Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Identifikation og karakterisering af metastatisk faktorer af genoverførsel i romanen RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Published: October 16, 2017 doi: 10.3791/55890
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medicine

Summary

Vi præsenterer en protokol for at demonstrere en roman somatiske gen overførselssystem udnytter RIP-Tag; RIP-tva musen model til at studere funktionen af gener i metastaser. De aviær retrovira leveres intracardiacally for at sikre overførsel af gener til præmaligne, noninvasive læsioner i bugspytkirtlen β celler i voksen mus.

Abstract

Metastatisk kræft tegner sig for 90% af dødsfald blandt patienter med solide tumorer. Der er et presserende behov for bedre at forstå driverne på kræft metastaser og til at identificere nye terapeutiske mål. For at undersøge molekylære begivenheder, der drev progressionen fra primær kræft til metastase, har vi udviklet en bitransgenic musemodel, RIP-Tag; RIP-tva. I denne musemodel drev rotte insulin promoter (RIP) udtryk for SV40 T antigen (Tag) og receptor for undergruppe en aviær kvægleukose virus (tva) i bugspytkirtlen β celler. Musene udvikle pancreas Neuroendokrine tumorer med 100% penetrans gennem veldefinerede trin, som ligner menneskets tumordannelse, med faser herunder hyperplasi, angiogenese, adenom og invasive karcinom. Fordi RIP-Tag; RIP-tva mus ikke udvikle metastatisk sygdom, genetiske ændringer, der fremmer metastaser kan identificeres nemt. Somatiske gen overføres til tva-udtrykker, prolifererende pancreas β præmaligne læsioner er opnået gennem intracardiac injektion af aviær retrovira husly det ønskede genmodifikation. En titer på > 1 x 108 smitsomme enheder pr. ml er hensigtsmæssigt for i vivo infektion. Derudover kan aviær retrovira inficere cellelinjer afledt af tumorer i RIP-Tag; RIP-tva mus med høj effektivitet. Cellelinjer kan også bruges til at karakterisere de metastatisk faktorer. Her viser vi hvordan man kan udnytte denne musemodel og cellelinjer til at vurdere funktioner af kandidat gener i tumor metastaser.

Introduction

De fleste kræftformer opstår fra somatiske mutationer 1. Konventionelle gensplejsede musemodeller (CLAUSS) har givet betydelig indsigt i specifikke genetiske ændringer tumordannelse 2bidrag. Men de har flere begrænsninger. Den store ulempe ved disse modeller er, at de ikke replikerer tumordannelse hos mennesker, hvor kun nogle celler i et væv erhverve genetiske ændringer sporadiske natur. Mutationer i transgene og knockout mus er også kønscelleoverførsel med potentiale til at påvirke udviklingen. Derudover er genererer disse musemodeller dyrt og tidskrævende.

Metastaser er et vigtigt spørgsmål inden for kræft. Modeling metastaser har været vanskeligt i CLAUSS. Spontan metastaser er sjældne i musen. Penetrans er variabel og latenstid er længe i CLAUSS af metastaser 3. Eksperimentelle metastase modeller beskæftiger direkte indsprøjtning af celler til omsætning af mus, så de tidlige trin i metastatisk cascade er elimineret.

For at overvinde nogle af de ovennævnte begrænsninger i at studere metastatisk faktorer i musemodeller, har vi udviklet en bitransgenic musemodel, RIP-Tag; RIP-tva4. Strategien er baseret på at kombinere brugen af en stærkt synkroniseret tumor progression musemodel, RIP-Tag 5, og receptoren for undergruppe-A aviær kvægleukose virus, tva 6,7. Denne RIP-Tag; RIP-tvamusemodel giver gener skal indføres somatically i en enkelt bitransgenic mus stamme. Med SV40 T antigen undertrykke tumor smittespredningshæmmende funktioner Rb og p53, udvikle mus i bugspytkirtlen Neuroendokrine tumorer i en lignende måde at menneskelige tumordannelse, med faser herunder hyperplasi, angiogenese, adenom og invasive karcinom. Denne RIP-Tag model har været meget lærerigt for vores forståelse af kendetegnende for kræft, ikke begrænset til pancreas Neuroendokrine tumorer. Det har også været brugt i prækliniske forsøg 8.

Vi præsenterer en protokol til overførsel af somatiske gener gennem indsprøjtning af aviær retrovira intracardiacally i RIP-Tag; RIP-tva mus. Vellykket infektion med RCASBP-afledte aviær retrovira kræver aktivt prolifererende målceller. Derfor valgte vi RIP-Tag; RIP-tva mus 7 uger gamle, hvornår hyperplasi udvikler i omkring 50% af pancreas holmene. Venstre ventrikel intracardiac injektion af høj titer vira er forpligtet til at opnå en infektion effektivitet på 10-20% 4. Reducerer denne leveringsmetode betydelig fortynding af virale partikler i omløb før virus når pancreas Holme.

Brug denne fremgangsmåde, har vi tidligere vist, at Bcl-xL fremmer kræft metastaser uafhængigt af dens anti-apoptotiske funktion 4,9. Denne anti-apoptotiske-uafhængig metastatisk funktion blev ikke observeret, når Bcl-xL blev udtrykt via en transgen pancreas β celler i hele tumorfremkaldende ontogeny i RIP-Tag; RIP-Bcl-xL mus model 10. Derfor tilbyder vores musemodel en unik mulighed for at identificere og karakterisere gener funktioner når udtrykt på et senere tidspunkt af tumordannelse. Fordi 2-4% af Holme udvikle sig til tumorer i RIP-Tag; RIP-tva bitransgenic mus uden viral infektion og ikke alle de præmaligne læsioner er inficeret med de RCASBP-afledte aviær retrovira, kun de faktorer, der giver en selektiv fordel i naturlige løbet af tumordannelse kan identificeres. Især genkendes metastatisk faktorer mest let af denne metode, fordi metastase i bugspytkirtlen lymfeknuder eller andre organer ikke normalt forekommer i RIP-Tag; RIP-tva mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

etik erklæring: eksperimenter på dyr blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer og forskrifter fastsat af Institute for Animal Care og brug Udvalget af Weill Cornell medicin.

1. valg af aviær Retroviral vektorer (RCASBP A-baseret eller RCANBP(A)-based)

  • vektorer var afledt af Rous sarkom virus 11. Aviær retroviral vektorer kan levere cDNAs (≤ 2,5 kb), korte hårnål RNA'er (shRNAs), MicroRNA (miRNAs) og andre noncoding RNA'er. Kommercielt tilgængelige vektorerne er opført i materialer og andre skal bestilles direkte fra forfatterne.
  • Til overexpress gener af interesse, brug en af de følgende vektorer, RCASBP(A) 12 ( figur 1A), RCAS-X ( figur 1B), RCAS-Y 13 ( figur 1 c), RCASBP-Y DV 14 eller andre ALV-A vektorer (https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html).
  • Til at banke gener af interesse ved shRNA, brug en af de følgende vektorer: RCAN-X DV 15 eller RCAS-RNAi 16.
  • Til overexpress miRNAs, generere RCAS-miR vektor, som beskrevet i 17.
  • Omdannelse til E. coli og DNA krav.
  • Omdanne helst Stbl2 eller Stbl3 kompetente celler, som har unikke genotype at stabilisere direkte gentage og retroviral sekvenser DNA. Rense plasmid DNA ved hjælp af en metode, der vil give ren, Transfektion grade DNA. 5 µg DNA er nødvendigt med minimum koncentration på 0,1 µg/µl.

2. Viral spredning i kylling Fibroblast DF1 cellelinie

  1. brug af filtrerede pipette tips for cellekultur er påkrævet for at forhindre cross-forurenende viral lagre 18.
  2. Vedligehold DF1 celler i 6 cm parabol med vækst medium (DMEM med høje glukose, 10% føtal bovint serum, 6 mM (endelig koncentration) L-glutamin, 10 enheder/ml penicillin, 10 µg/ml streptomycin) på 37 o C og 5% CO 2. Hvis DF1 celler er frisk optøet fra frosne bestande, kultur dem i mindst 3 dage før Transfektion.
  3. Én dag før Transfektion, passere DF1 celler til et 6 cm vævskultur parabol, således at de bliver 30-50% sammenflydende på tidspunktet for Transfektion.
  4. Fortyndes 5 µg ren viral DNA med DMEM (uden serum, penicillin og streptomycin) til en samlet maengde paa 150 µl i et microcentrifuge rør inde i vævskultur hætte.
  5. Tilføje 30 µL af Superfect direkte i den fortyndede DNA tube; vortex denne blanding for 10 s; Lad blandingen ved stuetemperatur i 5-10 min i vævskultur hætte til at tillade Transfektion-kompleks dannelse.
  6. Mens komplekse dannelsen sker, forsigtigt Aspirér vækstmediet fra DF1 celle kultur parabol, og omhyggeligt vaske cellerne med 4 ml PBS - / -.
  7. Vækst med pipette overfoeres 5 ml medium (indeholdende serum og antibiotika); spare 4 ml til en Falcon rør til det næste trin; og tilsæt resten af 1 ml af vækstmediet til Transfektion komplekser. Mix af pipettering op og ned to gange, og straks overføre hele Transfektion komplekser til DF1 celler. Swirl for at sikre, at cellelag er omfattet; Der inkuberes i 2-3 timer ved 37 o C.
  8. Opsug Transfektion blandingen vaske cellerne med 4 ml PBS - / - tilsættes 4 ml frisk vækstmedium (indeholdende serum og antibiotika); vende tilbage celler til en 37 o C inkubator.
  9. Når celler nå confluency, passage celler (forbigående udtryk kan analyseres 48-72 h efter Transfektion).
  10. Fortsat passere celler for omkring 7 dage indtil alle celler er formodentlig smittet; teste viral DNA integration af PCR og bestemme protein udtryk ved Western blotting; og fryse celler i DMEM medium med 10% DMSO og 20% føtal bovint serum.

