Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Måle mRNA nivåer Over tid under gjær S. cerevisiae Hypoxic svaret

Published: August 10, 2017 doi: 10.3791/56226
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Department of Molecular Biology, Rowan School of Osteopathic Medicine, 2Department of Biological Sciences, Rowan University

Summary

Her presenterer vi en protokollen ved hjelp av RNA-seq overvåke mRNA nivåer over tid under hypoxic svaret S. cerevisiae celler. Denne metoden kan tilpasses til å analysere genuttrykk under en cellulær respons.

Abstract

Omfattende endringer i genuttrykk megle vanligvis en stor del av en cellulær respons. Hver genet kan endre uttrykk med unike kinetics genet er regulert av bestemt tidspunktet for en av mange stimuli, signalnettverk trasé eller sekundære effekter. For å fange opp hele genet ble uttrykk svar hypoksi i gjær S. cerevisiae, RNA-seq analyse brukt til å overvåke mRNA nivåene av alle gener til bestemte tider etter eksponering for hypoksi. Hypoksi ble etablert av voksende celler i ~ 100% N2 gass. Viktigere, i motsetning til andre hypoxic studier, ble ergosterol og umettede fettsyrer ikke lagt til media fordi disse metabolitter påvirker genuttrykk. Tidspunkt ble valgt i området 0 - 4 h etter hypoksi fordi denne perioden fanger opp de store endringene i genuttrykk. På hvert punkt, midt Logg hypoxic celler var raskt filtrert og frosset, begrense eksponering for O2 og samtidig endringer i genuttrykk. Totalt RNA ble Hentet fra celler og brukes til å berike for mRNA, som ble deretter konvertert til cDNA. Fra denne cDNA, multiplex biblioteker ble opprettet og åtte eller mer ble sekvensert i ett kjørefelt av en neste generasjons sequencer. En post sekvensering rørledning er beskrevet, som inkluderer kvalitet base trimming, lese kartlegging og bestemme antall leser per genet. DESeq2 i R statistiske miljøet ble brukt til å identifisere tilblivelse det endres vesentlig på ett av punktene hypoxic tid. Analyse av tre biologiske replikat viste høy reproduserbarhet, gener av ulike kinetics og mange forventet O2-regulert gener. Disse metodene kan brukes til å studere hvordan cellene av ulike organismer reagerer hypoksi over tid og tilpasset for å studere genuttrykk under andre cellulære svar.

Introduction

Mange organismer svare hypoksi eller lav O2, ved å endre gene expression 1,2,3. Dette svaret hjelper celler håndtere mangelen på et substrat kritisk for aerobic åndedrett og flere biosyntetiske reaksjoner, men også med en skiftende redoks staten 4. Flere microarray studier utført i S. cerevisiae viser at mRNA nivåene av hundrevis av gener endre svar hypoksi 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. nylig RNA-seq ble brukt til å karakterisere gene expression endringer over tid i hypoksi 13. Her, eksperimentelle detaljene blir presentert og drøftet.

Hypoksi kan oppnås på ulike måter, hver produserer et annet nivå av O2. Her, hypoksi ble etablert av kontinuerlig flyt ultra høy renhetsgrad N2 i flasker, som senker [O2] oppløst umiddelbart med reproduserbar kinetics 10. Det er mulig at det er noen O2 molekyler tilstede som bidrar til metabolisme og gene expression men dette miljøet anses svært nær anaerob. I fravær av O2, gjærceller ikke biosynthesize måltema, ergosterol og umettede fettsyrer 4,12,14. Tidligere studier har derfor tatt disse metabolitter som vokser gjær uten oksygen 5,10,15. Men mange hypoxic svar er formidlet av utarming av disse metabolitter og dermed fylle dem reverserer hypoxic gene expression svar 12,16. For å etterligne naturlig hypoksi, ble disse metabolitter ikke lagt til media. På kort tid at celler ble utsatt for hypoksi uten tilstedeværelse av disse viktige metabolitter, var det ingen merkbar økning i celledød (data ikke vist) eller en langvarig stress respons 13.

Svaret er også avhengig av belastningen og dens genotype. Spesielt viktig er alleler av kjente regulatorer hypoxic svar 2. S288C belastning bakgrunnen er svært ønskelig slik at resultatene kan sammenlignes med andre genomisk studier utført med denne belastningen. S288C inneholder imidlertid en delvis tap av funksjon allelet av i HAP1 gen 17, en transcriptional regulator som er kritiske for hypoxic respons. Denne allelet ble reparert i S288C bruker en wildtype Kopier fra Σ1278b press bakgrunn 11.

Genuttrykk er svært avhengig av mobilnettet miljø. Dermed når du utfører genomet hele mRNA analyse, er det viktig å opprettholde et konstant miljø mens varierende en annen parameter som tid, stimulans eller genotype. For å oppnå svært reproduserbar resultater, kan du vurdere disse tre metodene for studier og alle dens biologiske eller teknisk gjentak. Først skal den samme experimenter(s) utføre studien, siden tekniske praksis kan variere mellom forskere. Andre burde samme gruppe av ingredienser bli brukt i vekst medier for hver gruppe har en litt annen sammensetning som kan påvirke genuttrykk. Tredje, for å minimere celle syklus effekter, hvert punkt bør bestå av asynkrone celler i midten av Logg fasen av vekst (1-2 x 107 celler/mL).

Når karakterisere komplekse svar som gene expression svaret hypoksi, er en gang løpet fordelaktig for å bestemme the kinetics av ulike arrangementer. Bestemt tidspunkt bør velges som vil fange de store endringene av svaret. I denne studien ble tidspunkt mellom 0 og 4 h observert, fordi siste eksperimenter avdekket omfattende endringer i genuttrykk under denne perioden 13.

For å måle globale genuttrykk, var RNA-seq brukt 18,19. Denne metoden bruker neste generasjons sekvensering for å bestemme den relative overfloden av hver genet transkripsjon. Sammenlignet DNA microarray analyse, utstillinger RNA-seq høyere følsomhet (å oppdage mindre rikelig transkripsjoner), større dynamisk område (for å måle større fold endringer) og overlegen reproduserbarhet (å nøyaktig følge genuttrykk over tid). Mest mobilnettet RNA er vanligvis ribosomal RNA så mange metoder har blitt utviklet for å berike for bestemte RNA arter 20. Her, poly-T perler ble brukt til å rense poly-A-inneholder mRNA transkripsjoner, skjønt de ulike kommersielt - tilgjengelig rRNA uttømming kits kan også være effektiv i mRNA berikelse.

Her, var S. cerevisiae gene expression svaret hypoksi preget. Cellene ble utsatt for hypoksi og deretter samplet på åtte tidspunkt (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 og 240 min). Bekrefte reproduserbarhet og identifisere statistisk endret transkripsjoner, ble tre biologiske gjentak utført. RNA ble hentet av mekanisk avbrudd og kolonnen rensing, og deretter behandlet for RNA-seq analyse. Etter sekvensering rørledningen er beskrevet og programmering skript er angitt som tillater nøyaktig replikering av analysene utført. Spesielt ble Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, R statistiske miljø 24og DESeq2 pakken 25 brukt til å behandle RNA-seq data og identifisere 607 gener som endres vesentlig i løpet hypoksi. Viktigste komponenten analyse (PCA) og genuttrykk av replikat angitt reproduserbarhet av teknikken. Klynger og heatmaps avdekket omfattende uttrykk kinetikk, mens gene ontologi (gå) analyse viste at mange mobilnettet prosesser som aerobic åndedrett, er beriket i settet med oksygen regulert gener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. inducing hypoksi

  1. En dag eller mer før hypoksi time course: Forbered inkubator, filtrering system, vakuum, gass tank, flasker, stoppers, glass rør og rør, som Materialer tabell.
  2. Plass N2 tank, inkubator, vakuum og filtrering system i nærheten, aktivere rask behandling av celler.
  3. Forberede sterilt flytende YPD medier (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% glukose) ved å blande komponenter i en glassflaske og autoklavering.
  4. Plan layout av flasker i inkubator.
    Merk: Fra N2 tank, første kolbe vil være en vannlås, andre kolbe vil være det siste punktet, tredje kolbe vil være det nest siste punktet og så videre til siste flasken som en siste vannlås. Figur 1 viser rekkefølgen og tilkoblinger mellom flasker.
  5. Dagen før time course, vaksinere gjær kolonien i en kultur av 5 mL væske YPD i et sterilt reagensrør. Spesielt, plukke opp en full koloni fra en plate med en sterile applicator pinne. Plasser pinne i den flytende YPD og riste pinne til de fleste cellene i suspensjon.
  6. Rotere rørene på 30 ° C over natten (~ 16 h).
    Merk: Etter 16 h, wildtype celler vil oppnå metning (~ 2 x 108 celler/mL), angitt av en veldig overskyet kultur. Andre stammer kan ta lengre tid å nå metning og bør bli testet ved å måle celle konsentrasjon med et spektrofotometer, som angitt i trinn 1.9.4.
  7. Ved time course, etter 16 h ved fortynne mettet kultur Overnatting 1:50 ved hjelp av en 5 mL Pipetter plassere 4 mL kultur i 196 mL av flytende YPD i et sterilt 500 mL kolbe. Vokse med skjelvende ~ 200 RPM 4 h på 30 ° C.
    Merk: Etter 4 h, en wildtype kultur vil nå en midt Logg konsentrasjon av ~ 1-2 x 107 celler/mL.
  8. Under 4 h incubation, etiketten flasker (for hypoksi og vann feller) og 50 mL samling rør. Hvis inkubator i trinn 1.7 ovenfor ikke brukes for hypoksi tid kurset, slå på andre inkubator og satt til 30 ° C.
  9. Like før utsette celler til hypoksi:
    1. Legge til ~ 50 mL vann i to av de sterile 250 mL flasker som vil tjene som vann fellene.
    2. Fyll 1/3 av en is bøtte med flytende nitrogen og senke en polystyrenskum rack å holde 50 mL sentrifuge rør.
    3. Angi filtersystemet for innsamling av celler. Legge til et sterilt filter plate på bunnen enheten filtreringssystem ved hjelp av sterile pinsett, pass på bare berører kantene på filteret platen. Plasser filteret øverste enheten på filter bunnen enhet og sikker festing følger med systemet. Kontroller at bunn og topp enhetene er justert slik at det er en tett forsegling og uten lekkasje.
    4. Mål celle konsentrasjonen med et spektrofotometer. Fortynne cellene slik at de kan måles i lineær rekke spektrofotometer-OD600 mellom ~0.2 - 0.6, avhengig av spektrofotometeret.
      Merk: Én OD600 enhet er ~ 3 x 107 celler/mL, avhengig av cellen morfologi og spektrofotometeret. Det forventes en konsentrasjon av ~ 1-2 x 107 celler/mL, tilsvarer OD600 av ~0.33 - 0,66.
    5. Raskt få 0 eksemplet.
      1. Koble filtersystem til en sterk (~ 10 mbar) vakuum via vakuum rør og en 1000 mL kolbe felle. Slå på vakuum. Hell kultur (vanligvis ~ 20 mL) i den øverste enheten og vente på væske trekkes gjennom filteret (~ 10 s, avhengig av styrken vakuum).
      2. Nøye fjerne filteret platen med ren pinsett og plasser i en 50 mL sentrifuge rør. Umiddelbart plassere sentrifuge røret i stativet senkes i flytende nitrogen. Viktigere, ikke pre chill rør før du setter filteret som rør vil eksplodere.
      3. Etter > 30 s, sted røret i-80 ° C fryser for senere RNA utvinning. Etter hver filtrering, ren og montere filtersystem. Skyll systemet ved å trekke vann for 10 s uten en filter-plate. Til slutt, tørke tørr systemet med et papirhåndkle.
    6. Fortynne 4 h kulturen i ulike flasker for de ulike tidspunkt, slik at hver kolbe når midt Logg konsentrasjon (~ 1-2 x 107 celler/mL) på angitt tidspunktet av hypoksi.
      Merk: Tabell 1 viser fortynninger som ble brukt til vill-type S288C HAP1+ haploid belastningen. Det anbefales å teste hver stamme i disse hypoxic oppdrettsforholdene og justere fortynninger tilsvarende.
    7. Når celler og media er lagt til flasker, erstatte aluminiumsfolie dekker kolbe åpning med en propp som inneholder to glass-rør som er satt inn.
    8. Plass flasker i inkubator i oppsettet bestemt tidligere.
    9. Sikkert koble slangen som vist i figur 1.
    10. Kontroller at alle stoppers tett skyves inn i flasken åpningene.
  10. Åpne regulatorventil gangen 0. Deretter setter du gjennomstrømningsmåler til 3 L/min.
    Merk: Boblende vil bli observert i begge vann flasker, som angir riktig gasstrømmen. Hvis dette ikke er tilfelle, kontroller at alle propper er stramt og rør er ordentlig koblet til.
  11. Lukk inkubator og angi risting hastigheten til ~ 200 rpm. Start en tidtaker.
  12. Før hvert tidspunkt, angi filtersystem som beskriver ovenfor i trinn 1.9.3.
  13. På hvert tidspunkt (f.eks, 5 min, 10 min, etc.), har du to personer raskt behandle cellene som følger:
    1. Første person: riktig kolbe fra abonnenten og ta ut en plugg (med glass rør festet).
      Merk: Dette vil ikke bryte strømmen av N2 til noen av de gjenværende kultur flasker, men vil midlertidig bryte strømmen til siste vann fellen.
    2. Andre person: Pipetter 1 mL av kultur og inn søppel. Koble slangen kultur kolbe som er nå på slutten av linjen til siste vannlås (en tube og en stopper vil bli fjernet i prosessen). Deretter måle celle konsentrasjon i cuvette, som beskrevet ovenfor i trinn 1.9.4.
    3. Første person: hell resten av kulturen i vakuum filtreringssystem, og utfør deretter filtrering og frysing som beskrevet ovenfor i trinn 1.9.5.
  14. Når ferdig med alle punktene som tid, slå av N2 gassen. Lukke regulator og venter presset til å løslate, og slå gjennomstrømningsmåler. Endelig demontere systemet og rengjør alle materialer med vann og deretter 70% etanol.

2. RNA utvinning

  1. Forberede RLT buffer RNA kolonnen rensing, som beskrevet i Materialer tabell.
  2. Forberede en fungerende løsning av DNase ved å legge 10 µL av DNase lager løsningen til 70 µL bufferen RDD per prøve (se Materialer tabell).
  3. Fjern 50 mL rør som inneholder filtre og celler fra-80 ° C fryseren og plasser på is å tine (~ 15 min). Utfør følgende trinn med rør på is.
  4. Etikett 2 mL skrukork rør og plassere dem på is, en tube for hvert utvalg. Legge til ~0.6 mL acid vasket perler i hver retning, med en 1,5 mL microcentrifuge tube scoop og måle perler.
  5. Legge til 0,6 mL kaldt RLT bufferen til 50 mL rør.
  6. Pipetter opp og ned til å fjerne celler fra filteret og låse løsning. Unngå å la filteret forbli i løsningen som filteret vil suge opp løsningen. Fjerne alle løsning absorbert inn filteret ved hjelp av Pipetter spissen for å presse filteret mot veggen av røret.
  7. Overføre alle av væsken fra 50 mL tube til skruen-cap rør som inneholder perler.
  8. Plasser skrukork rør i en perle mill homogenizer og kjøre i en min.
    Umiddelbart plassere rør på isen i tre minutter. Igjen, plassere rør inn i homogenizer og kjøre i en min.
  9. Ta ut rør fra homogenizer og sted på is 5 min. Perlene vil bosette seg til bunnen av rør.
  10. Utføre resten av trinnene i romtemperatur.
  11. Med en Pipetter, overføre bare de lysate (~ 350 µL), unngå perler, til en ny 1,5 mL microcentrifuge tube.
  12. Microcentrifuge i 2 minutter maks hastighet og deretter overføre nedbryting til en ny 1,5 mL microcentrifuge tube.
  13. Legge til 1-volum med 70% etanol (laget av 200 bevis molekylærbiologi førsteklasses etanol). Bland godt av pipettering.
  14. Løsningen og alle bunnfall til en RNA kolonne som er plassert innenfor en 2 mL samling rør.
  15. Sentrifuger for 15 s på ≥12, 000 x g og kast gjennomflytsenhet (væsken i røret).
  16. Legge til 350 µL bufferen RW1 kolonnen. Sentrifuger for 15 s på ≥12, 000 x g og kast gjennomflytsenhet.
  17. Legge til 80 µL DNase jeg inkubasjon blanding til kolonnen membranen (ikke får på sidene av rør) og la sitte i 15 min.
  18. Legge til 350 µL bufferen RW1 kolonnen. Microcentrifuge for 15 s på ≥12, 000 x g og kast gjennomflytsenhet.
  19. Legg til 500 µL av buffer RPE i kolonnen. Microcentrifuge for 15 s på ≥12, 000 x g og Forkast gjennomflytsenhet.
  20. Legg til 500 µL av buffer RPE i kolonnen. Microcentrifuge i 2 minutter på ≥12, 000 x g.
  21. Nøye fjerne kolonnen og plasser i en ny 2 mL samling rør. Microcentrifuge i full fart for 1 min (for å tørke helt membranen).
  22. Forkaste samling rør og plasser kolonnen i en 1,5 mL microcentrifuge tube. Legge til 30 µL av RNase-fritt vann kolonnen membranen.
  23. Elute RNA kolonnen av microcentrifuging for 1 min på ≥12, 000 x g. Når legge kolonnene i microcentrifuge, sikre lokkene på samling røret står overfor i retning sentrifuge spinner, for å forhindre lokkene bryte ut.
  24. Legge til en annen 30 µL av RNase-fritt vann kolonnen membranen, samtidig kolonnen i samme microcentrifuge rør.
  25. Microcentrifuge for 1 min på ≥12, 000 x g, slik at den endelige eluate er 60 µL.
  26. Lagre hver 1,5 mL rør som inneholder 60 µL av i-80 ° C fryseren.

3. bestemme RNA konsentrasjonen og kvaliteten

  1. Måle konsentrasjonen av RNA og DNA i hver RNA prøve, med (a) en fluorometer, (b) DNA og RNA-spesifikke fluorescerende fargestoffer og (c) analysen rør, som oppført i Materialer tabell. Følg instruksjonene i fluorometer og fargestoffer.
  2. Alternativt, måle nukleinsyre konsentrasjonen med en UV spektrofotometer satt til 260 nm.
    Merk: En A260 lesing av 1.0 tilsvarer ~ 40 µg/mL single-strandet RNA.
  3. Test RNA kvalitet ved å kjøre RNA på en kommersiell nukleinsyre analyzer (se Materialer tabell) eller på en standard formaldehyd/agarose gel 26.

4. RNA-seq analyse

  1. Fra totalt RNA lager, utgjør 21 µL av 100 ng/µL RNA i RNase-fritt vann. Bruke 1 µL av denne 21 µL for å teste RNA konsentrasjonen som ovenfor. Sende de resterende 20 µL (2 µg) totalt RNA til en ekstern sekvensering senter for mRNA berikelse, strand-spesifikke bibliotek forberedelse (med åtte eller flere strekkoder for multiplexing) og sekvensering (se Materialer tabell). Alternativt lokalt utføre mRNA berikelse og biblioteket forberedelser, og deretter sende biblioteket for sekvenser.
  2. Basseng åtte eller mer multiplex prøver og sekvensen i ett kjørefelt av en neste generasjons sequencer.
  3. Last ned filen FASTQ som inneholder alle i sekvens lyder og tilsvarende indeksen leser. Også laste ned tekstfilen som inneholder multiplex strekkodene.
    Merk: Indeks-leser kan finnes i en separat FASTQ-fil. Plassere alle disse filene i en katalog.
  4. Plass shell script gitt her, "fastq_pipeline.sh", i samme mappe. Rediger dette skriptet som passer for eksperimentet og datamaskinen katalogene.
    Merk: Dette skriptet inneholder omfattende merknader forklarer trinnene. I korte trekk skriptet kvaliteten trimmer lest, tilordnes lest genomet, og genererer en tabulatordelt fil som inneholder antall leser per genet for hvert utvalg.
  5. Sette inn FASTQ filer og rå Les telle data på NCBI'S Gene Expression Omnibus før publikasjonen 27. Følg instruksjonene for "Å levere høy gjennomstrømming sekvens data til GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
  6. Importere Les telle data til R statistiske miljøet og utføre statistisk analyse, bruke R manuset leveres her, "time_course_script. R". Rediger dette skriptet som passer for eksperimentet og datamaskinen katalogene.
    Merk: Dette skriptet inneholder omfattende merknader forklarer trinnene. I korte trekk, dette skriptet importerer Les data, normaliserer lest, identifiserer gener som endres vesentlig i løpet tid utfører PCA analyse og grafer uttrykk for valgte gener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hypoksi tid kurset og RNA-seq analyse var utført uavhengig tre ganger. For å undersøke reproduserbarhet av de tre replikat, ble genuttrykk data for alle gener analysert ved hjelp av viktigste komponenten analyse (PCA). Figur 2 viser hvordan prøvene endres over de to første viktigste komponentene, som sammen representerer 58.9% av variasjon. Denne analysen indikerte at hver gang løpet viser lignende endringer (som avbildet av lignende form av hver kurve). I tillegg var de to siste gjentak mer lik andre enn den første replikere. Dette stemmer overens med det faktum at de to siste gjentak ble utført av samme person bruker samme kladdene media komponenter, mens den første replikere ble utført av en annen person og grupper. Dette funnet fremhever at konsistensen av teknikk og kjemikalier er en viktig faktor i å oppnå høy reproduserbarhet. Endelig er PCA analyse nyttig i å vurdere om de valgte tidspunkt fange de store endringene som oppstår under time course. Fokusere på ett Repliker kurven, er det større avstander mellom de tidligere prøvene, som viser store endringer i genuttrykk og mindre avstander mellom de senere prøvene, mindre endringer og muligens slutten av overgangen fra aerobic til hypoxic genuttrykk.

Deretter ble DESeq2 pakken R25 brukt til å identifisere tilblivelse viser en betydelig endring i forhold til tid 0 (p-verdier i supplerende tabell 1). Av disse betydelig gener 607 endret flere 4-fold (fold endringer i supplerende tabell 1). Uttrykket mønstre av disse genene ble gruppert, slik at tilsvarende regulert gener var gruppert, og vises i en heatmap (Figur 3). Denne illustrasjonen viser at uttrykket endringer er svært reproduserbare tvers av replikat. Også utstilling gener variabel kinetics med både økning og nedgang i uttrykket. Mange gener viser en topp økning eller reduksjon på 30 min, sannsynligvis på grunn av en forbigående stress respons 13.

Figur 4 viser uttrykk for to downregulated og to upregulated gener funnet tidligere O2-regulert. Genene endre uttrykket reproduserbar, med lignende kurver mellom de biologiske gjentak. Genet med minst variasjon mellom gjentak er DAN1, med overlappende kurver. Genet med mest variasjon er CYC1, kanskje fordi uttrykk for dette genet er naturlig variabel. Denne illustrasjonen viser også at store fold (opptil 1,024-fold) ble oppdaget.

Å identifisere de cellulære prosessene beriket i settet av 607 O2-regulert gener, gå begrepet berikelse ble utført (supplerende tabell 2). Som forventet, mange O2-regulert genene spiller en rolle i cellular respirasjon, andre aspekter av metabolismen, og ribosomal prosesser 13.

Eksempel # Tid i hypoksi mL kultur + mL YPD
2 5 min 20 mL + 0 mL
3 10 min 20 mL + 0 mL
4 30 min 20 mL + 0 mL
5 60 min 10 mL + 10 mL
6 120 min 10 mL + 10 mL
7 180 min 5 mL + 15 mL
8 240 min 4 mL + 16 mL

Tabell 1. Cellen fortynninger utført på tiden 0.
Disse fortynninger har fastslått eksperimentelt resultere i midten av Logg konsentrasjon (1-2 × 107 celler/mL) etter den angitte tiden i N2.

Supplerende tabell 1. Uttrykket og statistiske Data for alle gener.
Denne tabellen inneholder systematisk navn, justert p-verdiene for syv DESeq2 tester (dvs.5 min vs 0 min, 10 min vs 0 min, etc.), minimum justert p-verdien, og log2 maksimal fold-endring. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 2. GÅ sikt berikelse resultater.
Denne tabellen viser gå prosesser, deres representasjon i settet med 607 O2-regulert gener og deres representasjon i genomet. Deretter ble chi-kvadrat test brukt til å identifisere gå vilkår som var vesentlig over - eller under-representert i settet av 607 gener. GÅ berikelse analyse ble gjennomført med gå Slim Mapper på SGD 28. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figure 1
Figur 1. Hypoksi oppsett for tar tid poeng uten å forstyrre gasstrømmen til senere tidspunkt.
Det er viktig at alle tilkoblinger være sikre, som beskrevet i protokollen. Note kort (9 cm) og lange (17 cm) glass-rør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Viktigste komponenten analyse (PCA) viser forholdet mellom de tre biologiske gjentak.
Hver kurve har 0 min til 240 min eksempler i rekkefølge. Log2 normalisert genuttrykk for alle gener ble brukt i PCA. PC1 utgjør 34,7% av totalt avvik og PC2 står for 24,2%. Den svarte linjen er den første gjenskape den røde linjen er andre og den blå linjen er tredje. Merk at pilene brukes til å peke ut 240 min tidspunkt i forskjellige prøver. Viktigste komponenten analyse (PCA) ble utført i R ved hjelp av funksjonen prcomp (Q-modus eller entall verdien nedbryting) på log2-forvandlet matrisen som inneholder gener i kolonner og tidspunkt i rader 29. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Heatmap viser uttrykk for 607 gener identifisert som O2-regulert.
Disse genene var betydelig i minst én av DESeq2 tester og endret uttrykk av flere 4-fold. Vist er Logg2(relativ uttrykk). Rød = økt uttrykk. Grønn = redusert uttrykk. Intensiteten i fargene er proporsjonal med endringsgraden. Før du oppretter heatmap i TreeView 30, genuttrykk var k-betyr klynge med k = 10 i klyngen 3.0 31. Nøkkelen under heatmap viser skalaen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Relativ mRNA nivåer av fire gener Over tid i tre replikerer.
Den svarte linjen er den første gjenskape den røde linjen er andre og den blå linjen er tredje. Felles/systematisk genet er CYC1/YJR048W, ERG5/YMR015C, DAN1/YJR150Cog NCE103/YNL036W. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ekstra fil 1. fastq_pipeline.sh
Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra fil 2. time_course_script. R
Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien mRNA nivåene for alle gener ble målt under hypoksi i gjær S. cerevisiae. Målet var å analysere hvordan global gene expression endringer på grunn av veksten i et kontrollert nær-anoksisk miljø. Flere skritt ble tatt for å sikre at metoden beskrevet her var nøye kontrollert og reproduserbar. Først celler ble utsatt for et presist definert hypoxic miljø: 99,999% N2 i medierik (YPD). Andre studier av hypoksi har stengt kolbe eller tube til luft 32, brukes de hypoksi-mimetic kobolt klorid 33eller ansatt hypoksi-inducing anaerob kamre eller poser 34. Hver av disse metodene kan resultere i varierende grad av hypoksi eller andre utilsiktede miljøendringer. Det ville være nyttig å studere genuttrykk mens systematisk varierende gassblanding (f.eks, 90% N2 og 10% O2), som gjær i naturen er sannsynlig å oppleve mindre alvorlig hypoxic forhold. Andre ble ergosterol og umettede fettsyrer (f.eksTween 80) ikke lagt til kultur media, siden de påvirker genuttrykk som beskrevet i innledningen. Tredje, for å minimere gene expression endringer forårsaket av ulike faser av vekst, empirisk bestemt fortynninger ble utført slik at når en kultur nådd et punkt, det var i midten av Logg fasen av vekst (~ 1-2 x 107 celler/mL). Fjerde, rask filtrering og frysing (~ 15 s) av celler som er fjernet fra hypoksi er kritisk, som gene expression endringer kan forekomme i < 5 min eksponering til O2, som oppstår når cellene er samlet inn av sentrifugering (data ikke vist). Klokkeslettet celler er utsatt for O2 kan reduseres ved å utføre veksten og høsting av celler i en anoksisk hette eller kammer. Femte, en passende belastning ble valgt for denne studien; for å være forenlig med andre genomisk studier, var felles S288C lab belastning bakgrunnen ansatt. Men S288C toner inneholder en mutant hap1 allelet og dermed var reparert 11. Dette tillot studiet av gener som CYC1 som svarer til O2 nivåer via Hap1 transkripsjon faktor 11.

Tidspunkt ble valgt fordi de viser stor gene expression endringer i forrige hypoksi eksperimenter. Resultatene som vises her kan informere senere eksperimenter. For eksempel ville det være nyttig å bruke en høyere oppløsning på tidspunkt under intervaller som viser store endringer (f.eks, 0 til 30 min hypoksi) å fange mer fint i ulike kinetics. I tillegg kan senere tidspunkt, utover tidsperioden assayed her (dvs., 4 h av oksygenmangel) avdekke videre uttrykk endringer.

RNA-seq ble brukt til å måle mRNA nivåer fordi dens reproduserbarhet og bredt dynamisk område tillate måling av store fold endringer 18,35. RNA ble hentet av mekanisk avbrudd av cellene bruker kraftig ristet perler og renset på en kolonne. Andre metoder for rensing av RNA kan brukes som varme fenol 36. Ideelt sett vil RNA konsentrasjonen være i størrelsesorden 200 ng/µL - 1000 ng/µL siden RNA konsentrasjonen vil bli utvannet til 100 ng/µL omvendt transkripsjonstjenester og biblioteket forberedelse. RNA konsentrasjonen bør måles med fluorometer og RNA-spesifikke fargestoff; et UV spektrofotometer er begrenset fordi den måler den totale konsentrasjonen av nukleinsyrer, bestående av både RNA og DNA. Kvaliteten på RNA bestemmes av gel geleelektroforese; ribosomal RNA band bør være godt definert på gel og smøre angir RNA degradering. Her mRNA transkripsjoner ble beriket, men det er ulike metoder for å isolere annerledes RNA typer 20 som kan også være viktig i svaret.

Lagre ressurser, mellom 8 og 12 var multiplekset og sekvensert sammen i ett kjørefelt, resulterer i gjennomsnittlig minst 693 leser per genet for hver prøve, tilstrekkelig til å fastslå reproduserbar antall leser per genet. Faktisk kan mer enn 12 eksempler være multiplekset i ett kjørefelt, sannsynligvis resulterer i tilstrekkelig utvalg av de fleste gener. For å beregne gjennomsnittet leser per genet, ble totalt antall leseoperasjoner som tilordnet gener (i utdatafilen HTSeq) delt på antall gener gitt til HTSeq (i denne studien, 7140). Når du beregner antallet eksempler som kan være multiplekset i ett kjørefelt, vurdere gener rundt som viser laveste uttrykket (dvs., laveste normalisert teller), ved hjelp av data fra denne og andre RNA-seq-studier. Hvis de normaliserte Les teller et gen variere betydelig replikerer, antall leser kan være for lavt, antyder at mindre prøver bør være multiplekset per sekvensering kjørefelt.

Neste generasjons sekvensering genererer FASTQ filer som inneholder lest og annen informasjon. Hvis multipleksing ble utført, kan en strekkode-fil og en ekstra FASTQ genereres. Disse filene kan lastes for lokale analyse, som i denne protokollen. Alternativt er det flere online neste generasjons sekvensen analyseverktøy for de ikke kjent med kommandolinjefunksjoner eller R. I denne forbindelse, anbefaler vi Galaxy (https://usegalaxy.org/) 37 og GenomeSpace (http://www.genomespace.org/). I den nåværende protokollen brukes to skript som er skrevet av forfatterne for FASTQ behandling og uttrykk analyse. Skriptene er godt kommentert og kan redigeres for annerledes eksperimentell design og dataoppsett. Også gi de to skriptene og tabellen "Materialer" nettsteder for dataoverfører verktøy som brukes i disse skriptene. Det første skriptet, "fastq_pipeline.sh", er et skall skript kjøres på kommandolinjen i en UNIX/Linux terminal. Dette skriptet demultiplekser FASTQ filen som inneholder alle lest fra ett kjørefelt i sequenceren, dermed generere en FASTQ-fil for hvert utvalg i at lane. Deretter er leser i hver FASTQ-fil kvalitet trimmet med Trimmomatic med standard innstillinger 21. Den trimmede lest tilordnes deretter S. cerevisiae S288C referanse genomet (SGD R64-1-1_20110203) med TopHat2 med standard innstillinger 22. Skriptet bruker endelig HTSeq for å bestemme antall leseoperasjoner som er tilordnet hver kommenterte funksjonen 19.

Andre skriptet "time_course_script. R", er har også blitt skrevet av forfatterne og innenfor de R statistiske miljø 24. Skriptet opprinnelig import til er Les telle data generert av HTSeq. Hvert utvalg antas for å være et tidspunkt, og dermed er organisert i forhold til de andre tidspunkt. Rå Les teller importeres deretter til R pakken, DESeq2 25, for å identifisere gener som uttrykkes ulikt på alle tidspunkt i forhold til først (dvs., aerobic, tid 0). På grunn av sin fleksibilitet, kan DESeq2 brukes til å utføre andre statistiske tester, for eksempel om uttrykk endrer som funksjon av tiden 13. Alternativt, Les andre verktøy ansette parametrisk og ikke-parametriske statistikk for RNA-seq telle data kan være brukt 20. Skriptet deretter normaliserer Les teller kontroll for graden av sekvensering av hver prøve, og log2 forvandler teller. Disse behandlet leser brukes til å utføre PCA analyse, til å bestemme den maksimale fold-endringen for hver genet og opprette uttrykk grafene i Figur 4.

En viktig sak er hvordan best å bruke statistikk til å identifisere tilblivelse det betydelig på hypoksi. Minst tre biologiske gjenskapninger av time course er nødvendig for å beregne naturlig variasjon av hver genet og dermed avgjøre gener som svarer til hypoksi flere betydelig enn forventet ved en tilfeldighet. Alternativt er det mulig å kunne identifisere tilblivelse det svare over uten biologiske gjentak 13,25,38,39. Den viktigste ulempen til disse metodene er at de ikke tar hensyn til biologisk variasjon av hver genet. Men hvis RNA-seq gjentak ikke utføres, kan individuelle gene expression endringer verifiseres ved å utføre RT-qPCR med flere biologiske replikerer 13.

Det er to primære fordeler til å vurdere flere tidspunkt av et svar. Først, som diskutert tidligere (spesielt i figur 2), en gang løpet identifiserer intervallene viser stor uttrykk endringer, informere om ekstra tid punkter kreves å forbedre oppløsningen på kinetics eller å observere senere hendelsene i den svar. Andre kan en gang løpet differensiering av hver genet uttrykk kinetics. Dette hjelper med å identifisere unike signalveier som handler på bestemte tidspunkt under svaret, og gir innsikt i tidspunktet for oppstart og avslutning av signalering. Spesielt resulterte klynger av gener av uttrykksmønster som ble utført her i sett av co regulert gener. Arrangørene av et gen sett dele en transkripsjon faktor bindende nettsted, antyder at transkripsjon faktoren blir aktiv når genene endre uttrykket.

Når studere en cellulær respons, er observerte variasjon ideelt stimulans (f.eks, hypoksi) og ikke til andre eksperimentelle variabler. Men som vist i figur 2, gjøre personlige forskeren og/eller grupper av media komponentene store bidrag til variasjon i genuttrykk. Dermed bør disse parameterne vurderes for å oppnå høy reproduserbarhet og minimal eksperimentell variasjoner. Så lite tid som mulig bør skille hver replikere, fordi eksperimentelle variabler er mer sannsynlig å endre som tiden går.

I konklusjonen, kan denne metoden brukes å nøyaktig skjermen genomet-omfattende endringer i mRNA nivåer (eller andre hendelser som histone endringer eller protein nivå) en hypoksi gang løpet. Metoden kan tilpasses for andre organismer, spesielt mikrobielle arter som kan dyrkes i flytende kultur. Slike genomet hele tiden-retters analyser vil utfylle studier av celle morfologi, protein aktivitet og metabolisme. Sammen vil disse dataene føre til en rikere forståelse av en cellulær respons.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Lewis-Sigler Institutt for integrerende Genomics sekvensering Core anlegget ved Princeton University for teknisk rådgivning og RNA biblioteket forberedelse og sekvenser. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Rowan University og NIH NIGMS R15GM113187 til M.J.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Enclosed dry incubator Thermo Scientific MaxQ 4000 Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.
Micro-analysis Filter Holder Millipore XX1002530 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask
Strong vacuum Edwards E-LAB 2 The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.
1,000 mL flask To act as vacuum trap.
~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in Tygon 38TT Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.
High-pressure N2 gas tank 99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller
Autoclaved 500 mL flask Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.
Autoclaved 250 mL flasks Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.
Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter) Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.
Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.
~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm Tygon E-3603 One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.
Sterile filter discs Millipore HAWP02500 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point
Sterile dH2O (~100 mL)
1 mL cuvettes For measuring OD600 (i.e., cell concentration)
50 mL sterile centrifuge tubes One for each time point
Clean and sterile tweezers
liquid nitrogen For freezing cells
acid-washed beads Sigma G8772 Keep at 4 °C for lysing cells
Qiagen RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA column purification
Qiagen RLT buffer Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C.
2 mL collection tubes Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPE Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1 Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I stock and working solutions Qiagen 79254 The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen.
Buffer RDD Qiagen included in the Qiagen DNase Kit
Ice cold 2 mL screw-cap tubes For lysing cells during RNA extraction
bead mill homogenizer Biospec Mini-Beadbeater-24 112011 Keep in cold room
Bacto Peptone BD DF0118 for liquid YPD media
Bacto Yeast Extract BD DF0886 for liquid YPD media
glucose Fisher D16 for liquid YPD media
Qubit assay tubes Thermo Fisher Q32856 for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit Thermo Fisher Q32853 for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM RNA Assay Kit Thermo Fisher Q32855 for measuring nucleic acid concentration
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216 for measuring nucleic acid concentration
Commercial electrophoresis system Agilent Bioanalyzer 2100 for measuring nucleic acid quality
Next-generation sequencer Illumina HiSeq 2500 for sequencing libraries
automated liquid handling system Wafergen Apollo 324 for creating sequencing libraries
PrepX PolyA mRNA Isolation Kit Wafergen 400047 for isolating mRNA from total RNA
PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit Wafergen 400039 for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA
Barcode Splitter https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, which includes the gzip command http://www.htslib.org/download/
Trimmomatic http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (installed before TopHat) http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHat https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeq http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (installed before R Studio) https://cran.rstudio.com
R Studio (free version) https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
  2. Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
  3. Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
  4. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  5. Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
  6. Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
  7. Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
  8. Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
  9. Lai, L. -C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
  10. Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
  11. Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
  12. Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).
  13. Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
  14. Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
  15. Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).
  16. Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
  17. Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
  18. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
  19. Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).
  20. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
  23. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
  24. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Available from: https://www.R-project.org (2015).
  25. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  26. Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
  27. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
  28. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
  29. Hothorn, T., Everitt, B. S. A Handbook of Statistical Analyses using R. , 3rd ed, CRC Press: Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2014).
  30. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  31. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  32. Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).
  33. Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
  34. Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
  35. Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).
  36. Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
  37. Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
  38. Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, Suppl 5. (2014).
  39. Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).

Tags

Genetikk problemet 126 anaerob aerobic transcriptome neste generasjon tid selvfølgelig gjær
Måle mRNA nivåer Over tid under gjær <em>S. cerevisiae</em> Hypoxic svaret
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Willis, S. D., Hossian, A. K. M. N., … More

Willis, S. D., Hossian, A. K. M. N., Evans, N., Hickman, M. J. Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response. J. Vis. Exp. (126), e56226, doi:10.3791/56226 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter