Summary
本文提出了一种利用 RIP 标记来演示一种新的体细胞基因转移系统的协议;tva小鼠模型研究基因在转移中的作用。禽病毒的 intracardiacally, 以确保基因转移到前, 无创性病变的胰β细胞在成年小鼠。
Abstract
转移性肿瘤占90% 的死亡患者的实体肿瘤。迫切需要更好地了解癌症转移的驱动因素, 并确定新的治疗靶点。为了研究推动从原发癌转移的分子事件, 我们开发了一个 bitransgenic 的小鼠模型, RIP 标签;RIP-tva。在这个老鼠模型中, 大鼠胰岛素启动子 (RIP) 驱动 SV40 T 抗原 (Tag) 和受体的表达的亚群 A 禽白血病病毒 (tva) 在胰腺β细胞。小鼠的胰腺神经内分泌肿瘤100% 显通过明确的阶段, 类似于人的肿瘤, 包括增生, 血管生成, 腺瘤, 和浸润性癌的阶段。因为RIP 标记;tva小鼠不发育转移性疾病, 促进转移的基因改变可以很容易地被识别出来。体细胞基因转移到 tva 表达, 增殖胰腺β前病变是通过心内注射的鸟类病毒窝藏期望的基因改变。#62 的效价; 1 x 108每毫升的感染单位被认为适合于体内感染。此外, 禽病毒可感染从肿瘤中提取的细胞系, 在RIP 标签;tva小鼠, 效率高。细胞系也可以用来表征转移的因素。在这里, 我们演示如何利用这种小鼠模型和细胞系来评估候选基因在肿瘤转移中的作用。
Introduction
大多数癌症都是由体细胞突变引起的1。传统的基因工程小鼠模型 (GEMM) 提供了重要的洞察力的贡献, 具体的基因改变的肿瘤发生的2。但是, 它们有几个限制。这些模型的主要缺点是, 它们不复制人类肿瘤形成的零星性质, 在这种情况下, 只有组织内的一些细胞才能获得基因改变。转基因和剔除小鼠的突变也系有可能影响发展。此外, 生成这些鼠标模型是昂贵和耗时的。
转移是一个重要的问题在癌症领域。模型转移在 GEMM 是困难的。小鼠自发转移是罕见的。显是可变的, 潜伏期很长, 在转移的 GEMM 3。实验性转移模型采用直接注射细胞进入小鼠的循环, 从而消除了转移级联的早期步骤。
为了克服在小鼠模型中研究转移因子的一些局限性, 我们开发了一个 bitransgenic 的鼠标模型, RIP 标签;RIP-tva4。该策略的基础是结合使用高度同步的肿瘤进展小鼠模型, RIP 标记5, 和受体的子群-禽白血病病毒, tva 6,7。此RIP 标记;RIP tva的鼠标模型允许基因被引入体细胞到一个单一的 bitransgenic 老鼠菌株。随着 SV40 T 抗原抑制 Rb 和 p53 的抑瘤作用, 小鼠的胰腺神经内分泌肿瘤与人的肿瘤形成相似, 包括增生、血管生成、腺瘤和浸润性癌。这个RIP 标签模型对我们了解癌症的特征非常有启发意义, 而不限于胰腺神经内分泌肿瘤。它也被用于临床前试验8。
我们提出了一个协议的体细胞基因转移通过注射禽病毒 intracardiacally 到RIP 标签;tva鼠标。成功的感染与 RCASBP 源性禽病毒需要积极增殖靶细胞。因此, 我们选择了RIP 标记;tva小鼠在7周的年龄, 当增生在约50% 的胰岛发育。需要高效价病毒的左心室心内注射, 以达到 10-20% 4的感染效率。这种传递方法减少病毒颗粒在传播到胰岛前的有效稀释。
使用这种方法, 我们以前已经证明, 亡促进肿瘤转移独立于其功能4,9。这种亡独立的转移功能没有观察到时, 通过转基因在所有的胰腺β细胞在整个瘤个体发育的RIP 标签;RIP-多 xL鼠标型号10。因此, 我们的鼠标模型提供了一个独特的机会, 以确定和表征基因的功能时, 表达的后期阶段的肿瘤。因为2-4% 的小岛发展成肿瘤在RIP 标签;tva bitransgenic 小鼠无病毒感染, 并非所有的前病灶都感染了 RCASBP 源性禽病毒, 只有具有选择性优势的因素才能确定肿瘤的自然病程。特别是, 转移因素将是最容易识别的这种方法, 因为转移到胰腺淋巴结或其他器官通常不会发生在RIP 标签;tva鼠标。
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Protocol
道德声明: 动物实验是按照由威尔康奈尔医学研究所动物护理和使用委员会规定的准则和条例进行的.
1. 选择禽类逆转录病毒载体 (RCASBP (a) 基或 RCANBP (a))
- 向量是从瓣肉瘤毒 11 派生的。禽逆转录病毒载体可以提供基因 (和 #8804; 2.5 kb), 短发夹 rna (shRNAs), rna (rna) 和其他编码 rna。在 材料 中列出了商业上可用的向量, 其他需要直接从作者那里请求.
- 要过度感兴趣的基因 , 请使用下列向量之一, RCASBP (A) 12 ( 图 1A ), 会 x ( 图 1B ), 会-Y 13 ( 图 1C ), RCASBP-Y DV 14 , 或其他 ALV-一个向量 (https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html).
- 要通过 shRNA 来敲出感兴趣的基因 , 请使用下列矢量之一: 瑞 x DV 15 或会-rna 干扰 16 .
- 过度 rna , 生成会的向量, 如在 17 中所述。
- 转换为 大肠杆菌 和 DNA 要求.
- 最好将 DNA 转化为 Stbl2 或 Stbl3 的合格细胞, 它们具有独特的基因型以稳定直接重复和反转录病毒序列。纯化质粒 dna 的方法, 将产生纯, 转染级 dna。5和 #181; 在最小浓度为0.1 和 #181 的情况下需要 DNA g; g/和 #181; i.
2。病毒在鸡成纤维细胞 DF1 细胞系中的传播
- 使用筛选过的吸管提示进行细胞培养, 以防止 cross-contaminating 病毒种群 18 。
- 在 6 cm 盘中保持 DF1 细胞生长培养基 (DMEM 高糖, 10% 胎牛血清, 6 毫米 (最终浓度) l-谷氨酰胺, 10 单位/毫升青霉素, 10 和 #181; g/毫升链霉素) 在 37 o C 和 5% CO 2 。如果 DF1 细胞是从冷冻储存新鲜解冻, 培养他们至少3天前转染.
- 在转染前一天, 将 DF1 细胞传递到 6 cm 组织培养皿中, 使其在转染时为30-50% 汇合.
- 稀释5和 #181; DMEM (不含血清、青霉素或链霉素) 的纯病毒 DNA, 总体积为150和 #181; l 在组织培养罩内的离心管中.
- 添加30和 #181; L Superfect 直接进入稀释后的 DNA 管; 漩涡这种混合物十年代; 在室温下将混合物留在组织培养罩中5-10 分钟, 以允许转染复杂的形成.
- 虽然复杂的地层发生, 轻轻地从 DF1 细胞培养皿中吸取生长培养基, 并小心地用4毫升 PBS 洗涤细胞 -/-.
- 吸管5毫升生长培养基 (含血清和抗生素); 下一步, 将4毫升的猎鹰管保存起来; 并将其余的1毫升培养基添加到转染复合物中。由移混合两次, 并立即转移整个转染配合物 DF1 细胞。漩涡, 以确保细胞层覆盖;在 37 o C 上孵育2-3 小时.
- 吸入转染混合物; 用4毫升 PBS 洗涤细胞 --; 添加4毫升的新鲜生长培养基 (含血清和抗生素); 将单元格返回到 37 o C 孵化器.
- 当细胞到达 70-100, 传代细胞 (瞬态表达式可在转染后48到72小时).
- 继续传递单元格大约7天, 直到所有的细胞都被感染; 用 PCR 方法检测病毒 DNA 的整合, 用印迹法测定蛋白质表达; 用10% 亚砜和20% 胎牛血清 DMEM 培养基中的冷冻细胞.
3。 在体内 感染 RIP 标签;RIP-tva 鼠标
- 病毒收集和浓度
使用新的浓缩病毒进行 体内 感染。在一周内保存在 4 o C 中的病毒的效价不会显著降低。然而, 冷冻等分的病毒性股票显示10倍降低滴度后解冻。- 根据所需的病毒数量将病毒生产者 DF1 细胞扩展到 15 cm 的菜肴中。对于 在体内 鼠标感染, 请为每只鼠标准备一个平均盘.
- 预冷转子 (例如, SW28)、摆动桶和 ultracentrifuge 机到 4 o C.
- 从汇合的15厘米的菜肴中收集上清。用低速离心法在 1650 x g 处去除细胞碎片, 10 分钟, 在 4 o C.
- 将病毒上清液转移到 ultracentrifuge 管 (Polyallomer 离心管)。在 ultracentrifuge 中旋转1.5 小时, 95400 x g 4 o C。对于贝克曼 XL-100 ultracentrifuge 机, 使用加速: 1;Decel: 1 设置.
- 尽可能多地从 ultracentrifuge 管中去除上清。添加 pbs 没有钙和镁 (pbs --) 到 ultracentrifuge 管, 使最终100和 #181; l 病毒悬浮从一个 15 cm 菜。用膜盖住管子。重涡流的 ultracentrifuge 管, 在中速2分钟, 以不可见的病毒颗粒.
- 将 ultracentrifuge 管晃动 4 o C, 一小时至一夜.
- 将病毒悬浮液转移到离心管中。在注射到小鼠之前, 将病毒悬浮液加热到室温.
- 病毒效价确定.
对于每一个新的病毒结构, 病毒滴度需要确定之前, 在体内 感染。- 种子 DF1 细胞在12孔组织培养板的所有井中 (建议: 2 x 10 4 细胞/井, 1 毫升/井), 使他们将是30% 汇合在感染时。一个 12-井板是需要一个病毒滴度测定.
- 在生长培养基上制作一系列10倍稀释的病毒上清液, 如:
- 混合5和 #181; l 病毒上清与495和 #181; l 生长培养基为 10 2 稀释在离心管中。短暂的漩涡几秒钟.
- 40 和 #181; l 从 10 2 稀释为360和 #181; l 生长培养基在离心管为 10 3 稀释。短暂的漩涡几秒钟.
- 按照步骤 3.2.2.2 10 4 和 10 5 稀释.
- 设置5的6毫升聚苯乙烯管。分2.25 毫升培养基每管, 并标签他们 10 6 , 10 7 , 10 8 , 10 9 , 10 10 , 分别.
- 混合0.25 毫升从 10 5 稀释与2.25 毫升生长介质在6毫升聚苯乙烯管 10 6 稀释。短暂的漩涡几秒钟.
- 按照步骤 3.2.2.5 10 7 、10 8 、10 9 和 10 10 稀释。
- 从 12-井板上的 DF1 细胞中删除原始培养基。将1毫升稀释病毒复制到每个井中 (未感染, 10 10 到 10 6 /毫升).
- 允许单元格至少增长7天 (必要时执行 trypsinzation)。收集细胞, 以分离 DNA 和检查是否存在的病毒 dna PCR 的描述和 #34; 6。PCR 协议和 #34;如果这种病毒的效价每毫升有 10 8 感染单位 (毫升), 从 RCASBP 的阳性 398 bp PCR 产物将使用 10 8 到 10 6 的细胞 DNA, 而不是来自未感染的细胞, 或有 10 10 到 10 9 的细胞。病毒。#62 的效价; 1 x 10 8 每毫升的感染单位应用于 体内 感染. 本研究使用了
- 心内注射
Hemizygous RIP 标记 小鼠, 而非纯合小鼠。Hemizygous RIP 标记 小鼠的胰腺神经内分泌肿瘤在10〜12周的年龄, 而纯合小鼠肿瘤潜伏期较短。因为细胞增殖是需要将病毒 cDNA 纳入宿主基因组, 7 周老 RIP 标签;tva 增生胰和 #946 小鼠; 使用细胞。请注意, 最正常的和 #946; 细胞没有增殖的成年小鼠。- 使用7周以前的 RIP 标记;RIP tva 鼠标在纯 C57BL/C 背景下进行实验.
- 麻醉鼠标使用氯胺酮/嗪组合 (150 毫克/千克; 15 毫克/千克)。使用热支持在整个麻醉期内保持鼠标体温.
- 用眼睛润滑剂来防止角膜干燥.
- 剃毛从胸腔的 RIP 标签;tva 鼠标。将鼠标放在背部, 胸部朝上。用脚趾夹紧观察动物的 non-responsiveness 以确认全身麻醉效果.
- 伸展前部肢体并用胶带固定它们。将鼠标和 #39 的标记用于注射。在胸骨切口和 xyphoid 过程的顶端之间标记一个位置, 并略微左 (解剖) 胸骨 ( 图 2 ).
- 用聚维酮碘磨砂擦洗前胸壁, 或用70% 异丙醇或70% 乙醇浸泡过的纱布海绵擦洗.
- 绘制50和 #181; 空气进入无菌28克和 #189; 胰岛素注射器在500和 #181 的柱塞和半月板之间创造空间, 然后用注射器, 然后绘制100和 #181; l 病毒。在墙上没有任何液体的空气空间对于看到心脏脉搏是至关重要的.
- 保持针直立。用一只手握住鼠标绷紧的皮肤, 并将针插入到标记的位置。当一个鲜红的血脉冲出现在注射器中时, 停止推进针头, 用一只手把针的深度固定在鼠标上.
- 使用另一只手仔细和缓慢地推动柱塞提供病毒悬浮 (〜100和 #181; l 容量) 超过60秒的时间。提供10-20 和 #181; 我每次看到一个鲜红的血脉冲出现在注射器里。在透明的针毂上连续入口红色的含氧血, 表明针正确定位到左心室.
- 在最后一推后, 柱塞将病毒悬浮, 在看到下一个红色脉搏之前, 迅速将针头从胸腔中取出.
- 在注射部位施加轻柔压力, 以减少至少1分钟的出血量.
- 小心地将鼠标移到加热垫或热灯下直到完全清醒。小鼠将被观察直到麻醉消退, 这样他们可以离开刺激, 一个周期通常持续大约一个小时。每天都会对小鼠进行监测, 以得到均匀、完整的外衣和任何行为上的改变.
4。肿瘤的病理组织学分析
- 注射后九周, 安乐16周的 RIP 标记;tva 鼠标。记录大小和数量的原发性胰腺肿瘤和任何总转移.
- 在一个摇摆的平台上, 在室温下过夜, 用10% 的福尔马林固定胰腺、肝脏和/或其他器官.
- 第二天将固定组织转移到70% 乙醇。将组织加工成石蜡嵌段.
- 对突 (神经内分泌标记) 或胰岛素 (a 和 #946; 细胞特异标记) 进行免疫组织化学染色, 以确定胰腺和 #946 转移的指示; 胰腺淋巴结细胞或肝脏。然而, de-differentiated 肿瘤细胞或分化不良的肿瘤细胞可能会失去胰岛素的表达, 只能通过突免疫.
5。 体外 tva 表达细胞的感染
不需要使用浓缩病毒进行 体外 感染。下面描述的是两轮感染的协议。可以通过重复以下协议来进行进一步的感染.
- 从汇合的 DF1 细胞中收集病毒上清液。在一周内将病毒上清液保存在 4 o C 中以进行感染。感染前, 通过0.45 和 #956; m 过滤器, 通过病毒上清, 以获得无细胞病毒.
- 简要冲洗 tva 表达的靶细胞 (即 N134 胰腺和 #946; 细胞瘤细胞系从 RIP 标签;tva 鼠标) 与 PBS -/- 删除所有的血清的痕迹, 其中含有胰蛋白酶抑制剂。用胰蛋白酶-edta (如 0.25% Trypsin-2.21 毫米 edta) 溶液简单冲洗 tva 表达靶细胞。加入胰蛋白酶-EDTA 溶液, 孵育2分钟。轻轻拍打盘子。在倒置显微镜下观察细胞。细胞通常在2到3分钟的种子靶细胞中分离成6厘米的板。使用 3 ~ 4 毫升过滤病毒上清作为生长培养基.
注意: 病毒上清液中的营养是由 DF1 细胞消耗的, 所以第二天改变培养基. - 在第二天, 将足够多的病毒上清液加热到室温。从靶细胞中取出培养基, 用3-4 毫升病毒上清液取代.
- 在第三天, 根据需要通过细胞。如果细胞密度不够传代热身〜4毫升的常规生长培养基 (DMEM 与高糖, 10% 胎牛血清, 6 毫米 (最终浓度) l-谷氨酰胺, 10 单位/毫升青霉素, 10 和 #181; 链霉素), 以取代病毒上清.
- 扩展受感染的细胞并通过西方印迹检查候选蛋白表达式 19 。transwell 分析了候选基因对迁移和侵袭的影响。这些细胞系也可以测试其转移潜能的肝脏在尾静脉检测转移.
6。PCR 协议
解决方案应尽快在冰上组装。一个 mastermix 没有模板可以为大量的样品和 aliquoted 到 PCR 管。乘以样品数量所需的试剂数量。在服用一些添加到 mastermix 之前, 先用吸管尖端的前旋和旋流来混合试剂。在将每个试剂添加到 mastermix 管后, 吸管向上和向下, 以便在提示中提供任何残留物.
- 检测受感染或转染的单元格中是否存在 RCASBP.
以下协议要求11.5 和 #181; mastermix 和1和 #181 的 l; 每个样本的基因组 DNA 的 l。在添加每个试剂之前, 请务必先旋转。- 准备7.68 和 #181 的 mastermix; 核酸, 0.75 和 #181; 二甲基亚砜, 1.25 和 #181; l 10x 缓冲 II, 用于 AmpliTaq DNA 聚合酶, 1.375 和 #181; 25 mm 氯化镁 2 , 0.125 和 #181; 25 mm dNTP 的 l.
- 添加0.125 和 #181; 100 和 #181 的 l. RCAS5626F: (5 和 #39; ACCGGGGGATGCGTAGGCTTCA-3 和 #39;), 0.125 和 #181; 100 和 #181; m 反向底漆 RCAS6023R: (5 和 #39;-CCGCAACACCCACTGGCATTACC-3 和 #39;) mastermix.
- 添加0.075 和 #181; 我 AmpliTaq DNA 聚合酶到 mastermix.
- 通过用手指弹管来混合 mastermix。在离心机上旋转 matermix briefly 为 3 ~ 5 秒.
- 分11.5 和 #181; L 从 mastermix 到每个单独的 PCR 管。每次 aliquoting 前都要旋转到一个新的管子上.
- 旋流, 并添加1和 #181; L 基因组 DNA 模板到每个 PCR 管。准备基因组 DNA:
- 200 和 #181 中的溶解细胞颗粒; 0.05 米氢氧化钠的 l。吸管向上和向下溶解颗粒.
- 在 PCR 机中加热98和 #176; c 为20分钟, 然后冷却到25和 #176; c.
- 添加20和 #181; L 1.0 M 三盐酸 (pH 7.5) 到管, 并存储在4和 #176 的 DNA 样本; C.
- 通过轻弹和离心机将样品混合3-5 秒。将管子放入 PCR 机.
- PCR 条件设置为2分钟, 在92和 #176; c 为最初的变性, 其次40周期三十年代在94和 #176; c 为变性, 三十年代在67和 #176; c 为退火, 三十年代在72和 #176; c 为延长, 并且 10 m 在72和 #176; c 为最后的扩展.
- 在 PCR 完成后, 添加3和 #181; 对每个样品进行 6x DNA 加载染色。混合通过轻弹和离心机短暂3〜5秒.
- 2% (w/v) 琼脂糖凝胶电泳检测1x 泰缓冲液中的 PCR 产物。其 PCR 产物的大小为 398 bp.
- 标记基因分型.
以下协议要求10.5 和 #181; mastermix 和2和 #181 的 l; 每个样本的基因组 DNA 的 l。在添加每个试剂之前, 请务必先旋转。- 准备 mastermix 4.5 和 #181; 核酸的水和4.00 和 #181; l 5x MyTaq 反应缓冲 MyTaq DNA 聚合酶.
- 添加0.4 和 #181; 100 和 #181 的 l 向前引 TagF2: (5 和 #39; GGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG-3 和 #39;) 和0.4 和 #181; 100 和 #181; m 反向底漆 TagR2: (5 和 #39;-CAGAGCAGAATTGTGGAGTGG-3 和 #39;) 主组合.
- 添加0.8 和 #181; 10 和 #181 的 L beta-2-microglobulin 前体 (B2m) 底漆混合为内部控制。B2m 的 PCR 引物的内部控制, beta-2-microglobulin 前体 (B2m), 是 B2 F (5 和 #39; CACCGGAGAATGGGAAGCCGAA-3 和 #39;) 和 B2 R (5 和 #39; TCCACACAGATGGAGCGTCCAG-3 和 #39;).
- 添加0.4 和 #181; 我 MyTaq DNA 聚合酶到 mastermix.
- 通过用手指弹管来混合 mastermix。在离心机上旋转 mastermix 3 ~ 5 秒.
- 分10.5 和 #181; L 从 mastermix 到每个单独的 PCR 管。每次 aliquoting 前都要旋转到一个新的管子上.
- 旋流, 并添加2和 #181; L 基因组 DNA 模板到每个 PCR 管。基因组 DNA 的制备如上所述.
- 通过轻弹和离心机混合解决方案3-5 秒。将管子放入 PCR 机.
- PCR 条件设置为3分钟, 在95和 #176; c 为最初的变性, 其次35周期十五年代在95和 #176; c 为变性, 十五年代在65和 #176; c 为退火, 三十年代在72和 #176; c 为延长, 并且 10 min 在72和 #176; c 为最后的扩展.
- 在 PCR 完成后, 将3和 #181 添加到每个样品的6x 加载染料中。混合通过轻弹和离心机短暂3〜5秒.
- 2% (w/v) 琼脂糖凝胶在1x 泰缓冲液中检测 PCR 产物。标签和 B2m PCR 产品的大小分别为 450 bp 和 300 bp.
- tva 基因分型.
下面的协议要求10.5 和 #181, 每个样本的试剂混合的 L。在添加每个试剂之前, 请务必先旋转。- 准备5.6 和 #181 的 mastermix; 核酸免费水, 0.5 和 #181; 二甲基亚砜, 1.25 和 #181; l 10x 缓冲 II 为 AmpliTaq DNA 聚合酶, 和1.375 和 #181; l 25 毫米氯化镁 2 , 0.125 和 #181; 25 mm dNTP.
- 添加0.125 和 #181; 100 和 #181 的 l tva-3 (5 和 #39; GCCCTGGGGAAGGTCCTGCCC-3 和 #39;), 0.125 和 #181; 100 和 #181; m tva-5 (5 和 #39; CTGCTGCCCGGTAACGTGACCGG-3 和 #39;) mastermix.
- 添加1.275 和 #181; L 10 和 #181; M B2m 底漆混合为内部控制对 mastermix.
- 添加0.125 和 #181; 我 AmpliTaq DNA 聚合酶到 mastermix.
- 通过用手指弹管来混合 mastermix。在离心机中旋转 mastermix 3-5 秒.
- 分10.5 和 #181; L 从 mastermix 到每个单独的 PCR 管。每次 aliquoting 前都要旋转到一个新的管子上.
- 旋流, 并添加2和 #181; L 基因组 DNA 模板到每个 PCR 管。基因组 DNA 的制备如上所述.
- 将解决方案通过轻弹和离心机混合使用3-5 秒将管子放入 PCR 机.
- PCR 条件设置为2分钟, 在92和 #176; c 为最初的变性, 跟随35周期三十年代在94和 #176; c 为变性, 三十年代在60和 #176; c 为退火, 30 秒在72和 #176; c 为延长, 10 分钟在72和 #176; c 为最后的扩展.
- 在 PCR 完成后, 将3和 #181 添加到每个样品的6x 加载染料中。混合通过轻弹和离心机简要地为 3-5 s.
- 2% (w/v) 琼脂糖凝胶电泳检测1x 泰缓冲液中的 PCR 产物。tva 和 B2m PCR 产物的大小分别为 500 bp 和 300 bp.
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Representative Results
RIP 标记的体内和体外感染率;RIP tva肿瘤细胞由 RCASBP-based 病毒分别为 ~ 20% 和 ~ 80% 20。在RIP 标记中;RIP-tva鼠标模型, 大约4% 的400胰岛在每只老鼠将自然发展成肿瘤20;因此, 每只小鼠体内都有足够数量的肿瘤细胞进行组织学和表型分析, 以研究病毒所传递的基因的潜在作用。利用该系统, 确定了一种新的核功能--xL 在转移中的作用是9。RIP 标记;RIP tva感染 RCASBP 的小鼠--xL显示侵袭性癌的发病率高于感染控制病毒的小鼠, RCASBP-ALPP (96% 与 74%)。此外, 47% 的 RCASBP--xL-感染的RIP 标记;tva小鼠在16周的年龄 (图 3A) 被安乐死时, 在胰腺淋巴结中发展出转移, 而在控制小鼠中没有发现转移的情况20。
此外, 我们筛选了一个癌症基因库在RIP 标签;tva鼠, 并确定了第一个基因, 促进转移到胰腺淋巴结和肝脏21 (图 3B和3C)。该基因编码的受体为透明质酸介导的运动型 B (RHAMMB) 蛋白和激活 EGFR 信号21。我们证明, 肝特异性转移可以扼要的实验转移的尾静脉检测, 其中 N134 肿瘤细胞最初通过肺毛细血管床传播的受体缺陷小鼠21。
图 1: RCASBP (A)、会 x 和会 y 构造的示意图.克隆站点以蓝色、粗体字体表示。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 心脏内注射的位置.解剖地标显示在胸骨上的水平虚线 (白色轮廓)。在老鼠的皮肤上 , 胸骨切口和 xyphoid 过程作为地标 , 并且针入 1 毫米从 mid - sternum 和轻微地左 ( 解剖学 ) 胸骨。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 免疫转移性胰β细胞的检测.照片显示胰腺淋巴结转移 (a、B) 或肝脏 (C) 中的胰腺神经内分泌肿瘤的代表性突染色。RIP 标记;tva鼠在7周龄时感染了 RCASBP 病毒, 并在16周龄时被安乐死。缩放条 = 50 µm. 原始放大倍数 = 20X。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在本研究中, 我们描述了一个强大的鼠标模型, RIP 标签;RIP-tva,通过禽病毒实现体细胞基因的传递, 以确定和鉴定转移因子。虽然RIP 标记;tva小鼠开发胰腺神经内分泌肿瘤, 在这种小鼠模型中发现的转移因子也可能促进其他癌症类型的转移。
我们的方法有优势, 引入体细胞遗传变化, 特别是前病变胰腺β细胞的控制方式, 从而更忠实地模仿偶发人类肿瘤的发展。这种方法避免了正常组织形成的任何潜在的扰动, 这在传统的转基因模型中经常被观察到, 因为发育过程中的兴趣基因的异位表达。此外, 生成有兴趣基因的禽类逆转录病毒载体比生成转基因小鼠要快得多。RCASBP 衍生的禽逆转录病毒载体可以提供基因 (≤2.5 kb), shRNAs, rna, 和其他编码 rna 的 tva 表达细胞在体外和在体内。感染的效率 (和多重感染) 取决于目标细胞的增殖率和细胞的可及性。1 x 108每毫升的感染单位对于体内感染是必需的。更有效的病毒传递可以实现体外由于诱导细胞增殖和可能重复暴露所有细胞的病毒。
精确的心内注射技术对小鼠的生存能力至关重要。首先, 一个50µl 的空气空间在一个胰岛素注射器, 在制定病毒悬浮是至关重要的看到心脏脉搏。其次, 一旦出现血红色脉搏, 就必须修复注射器的位置, 当看到注射器中出现鲜红的血脉冲时, 就会缓慢地提供10-20 µl 病毒悬浮液。如果鲜红的血液脉冲停止后, 10-20 µl 病毒悬浮, 轻微重新定位针将帮助。第三, 在最后一推柱塞, 以提供病毒悬浮和之前看到的血液脉搏, 针需要迅速缩回出胸腔和温和的压力施加在注射部位将有助于减少内出血。最后但并非最不重要的是, 不要再用另一只老鼠的胰岛素注射器。
对于将来的应用程序, 此RIP 标记;RIP tva鼠标模型可以与其他转基因、基因和挖空鼠标模型组合。此外, 我们设想结合这个RIP 标签;RIP tva鼠标模型与 CRISPR-Cas9 基因组编辑工具产生单点突变, 删除, 基因组重如反转和易位22。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢哈罗德 Varmus, 布赖恩 c. 刘易斯, 道格拉斯 Hanahan, 丹尼黄, 沙龙庞, 梅根黄, 和玛纳斯河 m. 哥博利。y.c.n. D. 得到国防部 W81XWH-16-1-0619 和 NIH 补助金1R01CA204916 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
References
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