3. In Vivo Infektion af RIP-Tag; RIP-tva mus

  1. Virus samling og koncentration
    Brug frisk koncentreret virus for i vivo infektion. Titer af virus holdt i 4 o C inden for en uge er ikke reduceret betydeligt. Men frosne delprøver af viral stock vise 10-fold reduceret titer efter optøning.
    1. Udvid virus-producent DF1 celler i 15 cm retter afhængigt af mængden af virus behov. For i vivo mus infektion, forberede et gennemsnit på én plade pr. mus.
    2. Pre chill rotoren (f.eks SW28), swing spand, og ultracentrifuge maskine til 4 o C.
    3. Indsamle supernatanten fra sammenflydende 15-cm retter. Fjerne celle debris ved lav hastighed centrifugering ved 1.650 x g i 10 min. ved 4 o C.
    4. Overføre viral supernatanten til ultracentrifuge rør (Polyallomer centrifugeglas). Spin i en ultracentrifuge for 1,5 timer på 95,400 x g 4 o C. Beckman XL-100 ultracentrifuge maskine, bruge Accel: 1; Decel: indstillinger for 1.
    5. Fjern supernatanten fra ultracentrifuge rør så meget som muligt. Tilføje PBS uden calcium og magnesium (PBS - / -) til ultracentrifuge røret at gøre endelige 100 µl viral suspension fra en 15 cm parabol. Dække rør med Parafilm. Resuspenderes usynlige viral af vortexing ultracentrifuge rør i 2 min på medium hastighed.
    6. Rock ultracentrifuge rør på 4 o C i en time til natten.
    7. Overføre viral suspension ind i et microcentrifuge rør. Varm op den virale suspension til stuetemperatur før injektion ind i musene.
  2. Viral Titer bestemmelse.
    For hver ny viral konstruktion skal viral titer bestemmes før i vivo infektion.
    1. Frø DF1 celler i alle pladens huller af en 12-godt vævskultur plade (forslag: 2 x 10 4 celler/brønd, 1 ml/hul), således at de vil være 30% sammenflydende på tidspunktet for infektion. En 12-godt plade er nødvendig for en viral titer bestemmelse.
    2. Laver en serie af 10-fold fortyndinger af viral supernatanten i vækstmediet som følgende:
      1. Mix 5 µl viral supernatanten med 495 µl vækstmedium for de 10 2 fortynding i et microcentrifuge rør. Vortex kortvarigt i et par sekunder.
      2. Tage 40 µl fra 10 2 fortynding i 360 µl vækstmediet i et microcentrifuge rør til 10 3 fortynding. Vortex kortvarigt i et par sekunder.
      3. Følg trin 3.2.2.2 for 10 4 og 10 5 fortynding.
      4. Sæt op 5 af 6-ml polystyren rør. Alikvot 2,25 ml vækstmediet pr. tube og mærke dem 10 6 10 7 10 8 10 9, 10 10, hhv.
      5. Mix 0,25 ml fra 10 5 fortynding med 2,25 ml vækstmediet i 6 ml polystyren tube for 10 6 fortynding. Vortex kortvarigt i et par sekunder.
      6. Følg trin 3.2.2.5 for 10 7 10 8 10 9 og 10 10 fortynding.
      7. Fjerne det oprindelige næringssubstratet fra DF1 celler på 12-godt plade. Sætte 1 ml fortyndet virus til hver godt i duplikeret (inficerede, 10 10 10 6 IU/ml).
    3. Tillade celler til at vokse i mindst 7 dage (Udfør trypsinzation når det er nødvendigt). Indsamle celler for at isolere DNA og check for tilstedeværelse af viral DNA ved PCR, som beskrevet i " 6. PCR-protokoller ". Hvis denne viral titer er 10 8 smitsomme enheder pr. ml (IU/ml), en positiv 398 bp PCR produkter fra RCASBP vil blive observeret ved hjælp af DNA fra celler med 10 8 10 6 IU/ml vira, men ikke fra ikke-inficerede celler eller celler med 10 10 10 9 IU/ml vira. En titer på > 1 x 10 8 smitsomme enheder pr. ml skal bruges til i vivo infektion.
  3. Intracardiac injektion
    Hemizygous RIP-Tag mus, ikke homozygot mus, der anvendes i denne undersøgelse. Hemizygous RIP-Tag mus udvikle pancreas Neuroendokrine tumorer omkring 10 ~ 12 ugens i alder, mens homozygot mus har en kortere tumor latenstid. Fordi celledelingen er påkrævet for indarbejdelse af viral cDNA i værten genom, 7 uger gamle RIP-Tag; RIP-tva bruges musen med hyperplasic i bugspytkirtlen β celler. Bemærk venligst at de fleste normale β celler ikke skyder i voksen mus.
    1. Brug 7 uger gamle RIP-Tag; RIP-tva mus i en ren C57BL/C baggrunden for eksperimenterne.
    2. Anesthetize mus ved hjælp af en ketamin/xylazin kombination (150 mg/kg; 15 mg/kg). Bruge varme støtte til at vedligeholde mus kropstemperatur under hele hele anæstesi.
    3. Gælde begge øjne at forhindre hornhinde tørring øje lubricant.
    4. Barbering hår fra brystet hulrum i RIP-Tag; RIP-tva mus. Position musen på ryggen med brystet opad. En tå-knivspids udføres for at observere dyret for ikke-lydhørhed at bekræfte fuld anæstesi effekt.
    5. Udvider den forreste lemmer og sikre dem med bånd. Mark mus ' s bryst til injektion. Markere en placering midt mellem brystbenet notch og toppen af xyphoid proces, og lidt til venstre (anatomiske) af brystbenet ( figur 2).
    6. Krat den forreste brystvæg med enten en povidon-jod scrub eller en klorhexidin krat efterfulgt af en 70% isopropylalkohol eller 70% ethanol gennemblødt gaze svamp.
    7. Tegner 50 µl af luft ind i en steril 28 g ½ insulin sprøjten for at skabe plads mellem stemplet og menisk en 500 µL sprøjte, og derefter udarbejde 100 µl af virus. Luftrummet uden nogen form for væske på væggen er afgørende for at se hjerte pulse.
    8. Holde nålen opretstående. Hold huden af mus stramt med den ene hånd, og indsætte nålen til det markerede sted. Når en lyse røde puls af blod vises i sprøjten, stop fremme nålen og lave dybde på nålen i mus med den ene hånd.
    9. Bruge anden hånden til forsigtigt og skubbe langsomt stemplet til at levere viral suspension (~ 100 µl volumen) over en periode på ~ 60 sekund. Levere 10-20 µl når at se en lys rød puls af blod vises i sprøjten. Kontinuerlig indgangen til røde iltet blod til gennemsigtig nål-hub'en angiver korrekt placering af nålen ind i venstre hjertekammer.
    10. Efter det sidste Tryk på stemplet til at levere viral suspension og før at se den næste røde puls af blod, hurtigt trække nålen ud af brysthulen.
    11. Anvende blide tryk over injektionsstedet til at reducere blødning for mindst 1 min.
    12. Forsigtigt bevæger musen på en varmepude eller under en varmelampe indtil fuldt bevidst. Mus vil blive fulgt indtil anæstesi aftager så at de kan gå fra stimuli, en periode, normalt varede ca. en time. Mus skal overvåges dagligt for selv og intakt pels og eventuelle ændringer i opførsel.

4. Histopatologisk analyse af tumorer

  1. , ni uger efter injektion, aflive 16 uger gamle RIP-Tag; RIP-tva mus. Optage størrelser og antal primære Pankreas tumorer og eventuelle brutto metastaser.
  2. Fix bugspytkirtlen, leveren og andre organer i 10% buffered formalin natten over ved stuetemperatur i en vuggende platform.
  3. Overføre de faste væv i 70% ethanol på den næste dag. Behandle væv i paraffin-embedded sektioner.
  4. Udføre immunhistokemiske farvning for enten synaptophysin (en neuroendokrine markør) eller insulin (β celle-specifikke markør) efter fabrikanten ' s instruktioner til at identificere metastaser af pancreas β-celler i pancreas lymfeknuder eller lever. Men de differentierede tumorceller eller dårligt differentieret tumorceller kan miste udtryk for insulin og kun kan påvises ved synaptophysin immunfarvning.

5. In Vitro Infektion af tva-udtrykker celler

det er ikke nødvendigt at bruge koncentreret virus til in vitro- infektion. Protokollen beskrevet nedenfor er for to runder af infektion. Yderligere runder af infektion kan udføres ved at gentage følgende protokol.

  1. Indsamle viral supernatanten fra sammenflydende DF1 celler. Holde den viral supernatanten på 4 o C for infektion inden for en uge. Før infektionen, passere viral supernatanten gennem et 0,45 μm filter at opnå celle-fri vira.
  2. Kort skyl tva-udtrykker målceller (dvs. N134 i bugspytkirtlen β celle tumor cellelinje fra en RIP-Tag; RIP-tva mus) med PBS - / - at fjerne alle spor af serum, der indeholder trypsin inhibitor. Kort skyl tva-udtrykker target-cellerne med trypsin-EDTA (såsom 0,25% Trypsin-2.21 mM EDTA) løsning. Tilføje Trypsin-EDTA-opløsning og inkuberes i 2 minutter. Tryk forsigtigt på pladen. Observere celler under en inverteret mikroskop. Celler løsne som regel i 2-3 min. frø målceller i en 6 cm plade. Brug 3 ~ 4 ml filtreret viral supernatanten som vækstmedium.
    Bemærk: Ernæring i viral supernatanten er forbruges af DF1 celler, så ændre mediet den morgendag.
  3. Den næste dag, varme op nok mængden af viral supernatanten til stuetemperatur. Fjern mediet fra target-cellerne, og erstatte med 3-4 ml viral supernatanten.
  4. På den tredje dag, passage celler efter behov. Hvis celler ikke er tætte nok til at være passaged, varme op ~ 4 ml af regelmæssige vækstmediet (DMEM med høje glukose, 10% føtal bovint serum, 6 mM (endelig koncentration) L-glutamin, 10 enheder/mL penicillin, 10 µg/mL streptomycin) til at erstatte den virale supernatanten.
  5. Udvid inficerede celler og undersøge kandidat protein udtryk ved Western blotting 19. Virkningerne af kandidat gener på migration og invasion kan analyseres i transwell assays. Disse cellelinjer kan også blive testet for deres metastatisk potentiale til leveren i en hale vene assay for metastase.

6. PCR-protokoller

løsninger skal samles så hurtigt som muligt på is. En mastermix uden skabelonen kan foretages for et stort antal af prøver og aliquoted i PCR rør. Multiplicere mængden af hver reagens kræves af antallet af prøver. Bland reagenser af svippede forudgående og swirl med pipette tip før du tager nogle til at tilføje til mastermix. Efter tilføjer hver reagens til mastermix tube, afpipetteres op og ned for at levere eventuelle residualer inde Skudspidserne.

  1. Til at påvise tilstedeværelsen af RCASBP i de inficerede eller transfekteret celler.
    Følgende protokol kræver 11,5 µL af mastermix og 1 µL af genomisk DNA til hver prøve. Sørg for at swirl før du tilføjer hver reagens.
    1. Forberede en mastermix 7.68 µL nukleasen-gratis vand, 0,75 µL DMSO, 1,25 µl 10 x buffer II for AmpliTaq DNA Polymerase, 1.375 µl af 25 mM MgCl 2 og 0,125 µl af 25 mM dNTP.
    2. Tilføje 0,125 µL af 100 µM fremad primer RCAS5626F: (5 ' - ACCGGGGGATGCGTAGGCTTCA - 3 ') og 0,125 µL af 100 µM reverse primer RCAS6023R: (5 ' - CCGCAACACCCACTGGCATTACC - 3 ') til mastermix.
    3. Tilføje 0.075 µL AmpliTaq DNA Polymerase til mastermix.
    4. Blandes mastermix ved svippede tube med fingrene. Spin ned matermix i en centrifuge maskine fly for 3 ~ 5 sekunder.
    5. Alikvot 11,5 µL fra mastermix til hver enkelt PCR rør. Swirl hver gang, før aliquoting til en ny tube.
    6. Swirl og tilføje 1 µL genomisk DNA skabelon til hver PCR rør. At forberede genomisk DNA:
      1. Lyse celle pellet i 200 µl af 0,05 M NaOH. Med pipette overfoeres op og ned for at opløse pelleten.
      2. Varme cellen lysate til 98 ° C i 20 minutter i en PCR-maskine, og derefter køles ned til 25 ° C.
      3. Tilføje 20 µL 1,0 M Tris-HCl (pH 7,5) til rør og gemme DNA prøver ved 4 ° C.
    7. Blandes prøverne ved svippede og centrifugeres kortvarigt i 3-5 sekunder. Sætte rør i en PCR maskine.
    8. The PCR betingelse er angivet for 2 min på 92 ° C for indledende denaturering, efterfulgt af 40 cyklusser af 30 s på 94 ° C denaturering, 30 s ved 67° C for udglødning, 30 s på mindst 72 ° C til udvidelse og 10 m ved 72 ° C i endelige udvidelse.
    9. Efter PCR er færdig, tilsættes 3 µL af 6 x DNA lastning farvestof til hver prøve. Mix af svippede og centrifugeres kortvarigt i 3 ~ 5 sekunder.
    10. PCR produkter behandles ved elektroforese i en 2% (w/v) agarosegel i 1 x TAE buffer. Størrelsen af dens PCR produkt er 398 bp.
  2. Tag genotypebestemmelse.
    Følgende protokol kræver 10,5 µL af mastermix og 2 µL af genomisk DNA til hver prøve. Sørg for at swirl før du tilføjer hver reagens.
    1. Forberede en mastermix 4,5 µL nukleasen-gratis vand og 4.00 µL 5 x MyTaq reaktion Buffer for MyTaq DNA Polymerase.
    2. Tilføje 0,4 µL af 100 µM fremad primer TagF2: (5 ' - GGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG - 3 ') og 0,4 µL af 100 µM reverse primer TagR2: (5 ' - CAGAGCAGAATTGTGGAGTGG - 3 ') til master mix.
    3. Tilføje 0,8 µL af 10 µM beta-2-mikroglobulin forløber (B2m) primer mix for intern kontrol. PCR-primere for B2m er den interne kontrol, beta-2-mikroglobulin forløber (B2m), B2 F (5 ' - CACCGGAGAATGGGAAGCCGAA - 3 ') og B2 Rasmussen (5 ' - TCCACACAGATGGAGCGTCCAG - 3 ').
    4. Tilføje 0,4 µL MyTaq DNA Polymerase til mastermix.
    5. Blandes mastermix ved svippede tube med fingrene. Spin ned mastermix i centrifuge maskine til 3 ~ 5 s.
    6. Alikvot 10.5 µL fra mastermix til hver enkelt PCR rør. Swirl hver gang, før aliquoting til en ny tube.
    7. Swirl og tilføje 2 µL genomisk DNA skabelon til hver PCR rør. Genomisk DNA er forberedt som beskrevet ovenfor.
    8. Mix løsningen af svippede og centrifugeres kort for 3-5 sekunder. Sætte rør i PCR maskine.
    9. The PCR betingelse er indstillet til 3 min. ved 95° C for indledende denaturering, efterfulgt af 35 cyklusser af 15 s på 95 ° C denaturering, 15 s på 65 ° C i udglødning, 30 s på mindst 72 ° C til udvidelse, og 10 min ved 72 ° C i endelige udvidelse.
    10. Efter PCR er færdig, tilsættes 3 µL af 6 x lastning farvestof til hver prøve. Mix af svippede og centrifugeres kortvarigt i 3 ~ 5 sekunder.
    11. PCR produkter behandles ved elektroforese i 2% (w/v) agarosegel i 1 x TAE buffer. Størrelser af Tag og B2m PCR produkter er ~ 450 bp og 300 bp, hhv.
  3. tva genotypebestemmelse.
    Følgende protokol opfordrer til 10,5 µL af reagens blanding for hver prøve. Sørg for at swirl før du tilføjer hver reagens.
    1. Forberede en mastermix 5,6 µL nukleasen gratis vand, 0,5 µL DMSO, 1,25 µL 10 x Buffer II for AmpliTaq DNA Polymerase og 1.375 µL af 25 mM MgCl 2 og 0,125 µL af 25 mM dNTP.
    2. Tilføje 0,125 µL af 100 µM tva-3 (5 ' - GCCCTGGGGAAGGTCCTGCCC - 3 ') og 0,125 µL af 100 µM tva-5 (5 ' - CTGCTGCCCGGTAACGTGACCGG - 3 ') til mastermix.
    3. Tilføje 1.275 µL af 10 µM B2m primer mix for den interne kontrol til mastermix.
    4. Tilføje 0,125 µL AmpliTaq DNA Polymerase til mastermix.
    5. Blandes mastermix ved svippede tube med fingrene. Spin ned mastermix i centrifuge maskine kort for 3-5 sekunder.
    6. Alikvot 10.5 µL fra mastermix til hver enkelt PCR rør. Swirl hver gang, før aliquoting til en ny tube.
    7. Swirl og tilføje 2µL genomisk DNA skabelon til hver PCR rør. Genomisk DNA er forberedt som beskrevet ovenfor.
    8. Blandes løsningen ved at bladre og centrifugeres kort for 3-5 s. lagt rør i PCR-maskine.
    9. The PCR betingelse er angivet for 2 min på 92 ° C for indledende denaturering, efterfulgt af 35 cyklusser af 30 s på 94 ° C denaturering, 30 s på 60° C for udglødning, 30 sekunder ved 72 ° C i forlængelse, og 10 minutter ved 72 ° C for endelige udvidelse.
    10. Efter PCR er færdig, tilsættes 3 µL af 6 x lastning farvestof til hver prøve. Mix af svippede og centrifugeres kortvarigt i 3-5 s.
    11. PCR produkter behandles ved elektroforese i en 2% (w/v) agarosegel i 1 x TAE buffer. Størrelser af tva og B2m PCR produkter er 500 bp og 300 bp, hhv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I vivo og in vitro- infektion sats af RIP-Tag; RIP-tva tumorceller ved RCASBP-baseret virus er ~ 20% og ~ 80% henholdsvis 20. I RIP-Tag; RIP-tva musemodel, ca. 4% af de 400 i bugspytkirtlen Holme i hvert mus vil naturligt udvikle sig til tumorer 20; Derfor er der tilstrækkelig mængde af tumorceller i hvert mus for histologiske og fænotypiske analyse af den potentielle virkning af de gener, der er leveret af virus. Ved hjælp af dette system, var en roman nukleare funktion af Bcl-xL i metastase identificerede 9. RIP-Tag; RIP-tva mus inficeret med RCASBP -Bcl-xL udstillet en højere forekomst af invasive karcinom end mus inficeret med kontrol virus, RCASBP -ALPP (96% vs. 74%). Derudover 47% af RCASBP -Bcl-xL-inficeret RIP-Tag; RIP-tva mus udviklet metastaser i pancreas lymfeknuder når euthanized henne ved 16 ugens i alder (figur 3A), mens ingen metastase blev fundet i kontrol mus 20.

Desuden screenet vi et bibliotek af kræft gener i RIP-Tag; RIP-tva mus, og identificeret de første gen, der fremmer metastaser til pancreas lymfeknuder og den lever 21 (figur 3B og 3 C). Dette gen koder receptoren for hyaluronan-medieret motilitet isoform B (RHAMMB) protein og aktiverer EGFR signalering 21. Vi viste, at leveren-specifikke metastaser kan blive sammenfattet i en hale vene assay af eksperimentelle metastaser, N134 tumorceller i første omgang rundsendt via lunge kapillær senge af modtagerens immundefekte mus 21.

Figure 1
Figur 1 : Skematisk af RCASBP(A), RCAS-X og RCAS-Y konstruktioner. Kloning websteder er angivet med blå, fed skrift. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Placering af intracardiac injektion. Anatomiske landemærker er vist med stiplede streger på brystbenet (beskrevet i white). På musens hud, brystbenet notch og xyphoid proces tjene som vartegn, og nålen er indsat 1 mm fra midten brystbenet og lidt til venstre (anatomiske) af brystbenet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Påvisning af metastatisk pancreas β celler ved immunfarvning. Fotografier viser repræsentative synaptophysin farvning af metastatisk pancreas Neuroendokrine tumorer i pancreas lymfeknuder (A, B) eller i leveren (C). RIP-Tag; RIP-tva mus blev smittet med de angivne RCASBP retrovira på 7 uger gammel og euthanized henne ved 16 ugens i alder. Skalalinjen = 50 µm. oprindelige forstørrelse = 20 X. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse beskrev vi en kraftfuld musemodel, RIP-Tag; RIP-tva, at opnå somatiske gen levering via aviær retrovira til identifikation og karakterisering af metastatisk faktorer. Selv om RIP-Tag; RIP-tva mus udvikle pancreas Neuroendokrine tumorer, i denne musemodel metastatisk faktorer kan også fremme metastase af andre kræft-former.

Vores fremgangsmåde har fordelen af at indføre somatiske genetiske ændringer specielt i præmaligne læsioner i bugspytkirtlen β celler i en tid-kontrol måde, således mere trofast efterligne sporadiske menneskelige tumor udvikling. Denne metode undgår enhver potentiel undertrykkelse af netbårne af normale væv dannelse, som er ofte observeret i konventionelle transgene modeller som følge af et Ektopisk udtryk for gen af interesse under udvikling. Desuden er det meget hurtigere at generere aviær retroviral vektorer bærer gener af interesse end at generere Transgene mus. RCASBP-afledte aviær retroviral vektor kan levere cDNAs (≤2.5 kb), shRNAs, miRNAs og andre noncoding RNA'er tva-udtrykker celler in vitro og i vivo. Infektion (og flere infektion) effektivitet er afhængig af spredning sats på target-cellerne og tilgængelighed af celler. En titer på > 1 x 108 smitsomme enheder pr. ml er nødvendig for i vivo infektion. Mere effektiv viral levering kan være opnået in vitro- induceret celleproliferation og muligheden for gentagen eksponering af alle celler til virus.

Præcise intracardiac injektionsteknik er kritisk for levedygtigheden af mus. Først, en 50 µl af luftrummet i en insulin sprøjte før udarbejdelsen af viral suspension er afgørende for at se hjerte puls. Anden, det er vigtigt at fastsætte placeringen af sprøjten, når en rød puls af blod vises og langsomt levere 10-20 µl viral suspension når at se en lys rød puls af blod vises i sprøjten. Hvis lyse røde pulser af blod stoppe efter leveringen af 10-20 µl viral suspension, vil lidt repositionering nålen hjælpe. Tredje, efter sidste tryk stemplet til at levere viral suspension og før at se blod puls, nålen skal trækkes hurtigt ud af brysthulen og en blid pression over injektionsstedet vil bidrage til at mindske indre blødninger. Sidst men ikke mindst, ikke igen bruge insulin sprøjte på en anden mus.

For fremtidige ansøgninger, denne RIP-Tag; RIP-tva musemodel kan kombineres med andre transgene, knock-i og knockout musemodeller. Desuden forestiller vi kombinerer denne RIP-Tag; RIP-tva musen model med CRISPR-Cas9 genom-redigering værktøj til at generere enkelt punktmutationer, sletning, genomisk rearrangementer som omvendinger og omplantninger 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong og Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. understøttes af DOD grant W81XWH-16-1-0619 og NIH grant 1R01CA204916.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RCASBP-Y DV plasmid Addgene 11478
RCAS-RNAi plasmid Addgene 15182
DMEM Corning 10-013-CV
fetal bovine serum Atlanta Biologicals 25-005-CI
L-glutamine, 100x Corning 25-005-CI
Penicillin-Streptomycin solution, 100x Corning 30-002-CI
PBS-/-, 1x Corning 21-040-CV
Superfect Qiagen 301305
Polyallomer centrifuge tube Beckman Coulter 326823
0.45 mm Nalgene
Syringe Filters with PES Membrane		 Thermo Scientific 194-2545
Insulin Syringes BD 329461
synaptophysin Vector Laboratories VP-S284
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) Vector Laboratories PK-6101
AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II Life Technologies N8080153
MyTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21106

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The multistep nature of cancer. Trends Genet. 9 (4), 138-141 (1993).
  2. Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
  3. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  4. Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276 (2007).
  5. Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
  6. Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
  7. Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
  8. Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
  9. Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384 (2016).
  10. Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
  11. Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
  12. Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
  13. Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
  14. Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
  15. Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
  16. Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
  17. Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
  18. Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
  19. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  20. Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
  21. Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
  22. Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).

Tags

Kræftforskning spørgsmålet 128 mus model metastase RCAS somatiske genoverførsel RIP-Tag RIP-tva
Identifikation og karakterisering af metastatisk faktorer af genoverførsel i romanen <em>RIP-Tag; RIP-tva</em> Murine Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, G., Chi, Y., Du, Y. C. N.… More

Zhang, G., Chi, Y., Du, Y. C. N. Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model. J. Vis. Exp. (128), e55890, doi:10.3791/55890 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter