 . Les composés d'intérêt peuvent être directement ajoutés aux cellules en culture après dilutions appropriées dans un milieu de culture complémentaire régulier. Pour évaluer l'effet de ces substances sur des aspects importants de la physiologie cellulaire, l'étiquetage de la bromodeoxyuridine (BrdU) pour la prolifération, l'étiquetage fin de la désoxynucléotidyl transférase dUTP (TUNEL) pour l'apoptose et le 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) La réduction du bromure de 2,5-diphényltétrazolium (MTT) pour la viabilité métabolique est une analyse fiable qui peut être utilisée avec confiance sur ces cellules 19 . Le milieu de culture des cellules traitées peut également être soigneusement aspiré, stocké à -20 ° C et testé pour quantifier les niveaux relatifs de substances sécrétées, telles que la prostaglandine E2, dont la sécrétion cÊtre affecté par le traitement médicamenteux 13 . En outre, la fixation des tissus (section 7) et l'insertion ultérieure dans OCT ou la paraffine fournissent un substrat robuste pour les essais d'immunofluorescence 13 , 14 .

Le milieu conditionné par une tumeur ou un nerf généré dans la section 3 fournit un moyen simple et efficace d'évaluer les molécules solubles sécrétées par VS et d'extraire des vésicules extracellulaires. Des tableaux de cytokines ou des ELISA peuvent être effectués sur ces sécrétions, comme indiqué dans les protocoles des fabricants, décrites dans deux études publiées 9 , 12 . Les vésicules extracellulaires peuvent être purifiées à partir de ces sécrétions en utilisant une ultracentrifugation, comme indiqué dans une publication précédente 30 . Alternativement, les sécrétions elles-mêmes peuvent être utilisées comme réactifs spécifiques au patient pour les applications de recherche en aval. Par exemple, dans une expérience qui révèleUn nouveau mécanisme sous-jacent à la perte auditive neuronale associée à VS, des sécrétions ont été recueillies à partir du tissu VS de patients souffrant de malentendants auditifs et VS ayant une bonne audition après incubation dans DMEM pendant 72 h (section 3). Ces sécrétions tumorales ont ensuite été appliquées à des explants cochléaires murins, et il a été révélé que les sécrétions tumorales de patients atteints de VS ayant une mauvaise audition ont causé plus de dégâts aux explants cochléaires que les sécrétions de patients atteints de VS ayant une bonne audition 15 . Fait important, les sécrétions collectées aux points de temps avant 72 h n'ont pas eu de dégâts considérables.

Le perilymph humain prélevé chez les patients soumis à une résection V de la translabyrinthine (section 8) représente une nouvelle avenue passionnante pour la découverte des biomarqueurs VS. Les échantillons recueillis conformément à la section 8 ont été analysés par chromatographie en phase liquide - spectrométrie de masse en tandem (LC-MS / MS) pour cartographier le protéome du perilymph humain et 15 biomarqueurs candidats de VS ont réussi iIdentifié 31 . Une analyse similaire pourrait être possible en utilisant un CSF humain recueilli auprès de patients VS (section 9).

Une considération importante dans la recherche VS est la sélection de tissus témoins appropriés. Des études antérieures ont utilisé le nerf cochléaire, le nerf vestibulaire et les nerfs périphériques non apparentés (comme le nerf sciatique), à ​​effet variable 22 , 32 . Toutefois, plusieurs raisons conduisent au soutien de l'utilisation des GAN en tant que contrôles 15 au maximum. Comme le nerf vestibulaire, le GAN est un nerf sensoriel périphérique avec des axones enserrés par les cellules de Schwann. Fait important, une recherche documentaire révèle que les schwannomes n'ont jamais été trouvés pour se développer à partir du GAN, rendant les changements néoplasiques dans ce tissu improbables. En outre, les GAN sont régulièrement sacrifiés lors de l'accès aux structures du col plus profond, ce qui donne aux chercheurs hospitalisés un accès facile à la santéEt les spécimens pendant les dissections courantes du cou et les parotidectomies. Bien que le nerf cochléaire soit souvent sacrifié pendant la chirurgie VS et puisse être facilement disponible, sa proximité des nerfs vestibulaires risque de partager le même microenvironnement, ce qui peut démontrer des changements moléculaires pré-tumoraux 33 . D'autres laboratoires ont également utilisé les GAN comme un contrôle adéquat pour la recherche VS, et il est recommandé de continuer cette pratique 20 , 21 , 22 , 34 .

Une étape critique, mais souvent négligée, dans les protocoles de culture spécifiques aux cellules (sections 5 et 6) est l'élimination correcte des tissus et des vaisseaux sanguins non viables. L'élimination de ces tissus non tumeurs est cruciale pour générer des cultures robustes de pureté maximale. En outre, lors du dépôt d'un milieu de culture contenant des cellules sur des lamelles, il est important deAccorder une attention particulière à la quantité de tissu transféré à chaque puits. La réalisation d'une répartition uniforme, légèrement dense des cellules contenant quelques «morceaux» de tissu plus dense dans chaque puits est particulièrement importante pour les cellules de Schwann, qui nécessitent un nombre suffisant de cellules adhérentes pour prospérer. Le revêtement des lamelles avec la poly-D-lysine et la laminine permet également une croissance efficace des cellules. Les cellules prolifèrent plus fortement lorsque les lamelles sont revêtues en laboratoire, par rapport aux produits pré-revêtus commercialement disponibles.

Pour assurer une extraction de protéines et d'ARN de haute qualité, vérifiez que le tissu reste à des températures inférieures à 4 ° C dans les sections 2 et 4. En outre, comme la littérature concernant l'analyse des sécrétions VS est rare (section 3), de nouveaux projets pourraient nécessiter D'autres innovations et différentes longueurs d'incubation.

Comme les méthodes pour traiter la pathogenèse VS continuent à avancer, l'utilisation de cette strUne combinaison combinée de techniques fondamentales permettra de recueillir le maximum d'informations à partir d'un seul échantillon humain. Le traitement simultané et informé des tissus VS et GAN sera essentiel à la génération de thérapies pharmacologiques et génétiques efficaces contre cette tumeur débilitante.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les subventions du Département national de la surdité et des autres troubles de la communication R01DC015824 (KMS) et T32DC00038 (en soutenant JES et SD), le ministère de la Défense accorde W81XWH-14-1-0091 (KMS), la Fondation Bertarelli (KMS) , La Nancy Sayles Day Foundation (KMS), le Lauer Tinnitus Research Center (KMS) et la Fondation Barnes (KMS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 German Glass Coverslip Corning 354087 Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)
CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 188161
CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 227261
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm Greiner Bio-One 628160
Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered Sigma-Aldrich C1639
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile Corning 3526
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10313-039
DMEM/F-12, 500 mL Thermo Fisher Scientific 11320-033
Dumont #3 Forceps, Dumoxel Fine Science Tools 11231-30 Autoclave prior to use
Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox Fine Science Tools 11251-20 Autoclave prior to use
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10437-028 Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer
Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder Sigma-Aldrich H3506
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile EMD Millipore SLGP033RS
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline Sigma-Aldrich P6148 Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010-023 Autoclave prior to use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100 mL Thermo Fisher Scientific 15140-122
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets Roche 04906845001
Pierce Protease Inhibitor Tablets Thermo Fisher Scientific 88666
Pipettes and pipette tips, 5/10/25 mL Variable Variable
Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0 mL Microtubes E&K Scientific EK-10539
PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in BD 301629
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115
RNAlater (RNA stabilization solution) Thermo Fisher Scientific AM7021
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL Eppendorf 022363719 Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL Eppendorf 022363204 Autoclave prior to use
Saline - 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 mL Hospira 0409-1966-05
Scalpel Blades - #15 Fine Science Tools 10015-00
Schuknecht Suction Tube 24 gauge Bausch + Lomb N1698 42 Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker
Specimen Container, OR sterile, 4OZ Medline DYND30331H
Stemi 2000-C Stereo Microscope Zeiss 000000-1106-133
Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 mL, 22 G x 1 in. BD 309630
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 mL BD 309659
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 mL BD 309656
Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe Cole-Parmer CP25013

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