Summary
Мы представляем протокол продемонстрировать Роман соматическая генная система передачи, используя RIP-тегов; RIP-tva мыши модель для изучения функции генов в метастазов. Птичий ретровирусы поставляются intracardiacally обеспечить перенос генов в предварительно злокачественных, неинвазивный поражения поджелудочной железы β-клеток у взрослых мышей.
Abstract
Метастатического рака составляет 90% случаев смерти среди больных с солидными опухолями. Существует настоятельная необходимость лучше понять водителей метастазов рака и для выявления роман терапевтических целей. Расследовать молекулярные события, которые управляют прогрессии от первичного рака метастазы, мы разработали модель bitransgenic мыши, RIP-тегов; РИП tva. В этой модели мыши крысы инсулина промоутер (RIP) диски выражение антигена SV40 T (тег) и рецепторов для подгруппы вирус птичьего лейкоза (НДС) в клетках поджелудочной железы β. Мышей развивать нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы с 100% пенетрантностью через четко определенные этапы, которые похожи на человека tumorigenesis, с этапов, включая гиперплазии, ангиогенез, аденома и инвазивной карциномы. Потому что RIP-тега; RIP-tva мышей не развиваются метастатической болезни, генетические изменения, способствующие метастазы могут быть определены легко. Соматическая генная передача в tva выражая, размножающихся поджелудочной железы β предраковых поражений достигается через внутрисердечной инъекции птичьего ретровирусы, укрывательство желаемого генетические изменения. Титр > 1 x 108 инфекционных единиц / мл считается подходящим для инфекции в естественных условиях . Кроме того птичьего ретровирусы могут заразить клеточных линий, полученных от опухоли в RIP-тегов; RIP-tva мышей с высокой эффективностью. Линии клетки также может использоваться для характеристики метастатического факторов. Здесь мы показано, как использовать эту модель мыши и клеточной линии для оценки функции генов кандидата в метастазов опухоли.
Introduction
Большинство раковых заболеваний возникают от соматических перегласовок 1. Обычные генетически модифицированные мыши модели (ГЭММ) оказали значительное понимание вклада конкретных генетических изменений к tumorigenesis 2. Однако они имеют некоторые ограничения. Основным недостатком этих моделей является, что они не повторить спорадический характер образования опухоли в организме человека, в которых только некоторые клетки внутри ткани приобретают генетические изменения. Мутации в нокаут и трансгенных мышей также являются микрофлорой потенциально могут повлиять на развитие. Кроме того создание этих моделей мыши является дорогостоящим и трудоемким.
Метастазирование является важным вопросом в области рака. Моделирование метастазирование был трудным в ГЭММ. Спонтанное метастазов редок в мыши. Пенетрантностью является переменной и задержка в ГЭММ метастазированием 3. Экспериментальный метастазов модели используют прямой инъекции клеток в оборот мышей, поэтому первые шаги в метастатических Каскад удаляются.
Чтобы преодолеть некоторые из вышеуказанных ограничений в изучении метастатического факторов в модели мыши, мы разработали модель bitransgenic мыши, RIP-тегов; РИП tva4. Стратегия основана на комбинированное использование модель мыши прогрессии опухоли весьма синхронизированы, RIP-тег 5, и рецептора для подгруппы A птичьего лейкоза вирус, tva 6,7. Этот RIP-тег; RIP-tvaмодель мыши позволяет гены соматически вносимых в единый bitransgenic мыши штамм. С антигеном SV40 T, подавления опухоли подавляющие функции Rb и p53 мышей развивать нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы в Аналогичным образом человека tumorigenesis, с этапов, включая гиперплазии, ангиогенез, аденома и инвазивной карциномы. Эта модель RIP-тег был весьма поучительна для понимания отличительными признаками рака, не ограничиваясь нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы. Он также был использован в доклинических испытаний 8.
Мы представляем протокол для передачи соматическая генная через инъекции птичьего ретровирусы intracardiacally в RIP-тегов; RIP-tva мышей. Успешное инфекции с RCASBP-производные птичьего ретровирусы требует активно пролиферирующих клеток-мишеней. Поэтому мы выбрали RIP-тегов; RIP-tva мышей в 7 недель возраста, когда в около 50% панкреатических островков развивается гиперплазия. Для достижения эффективности 10-20% 4инфекции требуется левого желудочка внутрисердечной инъекции высокий титр вирусов. Этот способ доставки уменьшает значительное разбавление вирусных частиц в циркуляции вирусов до панкреатических островков.
Используя этот подход, мы ранее продемонстрировали, что Bcl-xL способствует метастазов рака, независимо от его анти apoptotic функция 4,9. Эта функция анти apoptotic независимые метастатическим не наблюдалось, когда Bcl-xL была выражена через трансген во всех клетках поджелудочной железы β всей онкогенной Онтогенез в RIP-тегов; RIP-Bcl-xL мыши модель 10. Таким образом наша модель мыши предлагает уникальную возможность для определения и описания функций генов когда выражена на более позднем этапе tumorigenesis. Потому что 2-4% островков развиться в опухоли в RIP-тегов; RIP-tva bitransgenic мышей без вирусной инфекции и не все предраковых поражений заражены RCASBP-производные птичьего ретровирусы, могут быть определены только те факторы, которые возлагают селективное преимущество над естественный ход развития опухолей. В частности метастатические факторов будет легче всего признана этим методом, потому что метастазы поджелудочной железы лимфатические узлы или другие органы обычно не происходит в RIP-тегов; RIP-tva мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
этика заявление: эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Институтом животных уход и использование Комитета Weill Cornell медицины.
1. Выбор птичьего ретровиральных векторов (на основе RCASBP A или RCANBP(A)-based)
- векторов была получена от вируса саркомы Рауса 11. Птичий ретровиральных векторов может доставить cDNAs (≤ 2.5 kb), короткая шпилька РНК (процессируются), микроРНК (интерферирующим) и другие некодирующей РНК. Коммерчески доступные векторов, перечислены в материалах и другие должны запрашиваться непосредственно от авторов.
- Для overexpress гены интереса, используйте один из следующих векторов, RCASBP(A) 12 ( рис. 1а), орк-X ( рис. 1B), орк-Y 13 ( рис. 1 c), RCASBP-Y DV 14, или других векторов ALV-A (https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html).
- Стучать гены интереса индуцируемый, используйте один из следующих направлений: DV RCAN-X 15 или 16 орк-RNAi.
- Для overexpress адаптивной, создают вектор орк мир, как описано в 17.
- Преобразование в E. coli и ДНК требование.
- Желательно преобразовать ДНК в Stbl2 или Stbl3 сведущие клетки, которые имеют уникальный генотип стабилизировать прямой последовательности повторить и антиретровирусного лечения. Очистить плазмида ДНК с помощью метода, который даст чистый, transfection класс ДНК. 5 мкг ДНК необходима с минимальной концентрацией 0,1 мкг/мкл.
2. Вирусного распространения в линии клетки DF1 фибробластов куриного
- использования отфильтрованных наконечники для клеточной культуры требуется для предотвращения кросс загрязнять вирусные акции 18.
- Клетки поддерживать DF1 в 6 см блюдо с ростом среднего (DMEM с высоким глюкозы, 10% плода бычьим сывороточным, 6 мм (конечная концентрация) L-глютамином, 10 единиц/мл пенициллин, стрептомицин 10 мкг/мл) на 37 o C и 5% CO 2. Если клетки DF1 свежей талой из замороженных запасов, культура их по крайней мере 3 дней перед transfection.
- За один день до трансфекции, передать 6 см ткани культуры блюдо DF1 клетки так, что они будут 30-50% притока в то время transfection.
- Разбавить 5 мкг чистого вирусной ДНК с DMEM (без сыворотки, пенициллина и стрептомицина) в суммарный объем 150 мкл в пробки microcentrifuge внутри культура ткани капюшоном.
- Добавить 30 мкл Superfect непосредственно в разреженных трубу ДНК; вихревой эту смесь для 10 s; оставить смесь при комнатной температуре 5-10 мин в культуре ткани капот разрешить трансфекции комплекс формирования.
- В то время как комплекс формирования занимает место, осторожно аспирационная среднего роста от DF1 клетки культуры блюдо и тщательно вымыть клетки с 4 мл PBS - / -.
- Пипетки 5 мл роста среднего (содержащие сыворотки и антибиотиков); сохранить 4 мл Falcon трубки для следующего шага; и добавить остальные 1 мл среднего роста в трансфекции комплексы. Смешать, закупорить вверх и вниз дважды и немедленно передать весь трансфекции комплексы DF1 клеток. Вихрем для обеспечения охвата слоя клеток; Проинкубируйте 2-3 часа на 37 o C.
- Аспирационная трансфекции смесь вымыть клетки с 4 мл PBS - / - добавить 4 мл свежего роста средних (содержащих сыворотки и антибиотиков); возвращение клетки на 37 o C инкубатора.
- Когда клетки достигают confluency, проход клетки (переходных выражение может быть assayed 48-72 ч после трансфекции).
- Продолжать пройти клетки около 7 дней, до тех пор, пока все ячейки, предположительно инфицированных; тестирование вирусных интеграции ДНК методом ПЦР и определить выражение протеина, Западный blotting; и заморозить клеток в среде DMEM с 10% ДМСО и 20% плода бычьим сывороточным.
3. В естественных условиях Инфекция RIP-тега; RIP-tva мышей
- вирусной коллекции и концентрации
Использование свежей сосредоточены вирусы инфекции в естественных условиях. Существенно не уменьшается титр вируса хранится в 4 o C в течение недели. Однако замороженные аликвоты вирусных акций отображения десятикратного снижения титра после оттаивания.- Expand вирус продюсер DF1 клетки в блюда 15 см в зависимости от количества вируса требуется. В естественных условиях заражения мыши готовить в среднем одной пластины на мышь.
- Предварительно охладить ротора (например, SW28), качели ведро и ультрацентрифугирования машина 4 o C.
- Сбор супернатант вырожденная блюда 15-см. Удаление мусора клетки центрифугированием низкой скорости на 1650 x g 10 мин на 4 o C.
- Передачи вирусных супернатант ультрацентрифуга трубы (Polyallomer пробирок). Спина в ультрацентрифуга за 1,5 часа на 95,400 x g 4 o C. Для машины ультрацентрифуга Бекман XL-100, используйте Accel: 1; Decel: 1 параметры.
- Удалить супернатант от ультрацентрифуга трубы как можно больше. Добавьте PBS без кальция и магния (PBS - / -) ультрацентрифуга трубку сделать окончательный 100 мкл вирусный подвеска от 15 см блюдо. Обложка трубки с парафина. Ресуспензируйте невидимый вирусный Пелле, vortexing, ультрацентрифуга трубки для 2 минут на средней скорости.
- Рок ультрацентрифуга трубы на 4 o C на один час для ночевки.
- Передачи вирусных подвеска в пробки microcentrifuge. Подогревают вирусный подвеска до комнатной температуры перед инъекцией в мышах.
- Определение вирусной титр.
Для каждого новой вирусной конструкции вирусный титр необходимо определить перед инфекцией в естественных условиях.- Семя DF1 клетки на всех скважинах культуры ткани 12-ну плиты (предложение: 2 x 10 4 клетки/хорошо, 1 мл/а), так что они будут 30% притока во время инфекции. Один из 12-ну пластины необходим для одного определения вирусных титр.
- Сделать серию десятикратного разведений вирусный супернатант в среднего роста следующим:
- смесь 5 мкл вирусный супернатант с 495 мкл роста среднего для 10 2 разрежения в пробки microcentrifuge. Вихревой кратко на несколько секунд,.
- Принять 40 мкл от 10 2 разрежения в 360 среднего роста мкл в пробки microcentrifuge для разбавления 10 3. Вихревой кратко на несколько секунд,.
- Следовать шаг 3.2.2.2 10 4 и 10 разрежения 5.
- Набор до 5 мл 6 полистирола трубы. Средний рост аликвота 2,25 мл за трубку и метки них 10 6, 10 7, 10 8, 10 9, 10, 10, соответственно.
- Смесь 0,25 мл от 10 5 разрежения с 2,25 мл средний рост в 6 мл полистирола для разбавления 10 6. Вихревой кратко на несколько секунд,.
- Следовать шаг 3.2.2.5 10 7, 10 8, 10 9 и 10 разбавления 10.
- Удалить оригинальные питательной среды DF1 ячеек на пластине 12-хорошо. Положите 1 мл разбавленной вирусы каждый хорошо в дублированным (неинфицированных, 10 10 10 6 МЕ/мл).
- Позволяют клеткам расти по крайней мере 7 дней (выполнять trypsinzation при необходимости). Собрать клетки для изоляции ДНК и проверить на наличие вирусной ДНК методом ПЦР, как описано в " 6. Протоколы PCR ". Если это вирусный титр 10 единиц инфекционных 8 мл (МЕ/мл), положительные 398 продукты PCR bp из RCASBP будет наблюдаться с использованием ДНК клеток с 10 8 10 МЕ/мл вирусов 6, но не от неинфицированных клеток, или клетки с 10 10 10 9 МЕ/мл вирусов. Титр > 1 x 10 8 инфекционных единиц / мл должны использоваться для инфекции в vivo.
- Внутрисердечной инъекций
Hemizygous RIP-Tag мышей, мышей, не гомозиготных, используются в этом исследовании. Hemizygous RIP-Tag мышей развивать нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы около 10 ~ 12 недель возраста, в то время как гомозиготная мышей имеют короткие задержки опухоли. Потому что пролиферации клеток требуется для включения вирусных cDNA в принимающей генома, 7-неделю старый RIP-тегов; RIP-tva мышей с hyperplasic поджелудочной железы β клетки используются. Пожалуйста, обратите внимание, что большинство нормальных β-клеток у взрослых мышей не распространяются.- Использования 7 недели старый RIP-тегов; RIP-tva мышей в чистом фоне C57BL/C для экспериментов.
- Anesthetize мыши с использованием кетамина/Ксилазина комбинации (150 мг/кг; 15 мг/кг). Использование тепла поддержки для поддержания температуры тела мыши на протяжении всего периода анестезии.
- Смазать глаза обоих глаз для предотвращения высыхания роговицы.
- Бритья волос из грудной полости RIP-тегов; RIP-tva мышей. Положение мыши на спине с груди вверх. Щепотку мыс выполняется для наблюдения за животное для не оперативность для подтверждения полной анестезии эффект.
- Продлить передних конечностей и закрепите их с ленты. Марк мышь ' s груди для инъекций. Марк расположение на полпути между грудной вырез и верхней части xyphoid процесса и слегка влево (анатомическая) грудины ( рис. 2).
- Скраб передней грудной стенки с скраб повидон йод или хлоргексидином скраб последовали 70% изопропиловый спирт или 70% этанол пропитанной губки марлевые.
- Привлечь 50 мкл воздуха в стерильных 28 g ½ инсулина шприц для создания пространства между поршнем и мениска 500 мкл шприца, а затем составить 100 мкл вирусов. Воздушное пространство без каких-либо жидкости на стене имеет решающее значение для видя сердечного пульса.
- Держать иглу вертикально. Держать кожу мыши тугой, с одной стороны и вставить иглу в заметное место. Когда яркий красный пульс крови появится в шприц, остановить продвижение иглы и исправить глубина игла в мышь с одной стороны,.
- Используется с другой стороны тщательно и медленно толкать поршень, чтобы доставить вирусный подвеска (~ 100 мкл тома) в течение ~ 60 второй. Доставить 10-20 мкл, всякий раз, когда видим яркий красный пульс крови появляются в шприц. Непрерывного входа Красного кислородом крови в прозрачной иглы хаб указывает правильное позиционирование иглы в левый желудочек.
- После последнего толкать поршень, чтобы доставить вирусный подвеска и до видя следующий красный пульс крови, быстро убрать иглы из грудной полости.
- Применить нежное давление на месте инъекции для уменьшения кровотечения для по крайней мере 1 мин.
- Тщательно перемещать мышь на грелку или под тепла лампы до полностью осознает. Мыши будут отслеживаться до анестезии прекратит, так что они могут уйти от раздражителей, период обычно длится примерно один час. Мышь будет контролироваться ежедневно даже и нетронутыми Пальто и любые изменения в поведении.
4. Гистопатологические анализ опухоли
- , девять недель после инъекции, усыпить 16 недели старый RIP-тегов; RIP-tva мышей. Запись размеров и числа первичных опухолях поджелудочной железы и любых грубых метастазы.
- Поджелудочной железы, печени и других органов в 10% исправить буферизуются формалин на ночь при комнатной температуре на качающейся платформе.
- Перевод фиксированных тканей на 70% этиловом спирте на следующий день. Обрабатывать ткани в парафин врезанных секций.
- Выполнять иммуногистохимическое окрашивание synaptophysin (маркер нейроэндокринные) или инсулин (β клеток конкретных маркер) после производитель ' s инструкции для определения метастазы поджелудочной железы β-клеток в поджелудочной лимфатических узлов или печень. Тем не менее, де дифференцированных опухолевых клеток или слабо дифференцированные опухолевые клетки могут потерять выражение инсулина и может быть обнаружено только с synaptophysin иммуноокрашивания.
5. В пробирке Инфекция tva выражая клеток
нет необходимости использовать концентрированной вирусов в vitro инфекцию. Описанные ниже протокол предназначен для двух раундов инфекции. Дальнейшие раунды инфекции могут быть выполнены, повторив следующий протокол.
- Собирать вирусный супернатант от вырожденная DF1 клеток. Держите вирусный супернатант 4 o C для инфекции в течение недели. Перед инфекции, вирусных супернатант пройти 0,45 мкм фильтр для получения свободных клеток вирусов.
- Кратко промойте tva выражая клетки-мишени (т.е. N134 поджелудочной железы β клеток опухоли клеток линии от RIP-тегов; RIP-tva мыши) с PBS - / - для удаления всех следов сыворотки, которая содержит ингибитор трипсина. Кратко промойте tva выражая клетки-мишени раствором трипсина ЭДТА (например, трипсин-2.21 мм 0.25% ЭДТА). Добавить раствор трипсина-ЭДТА и инкубировать в течение 2 минут. Аккуратно нажмите пластину. Соблюдайте клетки под инвертированным микроскопом. Обычно клетки отсоединить 2-3 мин семян клеток-мишеней в плиту 6 см. Используйте 3 ~ 4 мл фильтруют вирусный супернатанта как средство роста.
Примечание: Питание в Вирусный супернатант потребляется DF1 клетки, так что изменить средней следующий день. - На следующий день, разогреть достаточное количество вирусных супернатант до комнатной температуры. Удалите носитель из клеток-мишеней и заменить с 3-4 мл вирусный супернатант.
- На третий день, проход клетки при необходимости. Если клетки не являются достаточно плотной, чтобы быть пассированной, согреться ~ 4 мл регулярного роста средних (DMEM с высоким глюкозы, 10% плода бычьим сывороточным, 6 мм (конечная концентрация) L-глютамином, 10 единиц/мл пенициллин, стрептомицин 10 мкг/мл) заменить вирусный супернатант.
- Expand инфицированных клеток и рассмотреть выражение протеина кандидата на западной blotting 19. В transwell анализов могут быть проанализированы эффекты генов-кандидатов по вопросам миграции и вторжения. Эти клеточные линии также могут быть проверены на их метастатическим потенциалом в печень в Вену assay хвост для метастазов.
6. Протоколы PCR
решения должен быть смонтирован как можно быстрее на льду. Mastermix без шаблона может производиться для большого числа проб и aliquoted в ПЦР-пробирки. Умножьте количество каждого реагента, необходимое количество выборок. Смешать реактивы, flicking предварительного и вихрем с кончиком пипетки, прежде чем принимать некоторые добавления к mastermix. После добавления каждого реагента mastermix трубки, накапайте вверх и вниз, чтобы доставить любой остатков внутри советы.
- Обнаружить присутствие RCASBP в зараженных или transfected клеток.
Следующий протокол призывает 11,5 мкл mastermix и 1 мкл геномной ДНК для каждого образца. Убедитесь, что вертеться перед добавлением каждого реагента.- Подготовить mastermix 7.68 мкл нуклеиназы свободной воды, 0,75 мкл ДМСО, 1,25 мкл 10 x буфер II для ДНК-полимераза AmpliTaq, 1,375 мкл 25 мм MgCl 2 и 0,125 мкл 25 мм-dNTP.
- 0,125 мкл 100 мкм вперед грунтовка RCAS5626F: (5 ' - ACCGGGGGATGCGTAGGCTTCA - 3 ') и 0,125 µL 100 мкм обратный грунтовка RCAS6023R: (5 ' - CCGCAACACCCACTGGCATTACC - 3 ') к mastermix.
- 0,075 мкл AmpliTaq ДНК-полимеразы mastermix.
- Смешать mastermix, стряхивая трубки с пальцами. Спин вниз matermix в истории машина центрифугиy на 3 ~ 5 секунд.
- Аликвота 11.5 мкл от mastermix для каждого человека ПЦР пробирок. Вихрем каждый раз перед aliquoting к новой пробке.
- Водоворот и добавить в каждую ПЦР-пробирку 1 мкл геномной ДНК шаблон. Подготовить геномной ДНК:
- Lyse клеток Пелле в 200 мкл 0,05 М NaOH. Накапайте вверх и вниз до полного растворения гранул.
- Тепло ячейки lysate 98 ° C в течение 20 минут в машине ПЦР, а затем охлаждается до 25 ° C.
- Добавить 20 мкл 1.0 М трис-HCl (рН 7,5) трубы, и хранилище ДНК образцов на 4 ° C.
- Смесь образцы стряхивая и центрифуги кратко для 3-5 секунд. Положить трубы в машину ПЦР.
- ПЦР условие установлен на 2 мин в 92 ° C для первоначального денатурации, следуют 40 циклов 30 s на 94 ° C для денатурации, 30 s на 67° C для отжига, 30 сек при 72 ° C для расширения и 10 м при 72 ° C для окончательного расширения.
- По окончании ПЦР 3 мкл 6 x ДНК загрузки краситель для каждого образца. Микс по экрану и центрифуги кратко для 3 ~ 5 секунд.
- Продукты PCR, изучаются электрофореза в геле агарозы 2% (w/v) в 1 x TAE буфера. Размер своего продукта ПЦР-398 bp.
- Тег генотипирования.
Следующий протокол призывает 10.5 мкл mastermix и 2 мкл геномной ДНК для каждого образца. Убедитесь, что вертеться перед добавлением каждого реагента.- Подготовить mastermix 4.5 мкл нуклеиназы свободной воды и 4.00 мкл 5 x MyTaq реакции буфер для ДНК-полимераза MyTaq.
- 0,4 мкл 100 мкм вперед грунтовка TagF2: (5 ' - GGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG - 3 ') и 0.4 µL 100 мкм обратный грунтовка TagR2: (5 ' - CAGAGCAGAATTGTGGAGTGG - 3 ') главный микс.
- 0,8 мкл 10 мкм бета-2-микроглобулина прекурсоров (B2m) грунт смеси для внутреннего контроля. Праймеры PCR для B2m внутреннего контроля, бета-2-микроглобулина прекурсоров (B2m), являются B2 F (5 ' - CACCGGAGAATGGGAAGCCGAA - 3 ') и B2 R (5 ' - TCCACACAGATGGAGCGTCCAG - 3 ').
- 0,4 мкл MyTaq ДНК-полимеразы mastermix.
- Смешать mastermix, стряхивая трубки с пальцами. Спин вниз mastermix в центрифуга машина для 3 ~ 5 s.
- Аликвота 10.5 мкл от mastermix для каждого человека ПЦР пробирок. Вихрем каждый раз перед aliquoting к новой пробке.
- Водоворот и добавить в каждую ПЦР-пробирку 2 мкл геномной ДНК шаблон. Геномная ДНК готовится, как описано выше.
- Mix решение по экрану и центрифуги кратко 3-5 секунд. Положить трубы в машину ПЦР.
- Задать условие ПЦР для 3 мин при 95° C для первоначального денатурации, после 35 циклов 15 s при 95 ° C для денатурации, 15 s при 65 ° C для отжига, 30 сек при 72 ° C для расширения и 10 мин при 72 ° C для окончательного расширения.
- По окончании ПЦР 3 мкл 6 x загрузки краситель для каждого образца. Микс по экрану и центрифуги кратко для 3 ~ 5 секунд. Продукты PCR
- рассматриваются электрофорезом геля агарозы 2% (w/v) в 1 x TAE буфера. Размеры тегов и B2m ПЦР продукты являются ~ 450 bp и 300 bp, соответственно.
- генотипирования tva.
Следующий протокол предусматривает 10.5 мкл Реагента смеси для каждого образца. Убедитесь, что вертеться перед добавлением каждого реагента.- Подготовить mastermix 5.6 мкл нуклеиназы свободной воды, 0,5 мкл ДМСО, 1,25 мкл 10 x буфер II для AmpliTaq ДНК-полимеразы и 1,375 мкл 25 мм MgCl 2 и 0,125 мкл 25 мм dNTP.
- Мкл 0,125 100 мкм tva-3 (5 ' - GCCCTGGGGAAGGTCCTGCCC - 3 ') и 0,125 µL 100 мкм tva-5 (5 ' - CTGCTGCCCGGTAACGTGACCGG - 3 ') к mastermix.
- Добавить 1.275 мкл 10 мкм B2m грунтовка смеси для внутреннего контроля mastermix.
- 0,125 мкл AmpliTaq ДНК-полимеразы mastermix.
- Смешать mastermix, стряхивая трубки с пальцами. Спин вниз mastermix в центрифуги машины кратко секунд 3-5.
- Аликвота 10.5 мкл от mastermix для каждого человека ПЦР пробирок. Вихрем каждый раз перед aliquoting к новой пробке.
- Водоворот и добавить в каждую ПЦР-пробирку геномной ДНК шаблон 2µL. Геномная ДНК готовится, как описано выше.
- Смешать раствор, стряхивая и центрифуги кратко для 3-5 s. положить трубы в машину ПЦР.
- Условия PCR установлен на 2 мин в 92 ° C для первоначального денатурации, после 35 циклов 30 s на 94 ° C для денатурации, 30 s при 60° C для отжига, 30 секунд при 72 ° C для расширения и 10 минут при 72 ° C для окончательного расширение.
- По окончании ПЦР 3 мкл 6 x загрузки краситель для каждого образца. Микс по экрану и центрифуги кратко для 3-5 s.
- Продукты PCR, изучаются электрофореза в геле агарозы 2% (w/v) в 1 x TAE буфера. Размеры tva и продуктов ПЦР B2m являются 500 bp и 300 bp, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Уровень инфекции в vivo и in vitro RIP-тегов; RIP-tva опухолевых клеток на основе RCASBP вирусы являются соответственно ~ 20% и ~ 80% 20. В теге RIP ; RIP-tva модель мыши, примерно 4% от 400 панкреатических островков в каждой мыши естественно будет развиваться в опухоли 20; Поэтому существует достаточное количество опухолевых клеток в каждой мыши для гистологического и фенотипического анализа потенциального эффекта генов, сделанное вирусов. С помощью этой системы, Роман ядерной функции Bcl-xL метастаз в был выявленных 9. RIP-тегов; RIP-tva мышей, инфицированных RCASBP -Bcl-xL выставлены более высокий уровень инвазивной карциномы чем мышей, инфицированных вирусами управления, RCASBP -ALPP (96% против 74%). Кроме того 47% RCASBP -Bcl-xL-инфицированных RIP-тегов; RIP-tva мышей разработаны метастазов в лимфатических узлах, поджелудочной железы при умерщвлены в 16 недель возраста (Рисунок 3А), в то время как нет метастазов была найдена в управления мышей 20.
Кроме того мы экранированный библиотека генов рака в RIP-тегов; RIP-tva мышей и определили первый ген, который способствует метастазов в лимфоузлы поджелудочной железы и печени 21 (рисунок 3B и 3 C). Этот ген кодирует рецептор для гиалуроновая кислота опосредованной моторики изоформы B (RHAMMB) белка и активирует EGFR сигнализации 21. Мы показали, что метастазов в печени конкретных можно изъятый в Вену assay хвост экспериментальной метастазов, в котором N134 опухолевых клеток первоначально распространен через капиллярные кровати легких получателя иммунодефицитных мышей 21.
Рисунок 1 : Схема конструкции RCASBP(A), орк-X и Y орк. Клонирования сайтов указаны в синий, полужирный шрифт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Размещение внутрисердечной инъекций. Анатомические ориентиры показаны с горизонтальными пунктирными линиями на грудине (изложенные в белом). На мыши кожи грудной вырез и xyphoid процесса служат в качестве ориентиров и иглы вставляются 1 мм от середины грудины и слегка влево (анатомическая) грудины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Обнаружения метастазов поджелудочной железы β-клеток, иммуноокрашивания. Фотографии показывают, представитель synaptophysin окрашивание метастатического поджелудочной железы нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы лимфатических узлов (A, B) или в печени (C). RIP-тегов; RIP-tva мышей были заражены указанные ретровирусами RCASBP в возрасте 7 недель и умерщвлены в возрасте 16 недель. Шкалы бар = 50 µm. Оригинальный масштаб = 20 X. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы описали модель мощный мыши, RIP-тегов; RIP-tva, для достижения соматическая генная доставки через птичьего ретровирусы для идентификации и определения характеристик метастатического факторов. Хотя RIP-тега; RIP-tva мышей развивать нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы, метастатические факторы, выявленные в этой мыши модели могут также содействовать метастазированием других типов рака.
Наш подход имеет преимущество внедрения соматических генетические изменения специально в предраковые поражения клеток поджелудочной железы β образом контроль времени, таким образом более точно имитирует развития спорадические человека опухоли. Этот подход позволяет избежать любых потенциальных возмущений формирования нормальной ткани, который часто наблюдается в обычных transgenic моделей результате Эктопическая экспрессии гена интереса во время разработки. Кроме того это намного быстрее, чтобы генерировать птичьего ретровиральных векторов, гены интереса чем чтобы генерировать трансгенных мышей. RCASBP-производные птичьего ретровирусной вектор может доставить cDNAs (≤2.5 kb), процессируются, адаптивной и другие некодирующей RNAs tva выражая клетки в пробирке и в естественных условиях. Эффективность инфекции (и несколько инфекции) зависит скорость распространения клеток-мишеней и доступности клеток. Титр > 1 x 108 инфекционных единиц / мл необходим для инфекции в естественных условиях . Более эффективные вирусный доставка может быть достигнуто в пробирке благодаря индуцированной пролиферации и возможности повторяющиеся воздействия вирусов всех клеток.
Точное внутрисердечной инъекций техника имеет решающее значение для жизнеспособности мышей. Во-первых 50 мкл воздушного пространства в шприц инсулина перед составлением вирусный подвеска имеет решающее значение для видя сердечного пульса. Во-вторых важно, чтобы исправить положение шприц, появляется красный пульс крови и медленно доставить 10-20 мкл вирусный подвеска, всякий раз, когда видим яркий красный пульс крови появляются в шприц. Если ярко красный импульсов крови остановить после доставки 10-20 мкл вирусный подвеска, слегка репозиционирования иглы поможет. В-третьих после последний толчок поршень, чтобы доставить вирусный подвеска и до видя крови пульса, игла должна быть быстро убирается из грудной полости и нежно давление над инъекции поможет снизить внутреннее кровотечение. Не в последнюю очередь, повторно не использовать шприц инсулина на другой мыши.
Для будущих применений, этот RIP-тегов; RIP-tva модель мыши могут быть объединены с другими моделями трансгенных, запрессовка и нокаут мыши. Кроме того мы видим, сочетая этот RIP-тегов; RIP-tva модель мыши с ТРИФОСФАТЫ-Cas9 изменения генома инструмент для создания точечные мутации, удаление, геномных перестроек таких инверсий и транслокации 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Гарольд Varmus, Брайан C. Льюис, Дуглас Hanahan, Дэнни Huang, Шарон Панг, Меган Вонг и Манаси м. Godbole. Y.C.N.D. поддерживается DOD Грант W81XWH-16-1-0619 и Грант 1R01CA204916 низ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Khanna, C., Hunter, K.
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276 (2007).
- Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
- Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
- Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
- Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
- Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384 (2016).
- Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
- Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
- Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
- Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
- Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
- Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
- Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
- Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).
