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Genetics

Messung der mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der Hefe S. Cerevisiae hypoxischen Antwort

Published: August 10, 2017 doi: 10.3791/56226
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Department of Molecular Biology, Rowan School of Osteopathic Medicine, 2Department of Biological Sciences, Rowan University

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit RNA-Seq, um mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der hypoxischen Antwort von S. Cerevisiae Zellen zu überwachen. Diese Methode kann zu analysieren, gen-Expression in eine zelluläre Reaktion angepasst werden.

Abstract

Komplexe Änderungen in der Genexpression zu vermitteln in der Regel einen Großteil eine zelluläre Reaktion. Jedes Gen kann Ausdruck mit einzigartigen Kinetik ändern, da das Gen durch den bestimmten Zeitpunkt einer der vielen Reize, Signalisierung, Wege oder Nebenwirkungen geregelt ist. Um das gesamte gen einzufangen war Ausdruck Reaktion auf Hypoxie in der Hefe S. Cerevisiae, RNA-Seq-Analyse verwendet, um die mRNA-Niveaus aller Gene zu bestimmten Zeitpunkten nach der Exposition gegenüber Hypoxie zu überwachen. Hypoxie entstand durch wachsenden Zellen in ~ 100 % N2 Gas. Wichtig ist, wurden im Gegensatz zu anderen hypoxischen Studien, Ergosterin und ungesättigten Fettsäuren nicht zu den Medien hinzugefügt, da dieser Metaboliten Genexpression beeinflussen. Zeitpunkten wurden im Bereich von 0 - 4 h nach Hypoxie ausgewählt, weil damals die wichtigsten Änderungen in der Genexpression erfasst. Zu jedem Zeitpunkt Mitte Log hypoxische Zellen waren schnell gefiltert und eingefroren, Begrenzung der Exposition gegenüber O2 und damit einhergehende Veränderungen der Genexpression. Gesamt-RNS war aus Zellen extrahiert und verwendet, um bereichern für mRNA, die dann in cDNA umgewandelt wurde. Aus diesem cDNA Multiplex-Bibliotheken erstellt wurden und mindestens acht Proben wurden in einer Spur von einer nächsten Generation Sequenzer sequenziert. Eine Post-Sequenzierung Pipeline wird beschrieben, worunter Qualität Basis trimmen, Kartierung und Bestimmung der Anzahl der Lesevorgänge pro gen zu lesen. DESeq2 innerhalb der statistischen R-Umgebung wurde verwendet, um Gene zu identifizieren, die an einem hypoxischen Zeitpunkten wesentlich verändern. Analyse von drei biologische Wiederholungen zeigte hohen Reproduzierbarkeit, Gene der unterschiedlichen Kinetik und eine große Anzahl von erwartet O2-Gene reguliert. Diese Methoden können zur Untersuchung, wie die Zellen der verschiedenen Organismen auf Hypoxie im Laufe der Zeit reagieren und angepasst, um gen-Expression in anderen zellulären Reaktionen zu studieren.

Introduction

Viele Organismen reagieren auf Hypoxie oder niedrigen O2, durch die Veränderung der gen-Expression- 1,-2,-3. Diese Antwort hilft Zellen, die mit dem Mangel an ein Substrat für die aerobe Atmung und für mehrere biosynthetischen Reaktionen von entscheidender Bedeutung, sondern auch mit einem wechselnden Redox-Zustand 4zu bewältigen. Mehrere Studien in S. Cerevisiae Microarray zeigen, dass die mRNA-Niveaus von Hunderten von Genen in Erwiderung auf Hypoxie 5,6,7,8,9 ändern , 10 , 11 , 12. vor kurzem RNA-Seq wurde verwendet, um Veränderungen der Genexpression im Laufe der Zeit während der Hypoxie 13charakterisieren. Hier werden die experimentellen Details präsentiert und diskutiert.

Hypoxie kann auf verschiedene Weise, jeder produziert eine andere Ebene der O2erreicht werden. Hier, gründete Hypoxie kontinuierlich fließenden ultra-high-Reinheit N2 in Flaschen, die [O2] senkt sofort mit reproduzierbaren Kinetik 10aufgelöst. Es ist möglich, dass es einige O2 Moleküle, die Stoffwechsel und die Genexpression beitragen, aber dieses Umfeld sehr in der Nähe von anaeroben als. In Ermangelung von O2nicht Hefezellen Biosynthese Häm, Ergosterin und ungesättigten Fettsäuren 4,12,14. Frühere Studien haben daher diese Metaboliten aufgenommen, beim Anbau von Hefe ohne Sauerstoff 5,10,15. Jedoch viele hypoxische Antworten sind durch Erschöpfung dieser Metaboliten vermittelt und somit ergänzen sie kehrt die hypoxischen gen Ausdruck Antworten 12,16. Um natürliche Hypoxie zu imitieren, waren diese Metaboliten die Medien nicht hinzugefügt. In der kurzen Zeit, dass Zellen Hypoxie ohne das Vorhandensein dieser wichtige Metaboliten ausgesetzt waren gab es keine spürbaren Zelltod (Daten nicht gezeigt) noch ein längerer Stress-Reaktion- 13.

Die Antwort ist ebenfalls abhängig von der Belastung und der Genotyp. Besonders wichtig sind die Allele der bekannten Regulatoren von hypoxischen Antworten 2. S288C Belastung Hintergrund ist sehr gewünscht, so dass Ergebnisse mit den anderen genomischen Studien mit dieser Sorte verglichen werden können. S288C enthält jedoch ein teilweiser Verlust der Funktion Allel der HAP1 gen 17, kritische transcriptional Regulator für die hypoxischen Antwort. Dieses Allel wurde repariert, in S288C mit einem Wildtyp Kopie aus dem Σ1278b Stamm Hintergrund 11.

Genexpression ist stark abhängig von der zellulären Umgebung. Genomweite mRNA Analyse durchführen, ist es daher wichtig, eine konstante Umgebung beizubehalten und gleichzeitig die unterschiedlichen ein weiterer Parameter wie Zeit, Anregung oder Genotyp. Um hoch reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, betrachten Sie diese drei Methoden für die Untersuchung und aller seiner biologischen oder technischen Wiederholungen. Erstens sollten die gleichen Experimenter(s) Durchführung der Studie, da technische Verfahren über Experimentatoren variieren. Zweitens sollte die gleiche Charge von Zutaten in den Wachstumsmedien verwendet werden, da jede Charge hat eine etwas andere Zusammensetzung, die Genexpression beeinflussen können. Drittens um Zellzyklus Auswirkungen zu minimieren, sollte jeden Zeitpunkt des asynchronen Zellen in der Mitte des Log-Phase des Wachstums (1-2 x 107 Zellen/mL) bestehen.

Wenn eine komplexe Antwort wie die gen-Ausdruck-Reaktion auf Hypoxie zu charakterisieren, ist ein zeitlichen Verlauf vorteilhaft für die Bestimmung der Kinetik der verschiedenen Veranstaltungen. Bestimmten Zeitpunkten sollte gewählt werden, die die wichtigsten Änderungen der Antwort zu erfassen. In dieser Studie wurden Zeitpunkten zwischen 0 und 4 h beobachtet, weil letzten Experimente weit verbreitete Änderungen in der Genexpression während diesem Zeitraum 13 zeigten.

Zur Messung der globalen Genexpression wurde RNA-Seq gebrauchte 18,19. Diese Methode nutzt Next Generation Sequencing, um die relative Häufigkeit jedes Gen Niederschrift zu bestimmen. Im Vergleich zu DNA-Microarray Analyse, weist RNA-Seq höhere Empfindlichkeit (, weniger reichlich Transkripte zu erkennen), einen größeren Dynamikbereich (um größere Falte Veränderungen zu messen) und hervorragende Reproduzierbarkeit (, Genexpression im Laufe der Zeit genau zu folgen). In der Regel ist die zelluläre RNA ribosomalen RNA, die so viele Methoden entwickelt wurden, um für spezifische RNA Arten 20bereichern. Hier, Poly-T Perlen wurden verwendet, um Poly-A-haltige mRNA Transkripte, obwohl die verschiedenen kommerziell zu reinigen - erhältlichen rRNA Erschöpfung Kits könnte auch wirksam bei der mRNA Bereicherung sein.

Hier zeichnete sich die S. Cerevisiae gen Ausdruck Reaktion auf Hypoxie. Zellen Hypoxie ausgesetzt waren und dann zu acht Zeitpunkten abgetastet (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 und 240 min). Reproduzierbarkeit zu bestätigen und um statistisch veränderte Abschriften zu identifizieren, wurden drei biologische Wiederholungen durchgeführt. RNA wurde durch mechanische Störungen und Spalte Reinigung extrahiert und dann für die Analyse der RNA-Seq verarbeitet. Die Post-Sequenzierung Pipeline wird beschrieben und Programmierung Skripte werden bereitgestellt, mit denen die exakte Replikation der Analysen durchgeführt. Speziell, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, R statistische Umgebung 24und die DESeq2 Paket 25 dienten, die RNA-Seq-Daten verarbeiten und 607 Gene zu identifizieren, die wesentlich zu, während verändern Hypoxie. Hauptkomponentenanalyse (PCA) und Genexpression von der Wiederholungen angegeben die Reproduzierbarkeit der Technik. Clustering und Heatmaps offenbart weit reichende Ausdruck Kinetik, während gen Ontology (gehen Sie) Analyse zeigte, dass viele zelluläre Prozesse, wie Atmung, in den Sauerstoff-regulierten Genen angereichert sind.

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Protocol

1. Induktion Hypoxie

  1. Einen Tag oder mehr vor der Hypoxie zeitlicher Verlauf: bereiten Sie den Brutkasten, Zell-Filter System, Vakuum, Gas-Tank, Fläschchen, Stopper, Glasröhren und Schlauch, wie in der Materialtabelle.
  2. Ort der N2 Tank, Inkubator, Vakuum und Filtersystem in unmittelbarer Nähe, schnelle Bearbeitung von Zellen aktivieren.
  3. Bereiten Sie sterile Flüssigmedien YPD (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 2 % Glukose) durch Mischen der Komponenten in einer Glasflasche und Autoklavieren.
  4. Grundriss der Flaschen in den Inkubator.
    Hinweis: Aus dem N-2 -Tank, der erste Kolben werden einen Wasserabscheider wird, der zweite Kolben der letzte Zeitpunkt, die dritte Flasche werden bis zum vorletzten Mal Punkt und so weiter bis die letzte Flasche die endgültige Wasserabscheider ist. Abbildung 1 zeigt die Reihenfolge und die Verbindungen zwischen den Kolben.
  5. Impfen Sie am Vortag den zeitlichen Verlauf eine Hefe-Kolonie in eine Kultur von 5 mL Flüssigkeit YPD in ein steriles Röhrchen. Holen Sie insbesondere eine vollständige Kolonie von einer Platte mit einem sterilen Applikator-Stick ab. Legen Sie den Stick in die flüssige YPD und schütteln Sie den Stick, bis die meisten Zellen in der Schwebe sind.
  6. Drehen Sie die Rohre bei 30 ° C über Nacht (~ 16 h).
    Hinweis: Nach 16 h, werden Wildtyp Zellen Sättigung (~ 2 x 108 Zellen/mL), gekennzeichnet durch eine stark bewölkt Kultur erreichen. Andere Stämme können länger dauern, Sättigung erreichen und sollte durch Messung der Zellkonzentration mit einem Spektrophotometer getestet werden, wie in Schritt 1.9.4 angegeben.
  7. Am Tag der zeitliche Verlauf nach 16 h Inkubation, verdünnen die gesättigte Kultur über Nacht 01:50 mithilfe einer 5 mL pipettieren, 4 mL platzieren Kultur in 196 mL flüssige YPD innerhalb einer steril 500 mL Flasche. Wachsen Sie mit Schütteln bei ~ 200 u/min für 4 h bei 30 ° C.
    Hinweis: Nach 4 h erreichen eine Wildtyp-Kultur eine Mid Log Konzentration von ~ 1-2 x 107 Zellen/mL.
  8. Während der 4 h Inkubation beschriften Sie die Fläschchen (für Hypoxie und Wasser fallen) und die 50 mL Röhrchen. Wenn der Inkubator in 1.7 Schritt oben nicht für den zeitlichen Verlauf von Hypoxie verwendet wird, schalten Sie die anderen Inkubator und setzen auf 30 ° C.
  9. Kurz vor Zellen Hypoxie zu unterwerfen:
    1. Fügen Sie hinzu ~ 50 mL Wasser, zwei sterile 250 mL-Flaschen dienen als die Wasserfallen werden.
    2. Füllen Sie 1/3 des Eises Eimer mit flüssigem Stickstoff und Tauchen Sie eine Polystyrol-Hartschaum-Rack um 50 mL Zentrifuge Röhren zu halten.
    3. Richten Sie das Filtersystem für das Sammeln von Zellen. Fügen Sie eine Sterilfilter Disc auf der unteren Einheit des Filtersystems mit einer sterilen Pinzette, achten Sie darauf, nur die Kanten der Filterscheibe berühren. Die Filtereinheit oberen auf die unteren Filtereinheit und mit den Klemmen mit dem System zur Verfügung gestellt. Stellen Sie sicher, dass die unteren und oberen Einheiten ausgerichtet sind, so dass es eine gute Abdichtung und keine Leckage.
    4. Messen Sie die Zellkonzentration mit einem Spektrophotometer. Verdünnen Sie Zellen, so dass sie im linearen Bereich des Spektralphotometers – OD600 zwischen ~0.2 - 0,6, je nach dem Spektralphotometer gemessen werden können.
      Hinweis: Eine OD600 Einheit ist ~ 3 x 107 Zellen/mL, je nach Zellmorphologie und Spektralfotometer. Eine Konzentration von ~ 1-2 x 107 Zellen/mL wird erwartet, entspricht OD600 ~0.33 - 0,66.
    5. Erhalten Sie schnell die Zeitprobe 0.
      1. Verbinden Sie das Filtersystem mit starken (~ 10 Mbar) Vakuum über Vakuumschlauch und 1.000 mL Flasche Falle. Schalten Sie das Vakuum. Die obere Einheit die Kultur (in der Regel ~ 20 mL) gießen und warten, bis die Flüssigkeit durch den Filter gezogen werden (~ 10 s, je nach Stärke des Vakuums).
      2. Vorsichtig entfernen Sie die Filterscheibe mit sauberen Pinzette und setzen Sie in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen. Legen Sie die Zentrifugenröhrchen sofort in das Rack in flüssigen Stickstoff getaucht. Wichtig ist, nicht vorab chill die Rohre vor dem Einsetzen des Filters, da die Rohre explodieren werden.
      3. Nach > 30 s, Ort der Röhre in einem-80 ° C Gefrierschrank für die späteren RNA-Extraktion. Reinigen Sie nach jeder Filtration und wieder zusammenbauen Sie, das Filtersystem. Spülen Sie das System von durchziehen Wasser für 10 s ohne eine Filterscheibe. Zu guter Letzt trocknen Sie das System mit einem Papiertuch.
    6. Verdünnen Sie die 4 h-Kultur in verschiedenen Fläschchen für die verschiedenen Zeitpunkte, damit jedem Kolben Mitte Log Konzentration (~ 1-2 x 107 Zellen/mL) zum angegebenen Zeitpunkt der Hypoxie erreicht.
      Hinweis: Die Tabelle 1 zeigt Verdünnungen, die für die Wildtyp S288C HAP1+ haploiden Belastung verwendet wurden. Es wird empfohlen, jede Belastung in diesen hypoxischen Kulturbedingungen zu testen und die Verdünnungen entsprechend anpassen.
    7. Sobald Zellen und Medien Fläschchen hinzugefügt werden, ersetzen Sie die Aluminiumfolie abdecken der Küvette öffnen mit einem Stopfen mit zwei Glasröhren eingefügt.
    8. Platzieren Sie die Fläschchen in den Inkubator in das Layout bestimmt früher.
    9. Sicher verbinden Sie den Schlauch, wie in Abbildung 1dargestellt.
    10. Überprüfen Sie, dass die Stopper fest in die Küvette Öffnungen herausgedrückt werden.
  10. Zur Zeit 0 öffnen Sie das Regulierventil. Legen Sie den Durchflussmesser auf 3 L/min.
    Hinweis: Sprudeln wird in beiden Flaschen Wasser beobachtet richtige Gasstrom angibt. Wenn dies nicht der Fall ist, überprüfen Sie alle Verschlüsse sind eng und Schlauch ist ordnungsgemäß angeschlossen.
  11. Schließen Sie den Inkubator und die Schütteldrehzahl auf ~ 200 u/min festgelegt. Einen Timer gestartet wird.
  12. Richten Sie vor jeden Zeitpunkt das Filter-System wie oben in Schritt 1.9.3 beschreiben.
  13. Haben Sie zu jedem Zeitpunkt (z.B., 5 min, 10 min, etc.) zwei Personen schnell die Zellen wie folgt bearbeiten:
    1. Ego: den entsprechende Kolben aus der Halterung zu entfernen und den Stopfen (mit Glasrohr angeschlossen).
      Hinweis: Dies nicht den Fluss der N2 einer der verbleibenden Kulturflaschen bricht aber unterbricht vorübergehend die Strömung zu der letzten Wasserabscheider.
    2. Zweite Person: Pipettieren 1 mL der Kultur und in eine Küvette zu verzichten. Schließen Sie den Schlauch aus der Kultur-Flasche, die jetzt am Ende der Zeile bis zum letzten Wasserabscheider (eine Röhre und ein Stopfen wird dabei entfernt werden.). Dann messen Sie Zellkonzentration in der Küvette, wie oben in Schritt 1.9.4 beschrieben.
    3. Ego: Gießen Sie den Rest der Kultur in der Vakuumfiltration System, und führen Sie dann filtern und Einfrieren, wie oben in Schritt 1.9.5 beschrieben.
  14. Wenn Sie fertig sind mit den Zeitpunkten, schalten Sie das N2 Gas. Schließen Sie zunächst den Regler und warten Sie, bis der Druck zum lösen, und dann schalten Sie den Durchflussmesser. Schließlich zerlegen Sie das System zu und reinigen Sie alle Materialien mit Wasser und dann 70 % Ethanol.

2. RNA-Extraktion

  1. Bereiten Sie RLT-Puffer zur Reinigung von RNA-Spalte, wie in der Materialtabellebeschrieben.
  2. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung der DNase durch Zugabe von 10 µL der DNase Vorratslösung zu 70 µL Puffer RDD pro Probe (siehe Materialtabelle).
  3. Entfernen Sie die 50 mL Röhrchen mit Filter und Zellen von-80 ° C Gefrierschrank zu und auf Eis auftauen (ca. 15 min). Führen Sie die folgenden Schritte mit Röhren auf dem Eis.
  4. Beschriften Sie 2 mL Schraubverschluss Röhrchen und legen Sie sie auf dem Eis, eine Röhre für jede Probe. Jedes Rohr, mit einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu schöpfen und messen die Perlen fügen Sie ~0.6 mL säuregewaschen Perlen hinzu.
  5. Die 50 mL Röhrchen 0,6 mL kaltem Puffer RLT hinzufügen.
  6. Pipettieren rauf und runter zu Zellen aus Filter entfernen und suspendieren in Lösung. Lassen Sie den Filter in der Lösung bleiben, da der Filter wird die Lösung einweichen. Entfernen Sie alle Lösung absorbiert in den Filter mithilfe der Pipettieren Spitze, um den Filter gegen die Wand des Rohres zu quetschen.
  7. Übertragen Sie alle Flüssigkeit aus der 50 mL-Tube, der Schraubverschluss-Röhrchen mit Perlen.
  8. Legen Sie die Schraubverschluss-Röhrchen in eine Korn-Mühle-Homogenisator und 1 min laufen lassen.
    Legen Sie sofort die Röhren für 3 min auf Eis. Wieder, setzen Sie die Rohre in den Homogenisator und 1 min laufen lassen.
  9. Entfernen Sie die Rohre aus den Homogenisator und Platz für 5 min auf Eis. Die Perlen werden auf den Boden der Röhrchen abrechnen.
  10. Führen Sie die restlichen Schritte bei Raumtemperatur.
  11. Mit einem Pipettieren übertragen nur die lysate (~ 350 µL), die Perlen zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu vermeiden.
  12. Microcentrifuge für 2 min bei max. Drehzahl und übertragen Sie dann den Überstand zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
  13. Fügen Sie 1 Volumen von 70 % Ethanol (aus 200 Beweis Molekularbiologie-Klasse Ethanol). Mischen Sie gut durch pipettieren.
  14. Übertragen Sie die Lösung und einem Niederschlag einer RNA-Spalte, die in einem 2 mL Sammlung Rohr platziert wurde.
  15. Zentrifuge für 15 s bei ≥12, 000 X g und entsorgen der durchströmten (die Flüssigkeit im Rohr).
  16. Die Spalte 350 µL Puffer RW1 hinzufügen. Zentrifuge für 15 s bei ≥12, 000 X g und entsorgen der durchströmten.
  17. Fügen Sie 80 µL DNase ich Inkubation mischen, um die Spalte-Membran (nicht bekommen, auf Seiten des Rohrs) und für 15 min sitzen lassen.
  18. Spalte 350 µL Puffer RW1 hinzufügen. Microcentrifuge für 15 s bei ≥12, 000 X g und entsorgen der durchströmten.
  19. Die Spalte 500 µL Puffer RPE hinzufügen. Microcentrifuge für 15 s bei ≥12, 000 X g und entsorgen Durchflussverfahren.
  20. Die Spalte 500 µL Puffer RPE hinzufügen. Microcentrifuge für 2 min bei ≥12, 000 X g.
  21. Sorgfältig entfernen Sie die Spalte und legen Sie in eine neue 2 mL Sammelröhrchen. Microcentrifuge auf Hochtouren für 1 min (um die Membran vollständig zu trocknen).
  22. Entsorgen Sie das Sammelröhrchen und setzen Sie die Säule zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Die Spalte Membran 30 µL RNase-freies Wasser hinzufügen.
  23. Eluieren Sie die RNA aus der Spalte von Microcentrifuging für 1 min bei ≥12, 000 X g. Beim Laden der Spalten in der Microcentrifuge sicherstellen Sie, dass die Deckel von dem Sammelrohr in Richtung stehen die Zentrifuge dreht sich um die Lider Abbruch zu verhindern.
  24. Hinzu kommt ein weiterer 30 µL RNase-freies Wasser der Spalte Membran, unter Beibehaltung der Spalte in der gleichen Microcentrifuge Schlauch.
  25. Microcentrifuge für 1 min bei ≥12, 000 X g, so dass die endgültige Eluat Lautstärke 60 µL.
  26. Speichern Sie jede 1,5 mL Röhrchen mit 60 µL RNA in den-80 ° C Gefrierschrank.

3. Bestimmung der RNA-Konzentration und Qualität

  1. Messen Sie die Konzentration von RNA und DNA in jeder RNA-Probe mit (a) Fluorometer, (b) DNA und RNA-spezifische fluoreszierende Farbstoffe und (c) Assay Röhren, wie in der Materialtabelleaufgeführt. Folgen Sie den Anweisungen der Fluorometer und Farbstoffe.
  2. Alternativ messen die Nukleinsäure-Konzentration mit einem UV-Spektrophotometer setzen bei 260 nm.
    Hinweis: Eine A-260 -Lesung von 1,0 entspricht ~ 40 µg/mL einsträngige RNA.
  3. RNS-Qualität testen, indem Sie die RNA auf einem kommerziellen Nukleinsäure-Analysator ausgeführt (siehe Materialtabelle) oder auf einem standard Formaldehyd/Agarose gel 26.

(4) RNA-Seq-Analyse

  1. Bilden Sie aus den Gesamtbestand der RNA 21 µL von 100 ng/µL RNA in RNase-freies Wasser. Verwenden Sie 1 µL von diesem 21 µL, um die RNA-Konzentration wie oben beschrieben zu testen. Senden Sie die restlichen 20 µL (2 µg) gesamte-RNS eine externe Sequenzierung Center für mRNA Bereicherung, Strang-spezifischen Bibliothek Vorbereitung (mit acht oder mehr Barcodes für multiplexing) und Sequenzierung (siehe Materialtabelle). Alternativ lokal führen Sie mRNA Bereicherung und Bibliothek Vorbereitung aus, und senden Sie die Bibliothek für die Sequenzierung.
  2. Pool acht oder mehr gemultiplexten Proben und Sequenz in eine Spur der nächsten Generation Sequenzer.
  3. Laden Sie die FASTQ-Datei mit allen von der Sequenz liest und der entsprechende Index liest. Außerdem laden Sie die Textdatei mit den Multiplex-Barcodes.
    Hinweis: Der Index liest können in einer separaten Datei FASTQ vorhanden sein. Legen Sie alle diese Dateien in einem Verzeichnis.
  4. Legen Sie das Shell-Skript zur Verfügung gestellt hier, "fastq_pipeline.sh" im gleichen Verzeichnis. Bearbeiten Sie das Skript als angemessen für das Experiment und die Computer-Verzeichnisse.
    Hinweis: dieses Skript enthält umfangreiche Anmerkungen die Schritte erklären. In Kürze die Skript-Qualität trimmt die liest, ordnet der liest das Genom und erzeugt eine tabulatorgetrennte Datei, enthält die Anzahl der Lesevorgänge pro gen für jede Probe.
  5. Die FASTQ Dateien und raw lesen Sie Zähldaten auf NCBIs Gene Expression Omnibus vor Veröffentlichung 27einzahlen. Befolgen Sie die Anweisungen für "Submitting Hochdurchsatz-Sequenzdaten, GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
  6. Importieren Sie die gelesenen Daten in R statistische Umwelt und führen Sie statistische Analyse mit dem R-Skript zur Verfügung gestellt hier, "Time_course_script. R". Bearbeiten Sie das Skript als angemessen für das Experiment und die Computer-Verzeichnisse.
    Hinweis: Dieses Skript enthält umfangreiche Anmerkungen die Schritte erklären. Kurz gesagt, dieses Skript importiert die gelesenen Daten, normalisiert das liest, Gene, die im Laufe der Zeit erheblich ändern, führt PCA Analyse und Grafiken die Expression von ausgewählten Genen identifiziert.

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Representative Results

Die Hypoxie zeitlichen Verlauf und RNA-Seq-Analyse wurden unabhängig dreimal durchgeführt. Um die Reproduzierbarkeit der drei Wiederholungen zu untersuchen, wurde Genexpressionsdaten für alle Gene mit Principal Komponente Analysis (PCA) analysiert. Abbildung 2 zeigt, wie die Proben über die ersten beiden Hauptkomponenten verändern die 58,9 % der Variabilität darstellen. Diese Analyse ergab, dass jeder zeitlichen Verlauf ähnliche Veränderungen zeigt (wie durch die ähnliche Form der jede Kurve dargestellt). Darüber hinaus wurden die letzten beiden Wiederholungen mehr ähnlich zueinander, als die erste Replikation. Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass die letzten beiden Wiederholungen durchgeführt wurden, von der gleichen Person mit der gleichen Chargen von Medienkomponenten, während der ersten Replikation von einer anderen Person und Chargen durchgeführt wurde. Dieser Befund unterstreicht, dass die Konsistenz von Technik und Chemikalien ist ein wichtiger Faktor bei der Beschaffung von hohen Reproduzierbarkeit. Zu guter Letzt eignet sich PCA Analyse bei der Beurteilung, ob die gewählten Zeitpunkten erfassen die wichtigsten Änderungen, die im Laufe der Zeit auftreten. Die Konzentration auf eine Replicate Kurve, gibt es größere Entfernungen zwischen den früheren Beispielen zeigt große Veränderungen in der Genexpression und kleinere Abstände zwischen den späteren Beispielen zeigt kleinere Änderungen und möglicherweise das Ende der Umstellung von aerobic hypoxische Genexpression.

Als nächstes wurde das DESeq2-Paket R25 verwendet, um Gene zeigen eine signifikante Veränderung im Vergleich zum Zeitpunkt 0 (p-Werte in ergänzenden Tabelle1) zu identifizieren. Dieser bedeutende Gene, 607 verändert mehr als 4-Fach (Falte Änderungen der ergänzenden Tabelle1). Die Expressionsmuster dieser Gene wurden gruppiert, so dass ebenso regulierten Gene wurden zusammengefasst und dann in eine Heatmap (Abbildung 3) angezeigt. Diese Zahl zeigt, dass Veränderungen der ganzen Wiederholungen sehr reproduzierbar sind. Darüber hinaus weisen Gene Variable Kinetik mit zu- und Abnahmen im Ausdruck. Viele Gene weisen eine Erhöhung der Gipfel oder bei 30 min, wahrscheinlich durch eine transiente Spannung Antwort 13verringern.

Abbildung 4 zeigt den Ausdruck von zwei herunterreguliert und zwei hochreguliert Gene zuvor festgestellt, dass O2-regulierten. Die Gene ändern Ausdruck reproduzierbar, mit ähnlichen Kurven auf den biologischen Wiederholungen. Das Gen mit der geringsten Variabilität zwischen Wiederholungen ist DAN1, mit sich überschneidenden Kurven. Das Gen mit der Variabilität ist CYC1, vielleicht weil Expression dieses Gens natürlich variabel ist. Diese Abbildung verdeutlicht auch, dass große Falte Änderungen (bis 1,024-fold) erkannt wurden.

Die zellulären Prozesse angereichert in den 607 O2identifizieren-regulierten Genen, GO Begriff Bereicherung wurde durchgeführt (ergänzende Tabelle 2). Wie erwartet, viele O2-regulierte Gene spielen eine Rolle bei Zellatmung, andere Aspekte des Stoffwechsels, und ribosomale Prozesse 13.

Beispiel # Zeit in Hypoxie mL-Kultur + mL YPD
2 5 min 20 mL + 0 mL
3 10 min 20 mL + 0 mL
4 30 min 20 mL + 0 mL
5 60 min. 10 mL + 10 mL
6 120 min 10 mL + 10 mL
7 180 min 5 mL + 15 mL
8 240 min. 4 mL + 16 mL

Tabelle 1. Zelle Verdünnungen durchgeführt zum Zeitpunkt 0.
Diese Verdünnungen wurden experimentell ermittelt in Mid Log Konzentration (1-2 × 107 Zellen/mL) Ergebnis nach der angegebenen Zeit N2.

Zusätzliche Tabelle 1. Ausdruck und statistische Daten für alle Gene.
Diese Tabelle enthält die systematische Namen, p-Werte für sieben DESeq2-Tests (z.B.5 min vs. 0 min, 10 min vs. 0 min usw.), das Minimum eingestellt, p-Wert und log2 maximale Falte-Änderung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Zusätzliche Tabelle 2. GEHEN langfristige Anreicherung Ergebnisse.
Diese Tabelle zeigt GO Prozesse, ihre Vertretung in der Gruppe von 607 O2-regulierte Gene und ihre Vertretung im Genom. Dann wurde der Chi-Quadrat-Test verwendet, um GO Bedingungen zu identifizieren, die deutlich über - oder unter-in der Gruppe von 607 Gene vertreten waren. Anreicherung Analyse erfolgte mittels GO Slim Mapper bei SGD 28gehen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Figure 1
Abbildung 1. Hypoxie-Set-up für Einnahme Zeitpunkten ohne Unterbrechung der Gaszufuhr zu späteren Zeitpunkten.
Es ist wichtig, dass alle Verbindungen sicher, bleiben, wie im Protokoll beschrieben. Notieren Sie den Speicherort der kurzen (9 cm) und lange (17 cm) Glasröhren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2. Principal Component Analysis (PCA) zeigt die Beziehung zwischen den drei biologische repliziert.
Jede Kurve hat 0 min bis 240 min Proben in Ordnung. Die log2 normalisiert Genexpression für alle Gene wurde in der PCA verwendet. PC1 entfallen auf 34,7 % der Gesamtvarianz und 24,2 % entfallen auf PC2. Die schwarze Linie ist die erste Replikation, die rote Linie ist die zweite und die blaue Linie ist die dritte. Beachten Sie, dass die Pfeile verwendet werden, um darauf hinweisen das 240 min. Zeit-Punkt in verschiedenen Proben. Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde in R über die Prcomp Funktion (Q-Modus oder Singulärwert Zersetzung) auf der log2-transformierte Matrix enthält Gene in Spalten und Zeitpunkten in Zeilen 29durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Heatmap zeigt Ausdruck der 607 Gene identifiziert als O2-regulierten.
Diese Gene wurden in mindestens einer der DESeq2 Tests signifikant und Ausdruck von mehr als 4-fach geändert. Gezeigt ist Log2(relativer Ausdruck). Rot = erhöhte Expression. Grün = verminderte Expression. Intensität der Farbe ist proportional zum Grad der Veränderung. Vor dem Erstellen der Heatmap im TreeView 30, Genexpression wurde k-Means Cluster mit k = 10 Cluster 3.0 31. Die Taste unter der Heatmap zeigt die Waage. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Relative mRNA-Niveaus von vier Genen im Laufe der Zeit in den drei repliziert.
Die schwarze Linie ist die erste Replikation, die rote Linie ist die zweite und die blaue Linie ist die dritte. Gemeinsame/systematische gen Namen sind CYC1/YJR048W, ERG5/YMR015Cund DAN1/YJR150C NCE103/YNL036W. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zusätzliche Datei 1. fastq_pipeline.sh
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Zusätzliche Datei 2. Time_course_script. R
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Discussion

In dieser Studie wurde die mRNA-Niveaus für alle Gene während Hypoxie in der Hefe S. Cerevisiaegemessen. Ziel war es, wie die globalen Veränderungen der Genexpression durch Wachstum in einer kontrollierten Umgebung in der Nähe von anoxischen analysieren. Mehrere Maßnahmen wurden ergriffen, um sicherzustellen, dass die hier beschriebene Methode sorgfältig kontrolliert und reproduzierbar war. Erstens Zellen einer genau definierten hypoxischen Umgebung ausgesetzt waren: 99,999 % N2 in rich-Media (YPD). Andere Studien von Hypoxie haben das Fläschchen oder den Schlauch 32Luft abgesperrt, verwendet der Hypoxie-mimetischen Kobalt-Chlorid 33oder Hypoxie-induzierende anaeroben Kammern oder Taschen 34beschäftigt. Jede dieser Methoden kann in unterschiedlichen Hypoxie oder andere unbeabsichtigten Veränderungen der Umwelt führen. Es wäre sinnvoll, Genexpression während systematisch das Gasgemisch (z.B.90 % N2 und 10 % O2), Variation, wie Hefe in freier Wildbahn werden voraussichtlich weniger schweren hypoxische Bedingungen erleben zu studieren. Zweitens wurden Ergosterin und ungesättigten Fettsäuren (z.B.Tween 80) nicht die Nährmedien hinzugefügt da sie Genexpression beeinflussen, wie in der Einleitung erläutert. Drittens, empirisch-bestimmt zur Minimierung von Veränderungen der Genexpression durch verschiedene Phasen von Wachstum, verursacht, dass Verdünnungen durchgeführt wurden, so dass wenn eine Kultur einen Zeitpunkt erreicht, es in der Mitte des Log-Phase des Wachstums (~ 1-2 x 107 Zellen/mL war). Vierte, der schnelle Filterung und Einfrieren (~ 15 s) von Zellen, die von Hypoxie entfernt wurden, ist kritisch, da Veränderungen der Genexpression in auftreten können < 5 min der Exposition gegenüber O2, wie tritt auf, wenn Zellen durch Zentrifugation (Daten nicht gezeigt) gesammelt werden. Die Zeit, die Zellen O2 ausgesetzt sind konnte durch das Wachstum und Ernte der Zellen in einem anoxischen Haube oder Kammer reduziert werden. Fünftens, wurde eine entsprechende Belastung für diese Studie ausgewählt; um mit anderen genomischen Studien zu sein, war der gemeinsame S288C Lab Stamm Hintergrund tätig. Jedoch die S288C Stämme enthält einen mutierten hap1 Allel und somit war reparierte 11. Dies erlaubt die Untersuchung von Genen wie CYC1 , die O2 Ebenen über die Hap1 Transkription Faktor 11entsprechen.

Zeitpunkten wurden ausgewählt, weil sie Veränderungen der großen Genexpression in früheren Experimenten Hypoxie ausgestellt. Die hier dargestellten Ergebnisse können zukünftige Experimente informieren. Beispielsweise wäre es hilfreich, eine höhere Auflösung von Zeitpunkten während der Intervalle zu verwenden, die zeigen, große Änderungen (z.B. 0 bis 30 min. Hypoxie), die unterschiedliche Kinetik feiner zu erfassen. Darüber hinaus können späteren Zeitpunkten nach Ablaufen der Frist hier untersucht (d.h. 4 h der Hypoxie) weitere Ausdruck Änderungen anzuzeigen.

RNA-Seq wurde verwendet, um die mRNA-Niveaus zu messen, weil seine Reproduzierbarkeit und breiten Dynamikbereich Messung große Falte Änderungen 18,35ermöglichen. RNA wurde durch mechanische Störungen der Zellen mit kräftig geschüttelt Perlen extrahiert und gereinigt auf einer Säule. Wie heißen Phenol 36könnte andere RNA-Reinigungsverfahren verwendet werden. Im Idealfall werden die RNA-Konzentration im Bereich von 200 ng/µL - 1000 ng/µL da die RNA-Konzentration zu 100 ng/µL reverse Transkription und Bibliothek Vorbereitung verdünnt wird. Die RNA-Konzentration sollte mit einem Fluorometer und RNA-spezifischen Farbstoff gemessen werden; ein UV-Spektralphotometer ist begrenzt, da es die Gesamtkonzentration von Nukleinsäuren, bestehend aus RNA und DNA-Maßnahmen. Die Qualität der RNA wird durch Gelelektrophorese bestimmt; ribosomaler RNA Bands sollte klar definierte auf das Gel und Verschmieren RNA-Abbau gibt. Hier mRNA Transkripte wurden bereichert, aber es gibt diverse Methoden zur Isolierung von unterschiedlichen RNA-Typen 20 , die auch in der Antwort wichtig sein kann.

Sparen Sie Ressourcen, zwischen 8 und 12 Proben wurden gemultiplext und sequenziert zusammen in einer Spur, was einem Durchschnitt von mindestens 693 Lesevorgänge pro gen für jede Probe, ausreichen, um die Anzahl der Lesevorgänge pro gen reproduzierbar zu bestimmen. In der Tat könnte mehr als 12 Proben in einer Spur, was wahrscheinlich ausreichend Probenahme von die meisten Gene gemultiplext werden. Um zu berechnen, dass im Durchschnitt pro gen liest, teilte die Anzahl der Gene, die zur HTSeq (in dieser Studie, 7140) die Gesamtzahl der Lesevorgänge, die Gene (in der HTSeq-Ausgabedatei) zugeordnet. Wenn Sie die maximale Anzahl von Proben schätzen, die in einer Spur gemultiplext werden kann, betrachten Gene von Interesse, die den niedrigsten Ausdruck aufweisen (d.h.niedrigste normalisiert zählt), mit Daten aus diesem und anderen RNA-Seq-Studien. Wenn der normalisierten lesen Sie zählt für ein Gen deutlich unterschiedlich repliziert wird, dann die Anzahl der Lesevorgänge möglicherweise zu niedrig, was darauf hindeutet, dass weniger Proben pro Sequenzierung Bahn gemultiplext werden sollte.

Next Generation Sequencing generiert FASTQ Dateien liest und andere Informationen enthalten. Wenn Multiplexen durchgeführt wurde, können ein Barcode und eine zusätzliche FASTQ-Datei generiert werden. Diese Dateien können für lokale Analyse, wie in diesem Protokoll heruntergeladen werden. Alternativ gibt es mehrere Online-Next-Gen-Sequenz-Analyse-Tools für diejenigen, die nicht vertraut mit Befehlszeilen-Funktionen oder R. In diesem Zusammenhang empfehlen wir Galaxy (https://usegalaxy.org/) 37 und GenomeSpace (http://www.genomespace.org/). In diesem Protokoll werden zwei Skripte, die von den Autoren geschrieben wurden für FASTQ Verarbeitung und Ausdruck Analyse verwendet. Die Skripte sind gut kommentierten und können für verschiedene Versuchsdesigns und Computer-Setups bearbeitet werden. Darüber hinaus bieten die beiden Skripte und die "Materialien" Tabelle Websites zum Download die Tools in dieser Skripte verwendet. Das erste Skript, "fastq_pipeline.sh", ist ein Shell-Skript auf der Kommandozeile in einem UNIX/Linux-Terminal ausgeführt werden. Dieses Skript de-Multiplexen die ursprüngliche FASTQ-Datei mit allen der liest aus einer Spur Sequencer, wodurch eine FASTQ-Datei für jede Probe in dieser Spur vorhanden gewonnen. Als nächstes sind die liest in jeder FASTQ Datei Qualität getrimmt mit Standard Einstellungen 21Trimmomatic. Der getrimmte liest dann das S. Cerevisiae S288C Bezug Genom (SGD R64-1-1_20110203) zugeordnet sind mit TopHat2 mit Standard Einstellungen 22. Das Skript verwendet schließlich HTSeq die Anzahl der Lesevorgänge zu bestimmen, die jedes annotierte Feature 19zugeordnet.

Das zweite Skript "Time_course_script. R", ist auch von den Autoren geschrieben worden und läuft innerhalb von R statistische Umgebung 24. Das Skript sind zunächst Einfuhren in die gelesenen Zähldaten von HTSeq generiert. Jede Probe wird zu einem Zeitpunkt angenommen und ist somit im Vergleich zu anderen Zeitpunkten organisiert. Die rohen lesen Sie Grafen sind dann in das R-Paket, DESeq2 25, importiert, um Gene zu identifizieren, die jederzeit von den Zeitpunkten relativ zur ersten (d.h., aerobic, Zeit 0) differentiell exprimiert werden. Aufgrund seiner Flexibilität kann DESeq2 verwendet werden, andere statistische Tests, z. B. ob Ausdruck als Funktion der Zeit 13Änderungen durchführen. Alternativ lesen andere Tools beschäftigt parametrische und nicht-parametrische Statistik für RNA-Seq Zähldaten verwendeten 20sein könnte. Das Skript dann normalisiert die lesen Sie Grafen zu steuern für den Grad der Sequenzierung von jeder Probe und log2 verwandelt die Grafen. Diese verarbeiteten liest dienen zur PCA Analyse, zur Ermittlung der maximale Falte-Veränderung für jedes Gen, und der Ausdruck Graphen in Abbildung 4zu erstellen.

Eine wichtige Frage ist wie man Statistiken, Gene zu identifizieren, die deutlich auf Hypoxie reagieren zu beschäftigen. Mindestens drei biologische Wiederholungen von den zeitlichen Verlauf sind notwendig, um die natürliche Variabilität jedes Gen berechnen und somit bestimmen, Gene, die auf Hypoxie deutlich mehr, als durch Zufall erwartet reagieren. Alternativ ist es möglich, erfolgreich Gene zu identifizieren, die im Laufe der Zeit ohne biologische Wiederholungen 13,25,38,39reagieren. Der größte Nachteil dieser Methoden ist, dass sie nicht der biologische Variabilität jedes gen berücksichtigt werden. Jedoch könnten RNA-Seq Wiederholungen nicht durchgeführt werden, Veränderungen der einzelnen Genexpression durch Ausführen überprüft werden, dass RT-qPCR mit mehreren biologischen 13repliziert.

Es gibt zwei Hauptvorteile für die Bewertung mehrere Zeitpunkte für eine Antwort. Zunächst, wie bereits erwähnt (vor allem in Abbildung 2), ein zeitlichen Verlauf identifiziert die Intervalle präsentiert große Veränderungen, der darüber informiert, ob zusätzliche Zeit erforderlich, um die Auflösung der Kinetik zu verbessern oder um spätere Ereignisse zu beobachten sind die Antwort. Zweitens ermöglicht ein zeitlichen Verlauf der Differenzierung der jedes Gen Ausdruck Kinetik. Dies hilft bei der Ermittlung der einzigartigen Signalwege, die zu bestimmten Zeiten während der Reaktion handeln und gibt Einblick in das Timing der Einleitung und Beendigung der Signalisierung. Im einzelnen führte das clustering von Genen durch Ausdrucksmuster, die hier durchgeführt wurde Sätze von Co regulierten Gene. Die Promotoren eines gen-Sets können teilen eine Transkription Faktor Bindungsstelle, darauf hindeutet, dass der Transkriptionsfaktor aktiviert wird, wenn die Gene Ausdruck ändern.

Wenn eine zelluläre Reaktion zu studieren, eignet die beobachtete Variabilität sich aufgrund der Stimulus (z.B. Hypoxie) und nicht zu anderen experimentellen Variablen. Jedoch, wie in Abbildung 2dargestellt, der einzelnen Forscher und/oder die Chargen der einzelnen Medien wichtige Beiträge für die Variabilität in der Genexpression. Daher sollten diese Parameter berücksichtigt werden, um hohe Reproduzierbarkeit und minimal experimentellen Variabilität zu erreichen. So wenig Zeit wie möglich sollte jeder Replikation zu trennen, weil experimentelle Variablen eher sind zu ändern, wie die Zeit vergeht.

Zusammenfassend kann diese Methode verwendet werden, zu genau zu überwachen und genomweite Änderungen in mRNA Niveaus (oder andere Ereignisse wie Histon-Modifikationen oder Protein-Ebene) während einer Hypoxie zeitlichen Verlauf. Die Methode kann für andere Organismen, besonders mikrobielle Spezies angepasst werden, die in der flüssigen Kultur angebaut werden können. Solche Analysen genomweite Zeitverlauf ergänzen Studium der Zellmorphologie, Proteinaktivität und Stoffwechsel. Zusammen, werden diese Daten zu einem reicheren Verständnis eine zelluläre Reaktion führen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken der Lewis-Sigler-Institut für Integrative Genomics Sequenzierung Core Facility an der Princeton University für technische Beratung und RNA Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse der Rowan University und NIH NIGMS R15GM113187, M.J.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Enclosed dry incubator Thermo Scientific MaxQ 4000 Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.
Micro-analysis Filter Holder Millipore XX1002530 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask
Strong vacuum Edwards E-LAB 2 The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.
1,000 mL flask To act as vacuum trap.
~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in Tygon 38TT Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.
High-pressure N2 gas tank 99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller
Autoclaved 500 mL flask Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.
Autoclaved 250 mL flasks Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.
Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter) Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.
Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.
~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm Tygon E-3603 One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.
Sterile filter discs Millipore HAWP02500 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point
Sterile dH2O (~100 mL)
1 mL cuvettes For measuring OD600 (i.e., cell concentration)
50 mL sterile centrifuge tubes One for each time point
Clean and sterile tweezers
liquid nitrogen For freezing cells
acid-washed beads Sigma G8772 Keep at 4 °C for lysing cells
Qiagen RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA column purification
Qiagen RLT buffer Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C.
2 mL collection tubes Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPE Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1 Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I stock and working solutions Qiagen 79254 The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen.
Buffer RDD Qiagen included in the Qiagen DNase Kit
Ice cold 2 mL screw-cap tubes For lysing cells during RNA extraction
bead mill homogenizer Biospec Mini-Beadbeater-24 112011 Keep in cold room
Bacto Peptone BD DF0118 for liquid YPD media
Bacto Yeast Extract BD DF0886 for liquid YPD media
glucose Fisher D16 for liquid YPD media
Qubit assay tubes Thermo Fisher Q32856 for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit Thermo Fisher Q32853 for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM RNA Assay Kit Thermo Fisher Q32855 for measuring nucleic acid concentration
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216 for measuring nucleic acid concentration
Commercial electrophoresis system Agilent Bioanalyzer 2100 for measuring nucleic acid quality
Next-generation sequencer Illumina HiSeq 2500 for sequencing libraries
automated liquid handling system Wafergen Apollo 324 for creating sequencing libraries
PrepX PolyA mRNA Isolation Kit Wafergen 400047 for isolating mRNA from total RNA
PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit Wafergen 400039 for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA
Barcode Splitter https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, which includes the gzip command http://www.htslib.org/download/
Trimmomatic http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (installed before TopHat) http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHat https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeq http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (installed before R Studio) https://cran.rstudio.com
R Studio (free version) https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Messung der mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der Hefe <em>S. Cerevisiae</em> hypoxischen Antwort
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