Summary
אנו מציגים פרוטוקול להפגין מערכת העברת גנים סומאטית הרומן ניצול RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף דגם העכבר כדי ללמוד את הפונקציה של גנים גרורות. העופות רטרווירוסים נמסרות intracardiacally כדי להבטיח העברה גנטית לתוך נגעים טרום ממאירים, לא פולשנית של תאי β בלבלב בעכברים בוגרים.
Abstract
סרטן גרורתי חשבונות עבור 90% ממקרי המוות בחולים עם גידולים מוצקים. יש צורך דחוף כדי להבין טוב יותר את מנהלי ההתקנים של גרורות סרטן וכדי לזהות מטרות טיפולית הרומן. כדי לחקור את האירועים המולקולריים להסיע את ההתקדמות של סרטן ראשוני גרורות, פיתחנו מודל העכבר bitransgenic, RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף. במודל זה העכבר, יחצ ן אינסולין עכברוש (RIP) כונני הביטוי של SV40 T אנטיגן (תג) ושל הקולטן עבור קבוצת משנה של וירוס leukosis העופות (מס ערך מוסף) בתאי β בלבלב. העכברים לפתח גידולים נוירואנדוקריניים הלבלב עם 100% penetrance דרך שלבים מוגדרים היטב דומים tumorigenesis האנושי, עם שלבים לרבות היפרפלזיה, אנגיוגנזה, אדנומה קרצינומה פולשנית. כי RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים אינם מפתחים מחלה גרורתית, שינויים גנטיים המקדמים גרורות ניתן לזהות בקלות. ג'ין סומאטית להעביר לתוך לבטא-מס ערך מוסף, מתרבים β בלבלב נגעים premalignant מושגת באמצעות הזרקת intracardiac של רטרווירוסים העופות מסתירים את שינוי גנטי הרצוי. כייל של > עונה 1 פרק 108 יחידות זיהומיות לכל מ"ל נחשבת מתאימה ויוו זיהום. בנוסף, רטרווירוסים העופות יכולים להדביק שורות תאים שמקורם גידולים RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים עם יעילות גבוהה. הקווים התא יכול לשמש גם כדי לאפיין את הגורמים גרורתי. כאן אנחנו מדגימים כיצד לנצל את מודל זה העכבר וסלולרי קווים כדי להעריך את הפונקציות של המועמד גנים גרורות הגידול.
Introduction
סרטן ביותר נובעים מוטציות סומאטית 1. מודלים קונבנציונאלי העכבר מהונדסים גנטית (GEMM) סיפקו תובנות משמעותיות התרומה של שינויים גנטיים הספציפיים ל- tumorigenesis 2. עם זאת, יש להם מספר מגבלות. החיסרון העיקרי של מודלים אלה היא כי הם אינם משתכפלים הטבע סדיר של היווצרות סרטן בבני אדם, שבו כמה תאים בתוך רקמה לרכוש שינויים גנטיים. מוטציות בעכברים מהונדס, נוק אאוט הינם גם germline עם פוטנציאל להשפיע על התפתחות. יתר על כן, יצירת מודלים אלה העכבר הוא יקר וצורך.
גרורה היא נושא משמעותי בשטח מסרטן. מידול גרורות כבר קשה ב- GEMM. גרורות ספונטנית נדיר העכבר. Penetrance הוא משתנה והוא השהיית זמן רב ב GEMM של גרורות 3. מודלים ניסיוניים גרורות מעסיקים הזרקה ישירה של תאים למחזור של עכברים, כך בשלבים המוקדמים המפל גרורתי מסולקות.
כדי להתגבר על חלק מהמגבלות הנ ל לימוד גורמים גרורתי במודלים של העכבר, פיתחנו מודל העכבר bitransgenic, RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף4. האסטרטגיה מבוססת על שילוב השימוש של מודל העכבר התקדמות הגידול מאוד-מסונכרנות, RIP-תג 5, ושל הקולטן leukosis העופות קבוצת משנה של וירוס, מס ערך מוסף 6,7. RIP-תג זה; RIP-מס ערך מוסףדגם העכבר מאפשר גנים להיות מוחדרים תחושתיים זן העכבר bitransgenic יחיד. עם אנטיגן SV40 T לדכא את הפונקציות מדכא הגידול של Rb ו- p53, עכברים לפתח גידולים נוירואנדוקריניים הלבלב באופן דומה כדי tumorigenesis האנושי, עם שלבים לרבות היפרפלזיה, אנגיוגנזה, אדנומה קרצינומה פולשנית. מודל RIP-תג זה היה מאלף מאוד להבנת ההיכר של סרטן, לא מוגבל הלבלב גידולים נוירואנדוקריניים. זה שימש גם ניסויים פרה 8.
אנו מציגים פרוטוקול להעברת הגן סומאטית באמצעות הזרקה של רטרווירוסים העופות intracardiacally לתוך RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים. זיהום מוצלח עם RCASBP-derived רטרווירוסים העופות מחייב באופן פעיל מתרבים בתאי המטרה. לכן, בחרנו RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים בגיל שבעה שבועות של גיל, כאשר היפרפלזיה מתפתח אצל כ-50% באיי לנגרהנס. הזרקת intracardiac חדרית השמאלי של וירוסים כייל נוגדנים גבוה נדרשת כדי להשיג יעילות זיהום של 10-20% 4. שיטת העברה זו מפחיתה את דילול משמעותי של נגיפים בתוך מחזור הדם לפני וירוסים מגיעים לנגרהנס.
באמצעות גישה זו, בעבר הראו כי Bcl-xL מקדמת גרורות סרטן עצמאית של 4,שלה פונקציית anti-מוות9. הפונקציה גרורתי אנטי-מוות-עצמאית לא נצפתה כאשר Bcl-xL בא לידי ביטוי דרך transgene בכל תאי β בלבלב ברחבי ontogeny tumorigenic ב RIP-התג; RIP-Bcl-xL העכבר מודל 10. לפיכך, המודל העכבר שלנו מציע הזדמנות ייחודית כדי לזהות ולאפיין פונקציות של את הגנים כשאני לידי ביטוי בשלב מאוחר יותר של tumorigenesis. בגלל 2-4% של איים להתפתח גידולים RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף bitransgenic עכברים ללא זיהום נגיפי, לא כל נגעים premalignant נגועים רטרווירוסים העופות נגזר RCASBP, ניתן לזהות רק את הגורמים מעניקה יתרון בררני במהלך הטבעי של tumorigenesis. בפרט, גורמים גרורתי בקלות הרבה ביותר תוכר על ידי שיטה זו, כי הלבלב בלוטות הלימפה או לאיברים אחרים גרורה אינה מתרחשת בדרך כלל ב- RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אתיקה במשפט: ניסויים על בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות שנקבעו על ידי המכון עבור טיפול בעלי חיים, שימוש ועדת של וייל קורנל רפואה.
1. הבחירה של העופות Retroviral וקטורים (מבוססי RCASBP A או RCANBP(A)-based)
- וקטורים נבעה ראוז סרקומה וירוס 11. וקטורים retroviral העופות יכול לספק cDNAs (≤ 2.5 kb), קצר מכבנה RNAs (shRNAs), מיקרו Rna (miRNAs) ו RNAs noncoding אחרים. הווקטורים זמינים מסחרית מפורטים בחומרים, אחרים צריכים להיעשות ישירות מן המחברים.
- כדי overexpress הגנים של עניין, השתמש באחד הווקטורים הבאים, RCASBP(A) 12 ( איור 1 א'), RCAS-X ( איור 1B), RCAS-Y 13 ( איור 1C), RCASBP-Y DV 14, או אחרים וקטורים אלב-A (https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html).
- לדפוק את הגנים של עניין על-ידי shRNA, השתמש באחד הווקטורים הבאים: DV RCAN-X 15 או RCAS-RNAi 16.
- כדי overexpress miRNAs, יצירת וקטור RCAS-מיר כמתואר ב- 17-
- הסתדרותי דרישה e. coli ו הדנ א.
- רצוי להפוך DNA תאי המוסמכת Stbl2 או Stbl3, אשר יש גנוטיפ ייחודי כדי לייצב רצפים חוזרים של retroviral ישירה. לטהר דנ א פלסמיד באמצעות שיטה שיניבו טהור, תרביות תאים כיתה ה-DNA. 5 µg של ה-DNA נדרשת לריכוז המינימלי של 0.1 µg/µl.
2. נגיפי הפצת בשורת תאי פיברובלסט DF1 עוף
- השימוש פיפטה מסוננים טיפים עבור תרבית תאים נדרשת כדי למנוע קרוס-זיהום ויראלי מניות 18.
- DF1 לשמור על תאים בצלחת 6 ס מ עם גידול בינוני (DMEM עם גלוקוז גבוהות, סרום שור עוברית 10%, 6 מ מ (ריכוז סופי) L-גלוטמין, 10 יחידות/ml פניצילין, סטרפטומיצין µg/ml 10)-37 o C ו- 5% CO 2. אם DF1 תאים הם טריים הקרת ממניות קפוא, תרבות אותם לפחות 3 ימים לפני תרביות תאים.
- יום אחד לפני תרביות תאים, להעביר תאים DF1 תבשיל תרביות רקמה 6 ס מ כך הם יהיו 30-50% confluent בזמנו של תרביות תאים.
- µG לדלל 5 של ה-DNA הנגיפי טהור עם DMEM (ללא סרום, פניצילין או סטרפטומיצין) את הנפח הכולל של 150 µl בשפופרת microcentrifuge בתוך ברדס תרביות רקמה.
- µL להוסיף 30 של Superfect ישירות לתוך הצינור DNA מדולל; מערבולת תערובת זו במשך 10 s; לעזוב התערובת בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות בתרבות רקמה הוד כדי לאפשר היווצרות תרביות תאים-מתחם.
- בזמן היווצרות מורכבות מתקיים, בעדינות תשאף מדיום הגידול מתוך קערה תרבות תא DF1, ולשטוף היטב תאים עם 4 מ"ל PBS - / --
- Pipet 5 מ"ל של הצמיחה בינונית (מכיל סרום ואנטיביוטיקה); לשמור 4 מ"ל צינור בז לשלב הבא; ולהוסיף את שאר 1 מ"ל של מדיום הגידול מתחמי תרביות תאים. לערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה פעמיים, להעביר מיד את מתחמי תרביות תאים כל התאים DF1. מערבולת כדי להבטיח כי הוא מכוסה בשכבת תאים; תקופת דגירה של 2-3 שעות ב- 37 o C.
- וארוקן את התערובת תקנים; לשטוף תאים עם 4 מ"ל PBS - /-; להוסיף 4 מיליליטר מדיום הגידול טריים (המכיל סרום ואנטיביוטיקה) לחזור תאים חממה 37 o C.
- כאשר התאים מגיעים confluency, מעבר תאים (ביטוי ארעי עלול להיות לבדיקה 48 עד 72 שעות לאחר תקנים).
- להמשיך להעביר תאים בערך 7 ימים עד כל התאים נגועים יש להניח; בדיקת DNA נגיפי, אינטגרציה PCR ולקבוע ביטוי חלבון סופג המערבי; להקפיא את התאים DMEM בינוני עם 10% דימתיל סולפוקסיד ו-20% עוברית שור סרום.
3. אין ויוו זיהום של RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים
- וירוס איסוף וריכוז
שימוש טרי מרוכז וירוסים ויוו זיהום. כייל של וירוסים שמרו על 4 o C בתוך שבוע לא פוחת באופן משמעותי. עם זאת, aliquots קפוא של מניות ויראלי להציג 10-fold כייל מופחת על מפשיר.- הרחב המפיק-וירוס DF1 תאים לתוך מנות 15 ס מ בהתאם לכמות של וירוס הדרושים. אין ויוו העכבר זיהום, להכין ממוצע של לוח אחד לכל העכבר.
- מראש להירגע הרוטור (לדוגמה, SW28), הדלי הנדנדה, המכונה ultracentrifuge 4 o C. תגובת שיקוע של מנות 15-ס"מ confluent
- לאסוף. להסיר את שאריות תאים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ב 1,650 g x 10 דקות בבית 4 o C.
- להעביר את תגובת שיקוע נגיפי ultracentrifuge צינורות (Polyallomer צנטריפוגה צינורות). ספין ב ultracentrifuge 1.5 שעות ב 95,400 x g 4 o C. למכונת ultracentrifuge בקמן XL-100, השתמש אקסל: 1; ההאטה: הגדרות 1. צינורות
- תגובת שיקוע הסרה של ultracentrifuge ככל האפשר. להוסיף PBS ללא סידן ומגנזיום (PBS - / -) הצינור ultracentrifuge לעשות הסופי 100 µl נגיפי השעיה מ צלחת 15 ס מ אחת. מכסים את הצינורות עם מצלמות-מיקרוסקופים. Resuspend בגדר ויראלי בלתי נראית על ידי vortexing ultracentrifuge צינורות למשך 2 דקות במהירות בינונית.
- רוק הצינורות ultracentrifuge בבית 4 o C למשך שעה אחת ללון.
- להעביר את המתלים ויראלי לתוך צינור microcentrifuge. לחמם ההשעיה ויראלי לטמפרטורת החדר לפני זריקה לתוך עכברים.
- ויראלי כייל נוגדנים נחישות.
עבור כל לבנות ויראלי חדש, כייל ויראלי צריך להיקבע לפני ויוו זיהום.- תאי זרע DF1 בבארות כל של צלחת תרביות רקמה 12-ובכן (הצעה: 2 x 10 4 תאים/טוב, 1 ml/טוב), כך הם יהיו 30% confluent בזמנו של זיהום. לוח 12-ובכן אחד נדרש לקביעת ויראלי כייל אחד.
- להפוך סדרת דילולים 10-fold של תגובת שיקוע ויראלי מדיום הגידול כדלקמן: מדיום הגידול µl
- מיקס 5 µl ויראלי תגובת שיקוע עם 495 על דילול 2 10 צינור microcentrifuge. מערבולת בקצרה במשך כמה שניות.
- µL 40 לקחת מעשר דילול 2 לתוך 360 מדיום הגידול µl בשפופרת microcentrifuge על דילול 3 10. מערבולת בקצרה במשך כמה שניות.
- בצע צעד 3.2.2.2 10 4 ו- 10 דילול 5.
- סט למעלה 5 6-ml פוליסטירן צינורות. Aliquot מ ל 2.25 מדיום הגידול לכל צינור ו תווית 10 מהם 6, 10 7, 10 8, 10 9, 10, 10, בהתאמה.
- מיקס 0.25 ml 10 דילול 5 עם 2.25 ml מדיום הגידול בצינור פוליסטירן 6 מ של דילול 6 10. מערבולת בקצרה במשך כמה שניות.
- בצע צעד 3.2.2.5 10 7, 10 8, 10 9 ו 10 10 דילול.
- להסיר את המדיום התרבות המקורית מתאי DF1 בצלחת 12-. טוב. לשים 1 מ"ל מדולל וירוסים כדי לשכפל כל טוב (uninfected, 10 10 10 6 IU/ml).
- מאפשרים לתאים לגדול לפחות 7 ימים (לבצע trypsinzation בעת הצורך). איסוף תאים כדי לבודד דנ א ובדוק הנוכחות של ה-DNA הנגיפי מאת PCR כפי שמתואר " 6. PCR פרוטוקולים ". אם זה כייל ויראלי 10 יחידות זיהומיות 8 מ ל (IU/ml), חיובי 398 מקומות bp PCR מוצרים מן RCASBP יתקיימו באמצעות ה-DNA של תאים עם 10 8 10 6 IU/ml וירוסים, אבל לא מן נגוע בתאים או תאים עם 10 10 10 9 וירוסים IU/ml. כייל של > עונה 1 פרק 10 8 יחידות זיהומיות לכל ml אמור לשמש ויוו זיהום.
- Intracardiac הזרקת
Hemizygous RIP-תג עכברים, עכברים לא homozygous, נעשה שימוש במחקר זה. עכברים RIP-תג Hemizygous לפתח גידולים נוירואנדוקריניים הלבלב בסביבות 10 ~ 12 שבועות של גיל, בעוד עכברים homozygous יש השהיה קצרה יותר של הגידול. מאחר התפשטות תאים נדרש לשם שיתוף cDNA ויראלי לתוך המחשב המארח הגנום, בת שבוע 7 RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים עם תאי β בלבלב hyperplasic משמשים. אנא שימו לב כי תאי β הכי נורמלי הם לא מתרבים בעכברים בוגרים.- שימוש 7 בת RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים ברקע C57BL/C טהור הניסויים.
- Anesthetize העכבר באמצעות שילוב קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (150 מ ג/ק ג; 15 מ"ג/ק"ג). להשתמש בתמיכה חום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף העכבר לאורך כל תקופת הרדמה.
- להחיל העין חומר סיכה על שתי העיניים כדי למנוע ייבוש הקרנית.
- גילוח השיער מן הפתח שבחזה של RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים. מיקום העכבר על גבו עם החזה כלפי מעלה. קמצוץ הבוהן מתבצע כדי להתבונן החיה עבור אי-היענות לאשר אפקט הרדמה מלאה.
- להרחיב את האיבר קבלה ולאבטח אותם עם קלטות. סמן העכבר ' s החזה להזרקה. מארק על מידוויי מיקום בין דרגה בחזה ובצלעות העליון של תהליך xyphoid, והשאיר מעט (אנטומיה) של עצם החזה ( איור 2).
- סקראב קיר החזה הקדמי עם שיפשופים povidone יוד או קרצוף chlorhexidine ואחריו אלכוהול איזופרופיל 70% או 70% אתנול ספוג ספוג גזה.
- 50 לצייר µl של אוויר לתוך אינסולין סטרילי 28 גרם ½ מזרק כדי ליצור שטח בין הבוכנה במניסקוס מזרק µL 500 ולאחר מכן צייר את µl 100 של וירוסים. במרחב האווירי ללא כל נוזל על הקיר הוא קריטי עבור לראות דופק הלב.
- לשמור על המחט זקוף. החזק את העור של העכבר מתוח ביד אחת ולאחר המחט למיקום המסומן. הופעת דופק אדום בהיר של הדם במזרק, לעצור את קידום המחט ולתקן את העומק של המחט העכבר ביד אחת.
- תשתמש ביד השנייה כדי בקפידה ודחף לאט על הבוכנה לספק ויראלי ההשעיה (~ 100 µl נפח) על פני תקופה ~ 60 שניות. לספק µl 10-20 בכל פעם לראות דופק אדום בהיר של דם מופיעים במזרק. כניסה רציף של דם מחומצן אדום לתוך ה-hub המחט שקוף מציין מיקום מתאים של המחט לתוך החדר השמאלי.
- לאחר הדחיפה האחרונה של הבוכנה כדי לספק ההשעיה ויראלי ומשכו לפני שאראה את הדופק האדום הבא של דם, במהירות את המחט בחלל החזה.
- להפעיל לחץ עדין על ההזרקה להפחתת דימום במשך לפחות 1 מינימלית
- בזהירות להזיז את העכבר על גבי כרית החימום או תחת מנורת חימום עד בהכרה מלאה. עכברים יעקבו עד הרדמה. מתנדף, כך שהם יכולים לעבור מן גירויים, בדרך כלל מפגישים שעה בקירוב. עכברים יהיה פיקוח יומי עבור המעיל אפילו ללא פגע, כל שינוי בהתנהגות.
4. ניתוח histopathological של גידולים
- תשעה שבועות לאחר ההזרקה, המתת חסד בת שבוע 16 RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים. להקליט בגדלים ומספרים של גידולים הלבלב הראשי, גרורות דוחה כל.
- תיקון הלבלב, הכבד, ו/או איברים אחרים ב 10% buffered פורמלין ללילה בטמפרטורת החדר פלטפורמה נדנדה.
- העברת רקמות קבוע לתוך אתנול 70% ביום הבא. תהליך רקמות למקטעים פרפין-מוטבע. Immunohistochemical
- לבצע צביעת עבור synaptophysin (סמן נוירואנדוקריניים) או אינסולין (β ספציפיים תא סמן) בעקבות יצרן ' s הוראות לזיהוי גרורות של תאי β בלבלב בבלוטות הלימפה הלבלב או כבדי. עם זאת, תאים סרטניים מבטל את הבדיל או תאים סרטניים הבדיל גרוע עלול לאבד את הביטוי של אינסולין, רק ניתן להבחין synaptophysin immunostaining.
5. במבחנה זיהום של תאים מס ערך מוסף-לבטא
אין צורך להשתמש וירוסים מרוכז במבחנה זיהום. פרוטוקול המתואר להלן הוא עבור שני סיבובים של זיהום. סיבוב נוסף של זיהום יכול להתבצע על ידי חוזרות בפרוטוקול הבא.
- לאסוף תגובת שיקוע ויראלי מתאי DF1 confluent. לשמור את תגובת שיקוע ויראלי 4 o C זיהום תוך שבוע. לפני ההדבקה, להעביר את תגובת שיקוע ויראלי דרך מסנן 0.45 μm לקבל וירוסים ללא תא.
- לשטוף בקצרה התאים היעד לבטא-מס ערך מוסף (דהיינו N134 β בלבלב תא הגידול תא קו של RIP-התג; RIP-tva עכבר) עם PBS - / - כדי להסיר כל עקבות של נסיוב, אשר מכילות מעכבי טריפסין. לשטוף בקצרה לבטא tva התאים היעד עם פתרון טריפסין-EDTA (כמו טריפסין-2.21 0.25% מ"מ EDTA). להוסיף פתרון טריפסין-EDTA, תקופת דגירה של 2 דקות. טפח בעדינות את הצלחת. להתבונן התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה. תאים בדרך כלל ניתוק ב- 2-3 דקות התאים היעד זרע לתוך צלחת 6 ס מ. שימוש 3 ~ 4 מ"ל מסונן תגובת שיקוע ויראלי כמו מדיום הגידול.
הערה: התזונה ב- תגובת שיקוע ויראלי הוא נצרך על ידי תאים DF1, אז לשנות המדיום למחרת. - ביום הבא, לחמם מספיק כמות תגובת שיקוע ויראלי לטמפרטורת החדר. להסיר את המדיום של התאים היעד, ולהחליף עם תגובת שיקוע ויראלי 3-4 מ"ל.
- ביום השלישי, מעבר תאים לפי הצורך. אם התאים אינם צפופים מספיק כדי להיות passaged, לחמם ~ 4 מ"ל של מדיום הגידול הרגיל (DMEM עם גלוקוז גבוהות, סרום שור עוברית 10%, 6 מ מ (ריכוז סופי)-גלוטמין, 10 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 10) כדי להחליף את תגובת שיקוע ויראלי.
- הרחב נגוע תאים ולבחון את הביטוי חלבון המועמד על-ידי המערב סופג 19. ניתן לנתח את ההשפעות של הגנים המועמד על ההעברה, הפלישה במבחני transwell. שורות תאים אלה יכול להיבדק גם על הפוטנציאל שלהם גרורתי בכבד ב וזמינותו וריד הזנב על גרורות.
6. פרוטוקולים PCR
פתרונות צריך להרכיב במהירות האפשרית על קרח. Mastermix בלי התבנית יכולה להתבצע עבור מספר גדול של דוגמאות, aliquoted לתוך המבחנות. להכפיל את הכמות של כל ריאגנט הדרושים על ידי מספר דוגמאות. לערבב את ריאגנטים על ידי כוהנים יתנגש, מערבולת עם טיפ pipet לפני לקיחת חלק כדי להוסיף mastermix. לאחר הוספת ריאגנט כל הצינור mastermix, pipet למעלה ולמטה כדי לספק את כל שאריות פנימה הטיפים.
- כדי לזהות הנוכחות של RCASBP בתאים נגועים או transfected.
להלן כללי התנהגות קוראת 11.5 µL של mastermix, µL 1 של ה-DNA גנומי עבור כל דגימה. הקפד מערבולת לפני הוספת ריאגנט בכל.- להכין את mastermix של מים נטולי נוקלאז µL 7.68, דימתיל סולפוקסיד µL 0.75, µl 1.25 10 x מאגר עבור AmpliTaq DNA פולימראז II, µl 1.375 של 25 מ מ MgCl 2 µl 0.125 של 25 מ מ dNTP.
- להוסיף 0.125 µL של 100 מיקרומטר פריימר לפנים RCAS5626F: (5 ' - ACCGGGGGATGCGTAGGCTTCA - 3 ') ו 0.125 µL של 100 מיקרומטר הפוך פריימר RCAS6023R: (5 ' - CCGCAACACCCACTGGCATTACC - 3 ') כדי mastermix.
- להוסיף 0.075 ק µL AmpliTaq DNA פולימראז כדי mastermix.
- מערבבים את mastermix על ידי מצליף את הצינור עם האצבעות. ספין למטה matermix ב הסיכום מכונת צנטריפוגהy 3 ~ 5 שניות.
- µL aliquot 11.5 מ mastermix לכל פרט PCR צינורות. מערבולת בכל פעם לפני aliquoting על צינור חדש.
- מערבולת ולהוסיף 1 µL תבנית ה-DNA גנומי כל שפופרת PCR. להכין את הדנ א: גלולה תא
- Lyse ב 200 µl של 0.05 M NaOH. Pipet למעלה ולמטה כדי להמיס את גלולה.
- לחמם את התא lysate 98 מעלות במשך 20 דקות במכונת ה-PCR, ואז התקררה ל 25 מעלות צלזיוס
- µL להוסיף 20 1.0 M טריס-HCl (pH 7.5) צינורות ומאגר דגימות ה-DNA ב-4 מעלות צלזיוס
- לערבב את הדוגמאות על ידי מצליף צנטריפוגה בקצרה למשך 3-5 שניות. לשים צינורות למכונת ה-PCR-
- PCR מצבו מוגדר למשך 2 דקות 92 º C עבור דנטורציה הראשונית, ואחריו 40 מחזורים של 30 s ב 94 ° C עבור דנטורציה, 30 s ב 67 מעלות צלזיוס עבור חישול, 30 s ב-72 מעלות עבור סיומת ו- m 10 ב-72 מעלות עבור סיומת הסופי.
- לאחר סיום של PCR, להוסיף 3 µL של 6 x DNA הטעינה לצבוע כל דגימה. מיקס על ידי מצליף צנטריפוגה לזמן קצר עבור 3 ~ 5 שניות.
- PCR המוצרים נבדקים על ידי אלקטרופורזה ב- 2% (w/v) agarose ג'ל מאגר x TAE 1. הגודל של המוצר PCR שלה הוא 398 bp.
- תג genotyping.
להלן כללי התנהגות קוראת 10.5 µL של mastermix, µL 2 של ה-DNA גנומי עבור כל דגימה. הקפד מערבולת לפני הוספת ריאגנט בכל.- להכין את mastermix של מים נטולי נוקלאז µL 4.5 ו- 5 µL 4.00 x MyTaq התגובה מאגר עבור MyTaq DNA פולימראז.
- להוסיף µL 0.4 של 100 מיקרומטר פריימר לפנים TagF2: (5 ' - GGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG - 3 ') ו- 0.4 µL של 100 מיקרומטר הפוך פריימר TagR2: (5 ' - CAGAGCAGAATTGTGGAGTGG - 3 ') לתערובת הראשית.
- להוסיף 0.8 µL של 10 מיקרומטר, קודמן beta-2-microglobulin (B2m) פריימר mix עבור הפקד פנימי. PCR תחל B2m בקרה פנימית, קודמן beta-2-microglobulin (B2m), הם B2 F (5 ' - CACCGGAGAATGGGAAGCCGAA - 3 ') ו- B2 R (5 ' - TCCACACAGATGGAGCGTCCAG - 3 ').
- להוסיף 0.4 µL MyTaq DNA פולימראז כדי mastermix.
- מערבבים את mastermix על ידי מצליף את הצינור עם האצבעות. ספין למטה mastermix בתוך מכונת צנטריפוגה 3 ~ 5 ס
- µL aliquot 10.5 מ mastermix לכל פרט PCR צינורות. מערבולת בכל פעם לפני aliquoting על צינור חדש.
- מערבולת ולהוסיף 2 µL תבנית ה-DNA גנומי כל שפופרת PCR. הדנ א מוכן כמתואר לעיל-
- מערבבים את הפתרון על ידי מצליף צנטריפוגה בקצרה למשך 3-5 שניות. להכניס צינורות PCR מכונת.
- PCR מצבו מוגדר למשך 3 דקות 95° C עבור דנטורציה הראשונית, ואחריו 35 מחזורי 15 s ב 95 ° C עבור דנטורציה, 15 s ב 65 ° C עבור חישול, 30 s ב-72 מעלות עבור ההרחבה ולאחר 10 דקות ב-72 מעלות עבור סיומת הסופי.
- לאחר סיום של PCR, להוסיף 3 µL של 6 x טוען לצבוע את כל דגימה. מיקס על ידי מצליף צנטריפוגה לזמן קצר עבור 3 ~ 5 שניות.
- PCR המוצרים נבדקים על ידי אלקטרופורזה ב- 2% (w/v) ג'ל agarose במאגר x TAE 1. הגדלים של תג ומוצרי B2m PCR הם ~ 450 bp ו- 300 bp, בהתאמה.
- מס ערך מוסף genotyping.
להלן כללי התנהגות קוראת µL 10.5 של המיקס ריאגנט עבור כל דגימה. הקפד מערבולת לפני הוספת ריאגנט בכל.- להכין את mastermix של מים בחינם נוקלאז µL 5.6, דימתיל סולפוקסיד µL 0.5, 1.25 µL 10 x מאגר II עבור AmpliTaq DNA פולימראז ולאחר 1.375 µL של 25 מ מ MgCl 2 µL 0.125 של 25 מ מ dNTP.
- להוסיף 0.125 µL של 100 מיקרומטר tva-3 (5 ' - GCCCTGGGGAAGGTCCTGCCC - 3 ') ו 0.125 µL של 100 מיקרומטר tva-5 (5 ' - CTGCTGCCCGGTAACGTGACCGG - 3 ') כדי mastermix.
- 1.275 להוסיף µL של 10 מיקרומטר B2m פריימר mix עבור הפקד פנימי mastermix.
- להוסיף 0.125 µL AmpliTaq DNA פולימראז כדי mastermix.
- מערבבים את mastermix על ידי מצליף את הצינור עם האצבעות. ספין למטה mastermix בתוך מכונת צנטריפוגה בקצרה למשך 3-5 שניות.
- µL aliquot 10.5 מ mastermix לכל פרט PCR צינורות. מערבולת בכל פעם לפני aliquoting על צינור חדש.
- מערבולת להוסיף תבנית ה-DNA גנומי 2µL כל שפופרת PCR. הדנ א מוכן כמתואר לעיל-
- לערבב את הפתרון על ידי מצליף ולשים צנטריפוגה בקצרה במשך 3-5 ס צינורות לתוך המכונה PCR.
- PCR מצבו מוגדר למשך 2 דקות 92 º C עבור דנטורציה הראשונית, ואחריו 35 מחזורים של 30 s ב 94 ° C עבור דנטורציה, 30 s-60° C עבור חישול, 30 שניות ב-72 מעלות עבור סיומת, ו-10 דקות ב-72 מעלות עבור סיומת הסופי.
- לאחר סיום של PCR, להוסיף 3 µL של 6 x טוען לצבוע את כל דגימה. מיקס על ידי מצליף צנטריפוגה בקצרה במשך 3-5 ס
- PCR המוצרים נבדקים על ידי אלקטרופורזה ב- 2% (w/v) agarose ג'ל מאגר x TAE 1. הגדלים של מס ערך מוסף ומוצרים B2m PCR הם 500 bp ו- 300 bp, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיעור הזיהום ב- vivo ו- in vitro לקשרי של RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף תאים סרטניים על ידי וירוסים מבוססי-RCASBP הם ~ 20% ל ~ 80% בהתאמה 20. בתג RIP; RIP-מס ערך מוסף דגם העכבר, כ-4% מכלל באיי לנגרהנס 400 בכל עכבר באופן טבעי יתפתח גידולים 20; לכן אין כמות מספקת של תאים סרטניים כל עכבר לבדיקה היסטולוגית ו פנוטיפי של אפקט פוטנציאלי של גנים מועברים על ידי וירוסים. באמצעות מערכת זו, פונקציה גרעיני הרומן של Bcl-xL ב גרורות היה מזוהה 9. RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים נגועים עם RCASBP -Bcl-xL הציג שכיחות גבוהה יותר של קרצינומה פולשנית מאשר עכברים נגועים בווירוסים שליטה, RCASBP -ALPP (96% לעומת 74%). יתר על כן, 47% מכלל RCASBP -Bcl-xL-נגוע RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף העכברים פיתחו גרורות בבלוטות הלימפה הלבלב כאשר מורדמים בן 16 שבועות של גיל (איור 3 א), בעוד אין גרורות נמצאה בקרת עכברים 20.
יתר על כן, הוקרנו ספריה של סרטן גנים RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים, וזיהה את הגן הראשון המקדם גרורות הלימפה הלבלב, הכבד 21 (איור 3B ו 3 C). גן זה מקודד רצפטור תנועתיות בתיווך חומצה היאלורונית isoform B (RHAMMB) חלבון ומפעילה EGFR איתות 21. אנחנו הפגינו שגרורות בכבד ספציפי זה יכול להיות recapitulated ב וזמינותו וריד הזנב של גרורות ניסיוני שבו תאים סרטניים N134 בתחילה שהופץ דרך מיטות נימי הריאות של הנמען עכברים immunodeficient 21.
איור 1 : סכימטי של המבנים RCASBP(A), RCAS-X ו- RCAS-Y. שיבוט אתרים מסומנים בגופן כחול, מודגש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : השמה של הזרקת intracardiac. ציוני דרך אנטומי מוצגים עם קווים מקווקווים אופקיים על עצם החזה (המתוארים בלבן). על העור של העכבר, חריץ בחזה ובצלעות ותהליך xyphoid לשמש ציוני דרך, ואת המחט הוא מוכנס 1 מ מ בלבד באמצע החזה מעט שמאלה (אנטומיה) של עצם החזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : זיהוי של β בלבלב גרורתי תאים על-ידי immunostaining. הצילומים מראים נציג synaptophysin מכתים של גידולים נוירואנדוקריניים הלבלב גרורות בבלוטות הלימפה הלבלב (A, B) או בכבד (C). RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים היו נגועים רטרווירוסים RCASBP המצוין רוב בגיל 7 שבועות, מורדמים רוב בגיל 16 שבועות. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. הגדלה המקורי = 20 X. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, אנו המתואר מודל העכבר רב עוצמה, RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף, כדי להשיג את המסירה הגן סומאטית ויה רטרווירוסים העופות עבור זיהוי ואפיון הגורמים גרורתי. למרות RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים לפתח גידולים נוירואנדוקריניים הלבלב, גורמים גרורתי מזוהה במודל עכבר זה עשויה גם לקדם גרורה של סוגי סרטן אחרים.
הגישה שלנו יש את היתרון של החדרת שינויים גנטיים סומאטית במיוחד לתוך נגעים premalignant של תאי β בלבלב בצורה שליטה בזמן, ולכן יותר בנאמנות מחקה את התפתחות גידולים אנושיים סדיר. גישה זו מונע כל ההפרעות פוטנציאל היווצרות רקמה נורמלית, אשר נצפית לעיתים קרובות במודלים הטרנסגניים קונבנציונאלי בגלל הביטוי חוץ רחמי של הגן עניין במהלך הפיתוח. יתר על כן, זה הרבה יותר מהר כדי להפיק העופות וקטורים retroviral נושאת הגנים של עניין יותר כדי ליצור העכברים הטרנסגניים. נגזר RCASBP את העופות וקטור retroviral יכול לספק cDNAs (≤2.5 kb), shRNAs, miRNAs ו RNAs noncoding אחרים כדי לבטא tva תאים בתוך חוץ גופית ויוו. היעילות של זיהום (וגם זיהום מרובים) תלויה קצב התפשטות התאים היעד ואת הנגישות של התאים. כייל של > עונה 1 פרק 108 יחידות זיהומיות לכל ml נדרש עבור זיהום ויוו . משלוח ויראלי יעיל יותר יכולה להיות מושגת במבחנה עקב התפשטות המושרה תא ועל האפשרות של חשיפה חוזרת של כל התאים וירוסים.
טכניקת ההזרקה intracardiac מדויק חיוני עבור הכדאיות של עכברים. ראשית, µl 50 של המרחב האווירי במזרק אינסולין לפני שיצייר את ההשעיה ויראלי חיונית לראות דופק הלב. שנית, חשוב לתקן את המיקום של מזרק ברגע מופיע דופק האדום של הדם, וכדי לספק לאט ההשעיה ויראלי של µl 10-20 בכל פעם לראות דופק אדום בהיר של דם מופיעים במזרק. אם פולסים אדום בהיר של דם להפסיק לאחר המסירה של 10-20 µl ויראלי ההשעיה, מעט שינוי מיקום המחט יעזור. שלישית, לאחר הדחיפה האחרונה של הבוכנה כדי לספק ההשעיה ויראלי, לפני שאראה את הדופק דם, המחט צריך להיות נסוגים במהירות בחלל החזה, לחץ עדין מוחל על ההזרקה יסייעו להפחתת דימום פנימי. ואחרון אחרון חביב, אין להשתמש מחדש את המזרק אינסולין על עכבר אחר.
עבור יישומים עתידיים, זה RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף דגם העכבר יכול להיות משולב עם דגמים אחרים העכבר הטרנסגניים בטוק, נוק אאוט. יתר על כן, נוכל לדמות שילוב זה RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף דגם עכבר עם כלי לעריכת הגנום CRISPR-Cas9 ליצירת מוטציות נקודה בודדת, מחיקה, rearrangements גנומית כגון היפוכים של translocations 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים הרולד Varmus בריאן ק. לואיס, דאגלס Hanahan, דני הואנג, שרון פנג, מייגן וונג, Manasi מ Godbole. Y.C.N.D. נתמך על ידי משרד ההגנה גרנט W81XWH-16-1-0619 NIH גראנט 1R01CA204916.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Khanna, C., Hunter, K.
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276 (2007).
- Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
- Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
- Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
- Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
- Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384 (2016).
- Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
- Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
- Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
- Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
- Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
- Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
- Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
- Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).
