Die menschliche Netzhaut besteht aus funktional und molekular verschiedene Regionen, einschließlich der Fovea, der Makula und der peripheren Netzhaut. Hier beschreiben wir eine Methode mit Stanzbiopsien und manuelle Entfernung von Gewebeschichten von einem menschlichen Auge zu zerlegen und diese verschiedenen retinalen Regionen für nachgeschaltete Proteomic Analysen zu sammeln.
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Methodenartikel
Dissektion der menschlichen Netzhaut und RPE-Aderhaut für Proteomic Analysen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die menschliche Netzhaut besteht aus der sensorischen Neuroretina und die zugrunde liegenden Netzhaut pigmentierten Pigmentepithels (RPE), ist fest auf die vaskuläre choroid Schicht komplexiert. Verschiedene Regionen der Netzhaut unterscheiden sich anatomisch und molekular, einzigartige Funktionen zu erleichtern und zeigen unterschiedliche Anfälligkeit für Krankheiten. Proteomic Analysen der einzelnen Regionen und Schichten bieten wichtige Einblicke in den molekularen Prozess von vielen Krankheiten, einschließlich altersbedingter Makula-Degeneration (AMD), Diabetes Mellitus und Glaukom. Trennung von retinalen Regionen und Schichten ist jedoch unerlässlich, bevor quantitative Proteomik Analyse erreicht werden kann. Hier beschreiben wir eine Methode zur Präparation und Sammlung von der Fovea, Makula und peripheren Netzhaut Regionen und RPE-Aderhaut-Komplex zugrunde, an denen regionalen Stanzbiopsien und manuelle Entfernung von Gewebeschichten von einem menschlichen Auge. Eindimensionale SDS-PAGE als auch nachgelagerte Proteomic Analysen, wie z.B. flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), lässt sich Proteine in jeder seziert retinalen Schicht zu identifizieren enthüllt molekularen Biomarker für Netzhauterkrankung.
Einleitung
RPE, Netzhaut und Aderhaut sind komplexe Gewebe, die wichtige regionale Unterschiede in pathologischen Empfindlichkeiten1,2Proteinexpression und physiologische Funktion zu demonstrieren. Beispielsweise zeigen Krankheiten wie altersbedingte Makula-Degeneration (AMD), Retinitis Pigmentosa und zentrale seröse Retinopathie charakteristische Lokalisation innerhalb der Fovea, der Makula oder der Netzhaut Peripherie1,3, 4,6. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zeigen, wie unterschiedliche Retinal Regionen unabhängig verkostet werden können. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, einen zuverlässigen Kompass für die Sammlung von Gewebeproben aus der fovealen, Makula und peripheren Regionen der menschlichen Netzhaut und RPE-Aderhaut für Proteomic Analysen zur Verfügung zu stellen. Die Gründe für die Entwicklung und Nutzung dieser Technik ist, dass durch Proteomic Analysen dieser spezifischen retinalen Regionen wichtig, dass molekulare Erkenntnisse kann über die physiologische und pathophysiologischen Funktionen dieser Regionen.
Dieser Ansatz verspricht die Proteomik-Basis für relative regionale Krankheit Empfindlichkeiten zu offenbaren und die Identifizierung von neuen spezifischen therapeutischen Ziele zu erleichtern. In der Tat boten Proteomic Untersuchungen des Glaskörpers und seine Wechselwirkungen mit der Netzhaut wichtige Einblicke in die molekularen Zusammensetzung und Funktion von gesundem und krankem Gewebe5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. klar vergleichende Proteomic Analysen aus verschiedenen retinalen Regionen fehlen jedoch. Die Technik hilft, um diese dringend notwendigen Studien, bietet Vorteile gegenüber anderen Methoden durch eine zuverlässige und reproduzierbare Gewebe Sammlung Ansatz zu unterstützen. Um so mehr, ist der Ansatz sehr gut erreichbar, unter Ausnutzung der Standardgröße und leicht verfügbare Gewebe Punch Biopsie Werkzeuge. Unsere Technik betont entsprechende Erhebung und Speicherung von Geweben für die Proteomik Verarbeitung, so dass wichtige Überlegungen für die Proteinstabilität und Abbau. Daher ist diese Methode am besten geeignet für Ermittler in Anbetracht nachgelagerten molekulare Analyse der Proteomik Faktoren.
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Protokoll
diese Studie wurde von der University of Iowa genehmigt ' s Institutional Review Board und hält sich an den Grundsätzen, die in der Deklaration von Helsinki festgelegten.
1. Foveal und Makula Biopsie-Punch
- öffnen und Schmetterling, das menschliche Auge, so dass es besteht aus 4 separaten Klappen des Gewebes, wie in einer früheren Publikation beschrieben. 5
- beginnend mit butterflied menschlichen Auge in einer Petrischale gelegt, zentrieren Sie eine 4-mm-Stanzwerkzeug-Biopsie über die Fovea, nach unten drücken und sanft Rollen, bis ein Einschnitt, um die Fovea gemacht wird.
- Generieren als nächstes einen Einschnitt in der Makula durch Zentrierung und eine 8 mm Haut Biopsie Stanzwerkzeug in den Arkaden der Makula herunterdrücken, leichtem Druck und Rollen. Dies erzeugt einen zweiten, äußeren Ring des Gewebes rund um die erste.
2. Peripheren Netzhaut-Biopsie-Punch
- Verwendung der 4-mm-Haut-Punch Biopsie Werkzeug, um eine Reihe von Schlägen in der peripheren Netzhaut, vor den Toren der Arkade. Hier machen zwei Schläge für jeden Quadranten Klappe.
Hinweis: Nachdem die Schläge gemacht, das Auge werden zwei konzentrische Schläge in der Mitte, Vertretung der Fovea und Makula, und zwei an der Basis des jeweils in Höhe von Klappe Schläge 8 Schläge in der peripheren Netzhaut.
3. Fovea und Makula Biopsie Sammlung
- wie das Gewebe jetzt abholbereit, sammeln alle Gewebebiopsien in separaten Microfuge Röhren und Einfrieren mit flüssigem Stickstoff für downstream-Processing. Speichern Sie alle Proben bei-80 ° C bis Nutzung.
- Verwenden eine gebogene 0,12 Colibri Zange um die Kanten des lichtdurchlässigen Gewebes der Netzhaut Fovea greifen. Um zu sammeln, zu erheben und trennen die Fovea Gewebe von der zugrunde liegenden RPE-Aderhaut.
- Verwenden ebenso die 0,12 Colibri-Zange, um den äußeren Ring des transluzenten Makula Gewebes zu erfassen. Wenn das Gewebe noch mit zugrunde liegenden oder angrenzenden Gewebe verbunden ist, Westcott Schere verwenden, um den Rand, erfassen nur die Netzhaut Komponente und seziert entfernt Sehnerv Gewebe im Stempel enthalten sorgfältig trimmen.
4. Peripheren Netzhaut Sammlung
- die gebogene 0,12 Colibri Zange verwenden, um vorsichtig die peripheren Netzhaut-Gewebe-Scheiben aus dem zugrunde liegenden RPE-Aderhaut und innerhalb einzelner Microfuge Rohre trennen.
- Bei restliche Glaskörper, die Zange verwenden, um heben und trennen das Gel entfernt so weit wie möglich vor der Abholung des retinalen Gewebes. Sobald die Netzhaut entfernt wurde, bleibt der pigmentierten RPE-Aderhaut unter.
5. Fovea und Makula RPE-Aderhaut Sammlung
- Gebrauch der 0,12 Colibri Zange, die Ränder des dunklen RPE-Aderhaut Gewebes zu erfassen, die unter den Bereich der Fovea entfernt liegt. Sorgfältig trennen dieses Gewebe die Sklera und sammeln.
- Mit der gleichen Pinzette fassen Sie die Kanten des Außenrings der dunklen RPE-Aderhaut-Gewebe zugrunde liegenden Bereich entfernten makularen. Sorgfältig trennen dieses Gewebe von der Sklera durch fassen die Kanten an verschiedenen Stellen rund um den Ring und leichtes ziehen. Schließlich, der Ring des RPE-Aderhaut Gewebe wird verdrängt und kann gesammelt werden.
Hinweis: Sekundäre Zange in der gegenüberliegenden Hand kann helfen bei der Manipulation der RPE-Aderhaut-Gewebe bei der Entnahme. Wie das Netzhautgewebe Wescott Schere einsetzbar, bei der alle Gewebe, die nicht vollständig eingeschnitten wurde mit dem Stempel-Werkzeug entfernt.
6. Peripheren Netzhaut RPE-Aderhaut Sammlung
- verwenden die 0,12 Colibri-Zange zum Abschälen der RPE-Aderhaut im Bereich 8 peripheren Punsch.
- Wie zuvor die RPE-Aderhaut-Gewebe in Microfuge Röhren und frieren mit flüssigem Stickstoff für downstream-Processing. Bewahren Sie alle Proben bei-80 ° C bis Nutzung.
7. Schere Dissektion
Hinweis: Wenn die Durchschlag Biopsie Klinge stumpf ist oder das Stanzwerkzeug Biopsie ist nicht hart genug geschoben, es möglicherweise keine saubere Umgebung das Gewebe.
- In diesen Fällen wegziehen des Gewebes so weit wie möglich und verwenden Sie dann Westcott Schere zu schneiden und zu trennen.
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Ergebnisse
Retinal und RPE-Aderhaut Gewebe können auf verschiedene Weise eine individuelle Untersuchung entsprechend verarbeitet werden. Nach der Entnahme verfügen die Forscher Proben von Retinal und RPE-Aderhaut-Gewebe aus der fovealen Region, äußere Makula und peripheren Netzhaut (Abbildung 1). Insbesondere gehören die Fovea Region Punch der Fovea, der Parafovea und eine kleine Menge der angrenzenden Perifovea. Der Makula Stempel beinhaltet den Rest von der Perifoveal...
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Diskussion
Nach Gewebe sind Sammlung, Probenbehandlung und Behandlung wichtige Überlegungen14. Konservierung in flüssigem Stickstoff wird über chemische Fixierung, bevorzugt, da Letzteres beschädigt, Protein-Struktur kann die nachgelagerte Analyse verzerren könnten. Darüber hinaus ist flüssiger Stickstoff Erhaltung bevorzugt, Methoden, die keine Einfrieren der Proben beinhalten. Vor allem, Ferrer Et Al. zeigten erhebliche Unterschiede im Proteingehalt zwischen Gehirn Proben bei 4 ° C oder Raumtemper...
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Offenlegungen
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Danksagungen
VBM wird unterstützt durch Zuschüsse des NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 und R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant #: 2013103 und Forschung zu verhindern, dass Blindheit (RPB), New York, NY. MT und GV werden unterstützt durch NIH T32GM007337 zu gewähren.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 4-mm-Hautstanz-Biopsiewerkzeug | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm-Hautstanz-Biopsiewerkzeug | Miltex | REF 33-37 | |
| 0,12 Colibri Pinzette | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Schere | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Mikrofuge-Röhrchen | Eppendorf | #022364111 | 1,5 mL |
| Flüssiger Stickstoff | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
Referenzen
- Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration. Eye (Lond). , (2016).
- Zhang, P., et al. Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid. Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).
- Funke, S., et al. Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples. Sci Rep. 6, 29759(2016).
- Decanini, A., et al. Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes. Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex. JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. J Vis Exp. (50), (2011).
- Skeie, J. M., et al. Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques. Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex. PLoS One. 8 (11), e82140(2013).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M. Translational vitreous proteomics. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 204-208 (2014).
- Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. Proteomic insight into the molecular function of the vitreous. PLoS One. 10 (5), e0127567(2015).
- Velez, G., et al. Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease. JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).
- Velez, G., et al. Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment. Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Ferrer, I., et al. Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).
- Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization. J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).
- Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics. J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).
- Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains. PLoS One. 6 (6), e21405(2011).
- Nagy, C., et al. Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain. J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).
- Mukherjee, S., et al. Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection. Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).
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