Summary
ここでは、RNA シーケンスを使用して酵母細胞の低酸素応答中に時間をかけての mRNA のレベルを監視するプロトコルを提案する.このメソッドは、任意の携帯電話応答中に遺伝子発現を解析する合わせることができます。
Abstract
遺伝子発現の複雑な変化は通常大部分の細胞応答を仲介します。各遺伝子は、遺伝子は多くの刺激、信号経路または二次的な影響の 1 つの特定のタイミングで規制されて、ユニークな反応速度で式を変更可能性があります。全体の遺伝子をキャプチャするために酵母、RNA シーケンス解析における低酸素応答は低酸素への露出の後の特定の時間にすべての遺伝子の mRNA のレベルを監視する使用されました。低酸素症は、〜 100% N2ガス細胞の成長によって設立されました。重要なは、その他の低酸素の研究とは異なりエルゴステ ロール、不飽和脂肪酸に追加されませんでしたメディアこれら代謝遺伝子発現に影響を与えるため。その期間は遺伝子発現に大きな変化をキャプチャするため、タイム ポイントは 0 - 低酸素後 4 h の範囲に選ばれました。各時点で中間ログ低酸素細胞がすぐにフィルタ リングされ、凍結、遺伝子発現の O2と併用変更への露出を制限します。総 RNA は細胞から抽出され、cDNA に変えられたし、mrna を豊かにするために使用します。この cDNA から多重ライブラリが作成された、8 個以上のサンプルが次世代シーケンサーの 1 つの車線に配列されました。マッピングと遺伝子ごとの読み取り数を決定する品質基本トリミングを含むポスト シーケンス処理パイプラインを説明します。R 統計環境の中で DESeq2 は、低酸素時点のいずれかで大きく変化する遺伝子を識別するために使用されました。3 生物的複製の分析は、高い再現性を明らかにした、異なる速度の遺伝子と多数の期待 O2-遺伝子。これらのメソッドは、時間をかけて様々 な生物の細胞が低酸素に対応方法を研究するために使用し、他の細胞に発現する遺伝子の研究に適応できます。
Introduction
多くの生物は、遺伝子発現1,2,3を変更することにより低酸素症、または低 O2に応答します。この応答細胞の有酸素呼吸のため、いくつかの生合成反応の重要な基板の欠如と、変化する酸化還元状態4を対処するために役立ちます。出芽酵母で実行されるいくつかのマイクロ アレイ研究を示す低酸素5,6,7,8,9への応答で何百もの遺伝子の mRNA のレベルが変更されます。,10,11,12です。 最近、RNA シーケンスは低酸素症13時に時間をかけて遺伝子発現変動を特徴付けるために使用されました。ここでは、実験の詳細が表示されますと説明しました。
低酸素は O2の別のレベルがそれぞれ、様々 な方法で実現できます。ここでは、低酸素血症が継続的に流れるによって設立された超高純度 N2フラスコに [2] を下げるが再現速度10のすぐに溶解しました。いくつか O2分子存在代謝と遺伝子発現に寄与するが、この環境で嫌気性の近くに非常にあることが可能です。O2がない場合は、酵母細胞は、ピロールポリアミド ヘム、エルゴステ ロール、不飽和脂肪酸4,12,14をことはできません。したがって、酸素5,10,15なし酵母を育てるときは、以前の研究にこれらの代謝物質が含まれています。ただし、これらの代謝物質の枯渇によって仲介される多くの低酸素応答し低酸素遺伝子発現応答12,16を反転従ってそれらを補充します。自然な低酸素状態を模倣するために、これらの代謝物はメディアに追加されませんでした。細胞がこれらの重要な代謝物質が存在しなくても低酸素にさらされた短い時間で細胞死 (データは示されていない) も長期のストレス応答13の顕著な増加がなかった。
応答は、ひずみとその遺伝子型に依存しています。特に重要なは、低酸素応答2の知られている規制当局の対立遺伝子は。S288C 株の背景は、この歪みを使用して実行するその他のゲノム研究と結果を比較することが望ましい。ただし、S288C にはHAP1遺伝子17、低酸素応答の重要な転写因子の部分的な機能喪失の対立遺伝子が含まれています。この対立遺伝子は S288C で修復された、野生型を使用して、Σ1278b からコピーひずみ背景11。
遺伝子の発現は細胞の環境に大きく依存しています。したがって、mRNA 全ゲノム解析を実行すると、時間、刺激、または遺伝子型など別のパラメーターを変えながら一定の環境を維持するために重要です。再現性の高い結果を達成するため、これらの 3 つの事例研究とその生物学的または技術的な複製のすべてを検討してください。まず、同じ experimenter(s) を実行し、研究技術プラクティスは実験者間で異なる場合がありますので。第二に、各バッチがある遺伝子発現に影響を与えることができますわずかに異なる組成としては、成分の同じバッチを成長媒体で使用ください。第三に、細胞周期の影響を最小限に抑えるために各時点で構成されます非同期セルの成長 (1-2 x 107セル/mL) の中間ログの段階で。
低酸素遺伝子発現応答のような複雑な応答を特性評価する際時間コースは様々 なイベントの速度を決定するため有利です。応答の主要な変更をキャプチャする、特定の時間ポイントを選択必要があります。本研究では、過去の実験は、この期間の13の間に遺伝子発現の広範な変化を明らかにしたので、0 と 4 h の時間ポイントが観察された.
世界的な遺伝子発現を測定するには、RNA シーケンス使用18,19であった。このメソッドでは、次世代シーケンサーを使用して、各遺伝子の転写産物の相対量を決定します。RNA seq DNA マイクロ アレイ解析と比較して、(より少なく豊富な転写産物を検出) に対する感受性も高い、(大きいフォールドの変更を測定) に大きなダイナミック レンジ、優れた再現性に正確に時間をかけて遺伝子発現を展示しています。通常、ほとんどの携帯電話の RNA はリボソーム RNA 特定 RNA 種20を豊かにするとても多くの方法が開発されているです。ここでは、浄化するためにポリ A を含む mrna もさまざまな商業的使用されたポリ T ビーズ - 入手可能な rRNA 枯渇キットは mRNA 濃縮に有効である可能性があります。
ここでは、低酸素に出芽酵母遺伝子の発現は特徴付けられました。細胞が低酸素にさらされ、8 の時点でサンプリングし、(0、5、10、30、60、120、180 と 240 分)。再現性を確認するためおよび統計的に変更された成績証明書を識別するには、3 つの生物学的複製を行った。RNA だった機械的破壊とカラム精製により抽出し、RNA シーケンス解析処理し、.ポスト シーケンス処理パイプラインは記述されプログラミング スクリプトは解析の厳密な複製を実行できます。具体的には、Trimmomatic 21、TopHat2 22、HTseq 23、R 統計環境24、DESeq2 パッケージ25を用いて RNA シーケンス データを処理し、中に大幅変更 607 の遺伝子を識別するには低酸素血症。主成分分析 (PCA) および複製の遺伝子発現手法の再現性を示した。クラスタ リングとヒートマップなどは遺伝子の ontology (GO) の分析を示した酸素遺伝子のセットで好気性の呼吸のような多くの細胞プロセスが濃縮され、広範な発現動態を明らかにしました。
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Protocol
1. 低酸素血症を誘発します。
- 低酸素状態の時間経過前に 1 日以上: インキュベーターを準備、携帯フィルタ リング システム、真空、ガスのタンク、フラスコ、ストッパー、ガラス管、管材料表のように。
- 細胞の迅速な処理を有効にする、近くに N2槽、インキュベーター、真空およびフィルタ リング システムを配置します。
- ガラス瓶とオートクレーブ内のコンポーネントを混合することによって滅菌液体 YPD 培 (1% 酵母エキス、ペプトン 2%、2% グルコース) を準備します。
- インキュベーターでフラスコのレイアウトを計画します。
注: N2タンクから最初フラスコが水トラップ、2 番目のフラスコは最後の時間ポイントになります、第 3 フラスコなります最後から 2 番目の時点に最終的な水のトラップである最後のフラスコまで。図 1は、フラスコの間の順序と接続を示します。 - 時間コース前日は、5 mL の液体 YPD 滅菌試験管内での培養に酵母コロニーを接種します。具体的には、滅菌アプリケータ スティックを用いた平板からの完全植民地をピックアップします。液体 YPD に棒を置き、細胞の大部分が懸濁液になるまで棒を振る。
- 30 ° c 一晩 (~ 16 h) チューブを回転させます。
注: 16 時間後野生型細胞は飽和 (~ 108セル/mL x 2)、非常に曇りの文化によって示されるを実現します。他の系統は飽和に到達する時間がかかることがあり、ステップ 1.9.4 に示すように、分光光度計での細胞濃度の測定によるテスト必要があります。 - 時間経過の日、16 時間、飽和させた文化を希薄化後 1:50 の 4 ml に 5 mL のピペットを使用して一晩で文化 196 mL 滅菌 500 mL フラスコ内の液体 YPD に。30 ° C で 4 時間 〜 200 rpm で振とうしながら成長します。
注: 1 〜 2 × 107セル/mL の中間ログ濃度がなる可能性があります野生型文化 4 時間後としていること。 - 4 時間培養中のラベル (低酸素と水のトラップ) をフラスコと 50 mL 採血管。低酸素状態の時間のコースの上記のステップ 1.7 でインキュベーターを使用しない場合他のインキュベーターをオンにし、30 ° C に設定
-
低酸素細胞の服従: 直前
- 水トラップとなる滅菌 250 mL フラスコ 2 〜 50 mL の水を追加します。
- 1を埋める/氷3液体窒素でバケットし、50 mL 遠沈管を保持するために発泡スチロール ラックが水没します。
- 細胞を収集するためのフィルター システムを設定します。滅菌フィルター ディスク フィルター ディスクの端にのみ接触に注意しながら滅菌ピンセットを使用してろ過システムの下の単位を追加します。フィルタ ユニットの下にフィルターのトップ ユニットを置き、システムに付属のクランプで固定します。タイトなシール、漏れ無し、上部と下部のユニットが並んでいることを確認します。
- 分光光度計での細胞濃度を測定します。分光光度計-~0.2 - 分光光度計によって 0.6 間 OD600の線形の範囲で測定することができますので、細胞を希釈します。
注: 1 OD600単位は細胞の形態や分光光度計によって 107セル/mL、x ~ 3。~0.33 - 0.66 の OD600に対応する 1 〜 2 × 107セル/mL の濃度が予想されます。 -
時間 0 サンプルを迅速に取得します。
- 真空チューブと 1,000 mL フラスコ トラップを介して強力な (~ 10 mbar) 真空フィルター システムを接続します。真空をオンにします。トップ ユニットに文化 (通常 〜 20 mL) を注ぎ、フィルターを通して引っ張られる液体を待つ (~ 10 秒、真空の強度によって)。
- 慎重にきれいなピンセットでフィルター ディスクを削除し、50 mL の遠心管に配置します。すぐに液体窒素に浸漬ラックに遠心管を配置します。重要なは、行う前冷えていないチューブ チューブが爆発するようにフィルターを挿入する前に。
- 後 > 30 s、場所後の RNA 抽出-80 ° C のフリーザーに挿入するチューブ。各濾過後掃除、フィルター システムを組み立て直します。10 水を引いてシステムを洗浄フィルター ディスクなし s。最後に、システムをワイプ乾燥ペーパー タオルで。
- 各フラスコ低酸素症の示された時点で中間ログ濃度 (1 〜 2 × 107セル/mL) に達すると、さまざまな時点の異なるフラスコに 4 h 文化を希釈します。
注意: 表 1 に示します希釈野生型 S288C HAP1+の半数体系統で使用されました。これらの低酸素培養条件で各ひずみをテストし、それに応じて希釈を調整することをお勧めします。 - フラスコに電池とメディアを追加すると、挿入された 2 つのガラス管を含んでいるストッパーを開くフラスコをカバーするアルミ箔を取り付けます。
- 以前決定レイアウトのインキュベーターに、フラスコを配置します。
- 図 1に示すように、しっかりとチューブを接続します。
- すべてのストッパーがフラスコの開口部にしっかりとプッシュすることを確認します。
- 0 時に、レギュレータ バルブを開きます。流量計を 3 L/分に設定します。
注: バブル観測される両方の水筒に適切なガスの流れを示します。そうでない場合は、すべてストッパーが締まっているとチューブが正しく接続されていることを確認します。 - インキュベーターを閉じて ~ 200 rpm に揺れのスピードを設定します。タイマーを起動します。
- 各時間ポイントの前に記述する上 1.9.3 の手順でフィルター システムのセットアップします。
-
各時点で (例えば5 分、10 分のなど)、2 人の細胞のように迅速に処理があります。
- 一人称: ホルダーから適切なフラスコを外し、(接続されているガラス管) とストッパーを取る。
注: これは残りの培養フラスコを N2の流れを中断されませんが、最後の水トラップに一時的に流れが壊れます。 - 二人目: 文化の 1 mL をピペットで移しなさいキュベットに分配し、。最後の水トラップ (1 つの管と 1 つのストッパーがプロセスで削除される) の行の末尾に今培養用フラスコからチューブを接続し直します。1.9.4 の手順で前述、キュベット、細胞濃度を測定します。
- 一人称: 文化の残りの部分を注ぎ真空ろ過システム、フィルタ リングと 1.9.5 の手順で上記のように凍結を行います。
- 一人称: ホルダーから適切なフラスコを外し、(接続されているガラス管) とストッパーを取る。
- すべての時間のポイントを完了したら、N2ガスをオフします。レギュレータを閉じてし、解放するために圧力を待つ、流量計の電源を切ります。最後に、システムを分解して水とし、70% エタノールですべての材料を掃除します。
2. RNA の抽出
- 材料表のとおり列の RNA の浄化の RLT バッファーを準備します。
- サンプルごとにバッファー RDD の 70 μ L に DNase ストック溶液 10 μ L を追加して DNase の実用的なソリューションを準備 (材料表を参照してください)。
- フィルターと-80 ° C のフリーザーからの細胞を含む 50 mL チューブを取り外し、氷上 (~ 15 分) を解凍します。氷のチューブで次の手順を実行します。
- 2 mL スクリュー キャップ チューブにラベルを付けるし、氷、サンプルごとに 1 つの管の上に置きます。酸洗浄したビーズの ~0.6 mL をスクープし、ビーズを測定する 1.5 mL 遠心管を使用して、各チューブに追加します。
- 50 mL チューブに 0.6 mL の冷たい RLT バッファーを追加します。
- フィルターからセルを削除し、ソリューションに中断を上下にピペットで移しなさい。ソリューションにソリューションを浸すフィルターのままフィルターをさせることを避けます。すべてのソリューションを削除する管の壁に対してフィルターを圧迫するピペット先端部を使用してフィルターに吸収されます。
- ビーズを含むスクリュー キャップ チューブに 50 mL のチューブから液体のすべてを転送します。
- ビーズ工場ホモジナイザーにスクリュー キャップ チューブを置き、1 つ分を実行します。
すぐに 3 分間氷の上管を配置します。もう一度、ホモジナイザーに管を配置し、1 つ分の実行します。 - ホモジナイザーと 5 分間氷の上場所からチューブを取り外します。ビーズは、チューブの底に解決します。
- 室温での手順の残りの部分を実行します。
- ピペットを使い、転送のみ、ライセート (~ 350 μ L)、新しい 1.5 mL 遠心チューブに、ビーズを回避します。
- 最大速度と新しい 1.5 mL 遠心チューブにし、転送上清で 2 分間遠心します。
- (200 証拠分子生物学グレード エタノール製) 70% のエタノールの 1 ボリュームを追加します。ピペッティングでよく混ぜます。
- ソリューションといずれか転送 2 mL コレクション チューブ内に配置されている RNA 列に沈殿物。
- (管内液体) 15 ≥12 で s、000 x gの流れを破棄に遠心分離します。
- バッファー RW1 の 350 μ L を列に追加します。15 ≥12 で s、000 x g の流れを破棄に遠心します。
- 80 μ L を追加 DNase 私列膜にインキュベーション ミックス (管の両側は得ること) と 15 分間座ることができます。
- バッファー RW1 の 350 μ L を列に追加します。15 ≥12 で s、000 x gの流れを破棄に遠心。
- バッファー RPE の 500 μ L を列に追加します。15 の ≥12 で s, 000 x gと破棄の遠心流れを介して。
- バッファー RPE の 500 μ L を列に追加します。≥12, 000 x gで 2 分間遠心します。
- 慎重に列を削除し、新しい 2 mL 管に配置します。(完全に乾燥膜) にフルスピードで 1 分間遠心
- コレクション チューブを破棄し、1.5 mL 遠心チューブに列を配置します。列膜に RNase フリーの水の 30 μ L を追加します。
- ≥12, 000 × gで 1 分の microcentrifuging で列からの RNA を溶出します。遠心に列を読み込み、コレクション チューブの蓋に打ち切る蓋を防ぐために、遠心分離機の回転方向に直面していることを確認します。
- 同じ遠心チューブに列を維持しながら列膜に RNase フリー水の別の 30 μ L を追加します。
- ≥12, 000 x gで 1 分間遠心して最終的な溶出量が 60 μ L。
- -80 ° C のフリーザーで RNA の 60 μ L を含む各 1.5 mL チューブを格納します。
3. RNA 濃度と品質を決定します。
- 材料表の (a) 蛍光光度計、(b) DNA および RNA 固有蛍光染料 (c) アッセイ チューブを使用して、各 RNA サンプルの RNA と DNA の濃度を測定します。染料、蛍光光度計の指示に従います。
- また、260 セット紫外線分光光度計と核酸濃度を測定 nm。
注: 1.0 A260読書 〜 40 μ g/mL 一本鎖 RNA と同等です。 - 商業核酸・ アナライザーの RNA を実行することにより RNA の品質をテスト (材料表参照) または標準的なホルムアルデヒド/agarose のゲルの26。
4. RNA シーケンス解析
- 総 RNA の在庫から 21 μ 100 ng/μ L の RNA の RNase フリー水を補います。この 21 μ L の 1 μ L を使用すると、上記の RNA 濃度をテストします。提出する mRNA の濃縮のため外部シーケンス拠点、ストランド固有のライブラリ (に多重化するための 8 つ以上のバーコード) 準備に残り 20 μ L (2 μ g) 総 RNA シーケンス (材料表を参照してください)。また、ローカルで実行する mRNA の濃縮とライブラリの準備し送信シーケンス処理用ライブラリ。
- 8 つ以上の多重サンプルと次世代シーケンサーの 1 車線のシーケンスをプールします。
- シーケンス リードをすべて含む FASTQ ファイルをダウンロードし、対応するインデックスを読み取ります。また、多重のバーコードを含むテキスト ファイルをダウンロードします。
注: インデックス読み取りが別の FASTQ ファイルに現在あります。1 つのディレクトリにすべてのこれらのファイルを配置します。 - ここで、"fastq_pipeline.sh"と同じディレクトリに提供されているシェル スクリプトを配置します。このスクリプトに応じて、実験およびコンピューター ディレクトリを編集します。
注: このスクリプトには、手順を説明する広範なコメントが含まれています。簡単に言えば、スクリプト品質は読み取りをトリム、読み取りをゲノムにマップし、各サンプルの遺伝子あたりの読み取り数を含むタブ区切りのファイルを生成します。 - パブリケーション27前に NCBI の遺伝子表現のオムニバスに FASTQ ファイルと raw 読み取りカウント データを入金します。「ゲオと高スループット シーケンス データの送信」の手順に従います: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html。
- R の統計的環境読み取りカウント データをインポートし、「time_course_script ここでは、提供される R スクリプトを使用して、統計分析を実行。R"。このスクリプトに応じて、実験およびコンピューター ディレクトリを編集します。
注: このスクリプトには、手順を説明する広範なコメントが含まれています。簡単に言うと、このスクリプトは、読み取りデータをインポート、読み取りを正規化時間コースによって有意な変化、主成分分析を実行してグラフの選択した遺伝子の発現の遺伝子を識別します。
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Representative Results
低酸素症の経過と RNA シーケンス解析を独立して 3 回行った。3 つのレプリケートの再現性を確認するには、すべての遺伝子の遺伝子発現データを主成分分析 (PCA) を使用して行った。図 2は、サンプルが一緒に可変性の 58.9% を表す最初の 2 つの主要コンポーネントを変更する方法を示しています。この分析では、(各曲線の似たような形で描かれている)、各時間コースが同様の変化を示すことを示した。さらに、最後の 2 つの複製最初のレプリケートするよりも互いに類似していた。これは実際に最後の 2 つの複製が最初の複製を行った別の人とバッチ間メディア コンポーネントの同じバッチを使用している同じ人によって行われたこと。この発見は、技法と化学物質の整合性が高い再現性を得る場合の重要な要素であるという事実を強調表示します。最後に、PCA 分析は、選ばれた時ポイントをキャプチャ時間経過中に発生する主要な変更かどうかを評価する上で便利です。遺伝子発現と小さい変化と可能性を好気性からスイッチの終わりを示す後のサンプル間の距離が短いの大規模な変化を示す、以前サンプル間より大きい間隔がある 1 つの複製曲線に着目し、低酸素遺伝子発現。
次に、R25 DESeq2 パッケージは時間 0 (p補足表 1の値) と比較して大幅な変更を示す遺伝子を識別するために使用されました。これらの重要な遺伝子、607 の 4 倍以上に変更 (補足表 1にフォールドの変更)。これらの遺伝子の発現パターンはクラスター化されたので、同様に遺伝子が一緒にグループ化され、ヒートマップ (図 3) に表示されます。この図は、表現の変更がレプリケート全体で再現性が高いことを示しています。また、遺伝子の増加と式の減少変数動態を展示します。多くの遺伝子は増減 30 分、一時的なストレス応答13原因でピークの増加を展示します。
図 4は、2 つのダウンレギュ レートおよび以前 O2をことが判明 2 遺伝子発現を示しています-規制。遺伝子は生物の複製の間に似たような曲線を再現性をもって、式を変更します。少なくとも複製差と遺伝子、曲線を重ねてDAN1、です。最も変動と遺伝子はCYC1、この遺伝子の表現は当然変数です。この図では、大規模なフォールドの変更 (最大 1,024-fold) 検出されたことも示しています。
607 O2個セットで濃縮細胞プロセスを識別するために-調整された遺伝子、濃縮された GO Term 実行 (補足表 2)。予想通り、多くの O2-細胞呼吸、代謝の他の側面、リボソーム プロセス13調整された遺伝子が役割を果たします。
| サンプル # | 低酸素状態の時間 | mL 文化 + mL YPD | ||
| 2 | 5 分 | 20 mL + 0 mL | ||
| 3 | 10 分 | 20 mL + 0 mL | ||
| 4 | 30 分 | 20 mL + 0 mL | ||
| 5 | 60 分 | 10 mL + 10 mL | ||
| 6 | 120 分 | 10 mL + 10 mL | ||
| 7 | 180 分 | 5 mL + 15 mL | ||
| 8 | 240 分 | 4 mL + 16 mL | ||
表 1。セル希釈時間 0 で実行されます。
これらの希釈を N2で指定された時間の後中間ログ濃度 (1-2 × 107セル/mL) が発生する実験的に決定されています。
補足表 1。式は、すべての遺伝子の統計データ。
この表は組織的名前、DESeq2 テスト (すなわち、0 分、 0 分等と 10 分と 5 分) が 7 つの調整 p 値、最小調整 p 値と log2 最大倍変更。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補助テーブル 2。移動強化結果します。
この表は、移動プロセス、607 の O2個セットで表現-遺伝子とゲノムの表現を規制。その後、カイ二乗検定は有意に上または下-表現 607 遺伝子のセットに行く条件を識別するために使用されました。濃縮分析を SGD 28で行くスリム マッパーを使用して行ったに行きます。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
図 1。後の時点にガスの流れを中断させることがなく撮影時点の低酸素症を設置しました。
プロトコルに従って、安全のすべての接続を保つことが重要です。短い (9 cm) と長い (17 cm) ガラス管の位置に注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。主成分分析 (PCA) は、3 つの生物学的複製間の関係を示しています。
各曲線は、順序を 240 分サンプルへ 0 分。すべての遺伝子のための正規化 log2 遺伝子発現は、PCA で使用されました。PC1 は、合計差異と 24.2% の PC2 アカウントの 34.7% を占めています。黒い線は最初のレプリケート、赤い線は、第二に、青色の線は 3 番目。矢印は、240 分を指摘する使用されていることに注意してください、異なるサンプル時点。主成分分析 (PCA) log2 変換行列の列で遺伝子と行29時間ポイントを含むprcomp関数 (Q モードまたは特異値分解) を用いた r を行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。ヒートマップ、607 の発現を示す遺伝子 O2-規制。
これらの遺伝子は DESeq2 テストの少なくとも 1 つに有意し、4 倍以上で式を変更します。ログ2(相対式) には表示されます。赤 = 発現の増加。緑 = 発現の低下。色の強度は変化の程度に比例します。TreeView 30ヒートマップを作成する、前に遺伝子発現だった k 平均 k クラスター Cluster 3.0 3110 を =。ヒートマップの下キーは、規模を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。3 つの時間の経過とともに 4 つの遺伝子の相対的な Mrna をレプリケートします。
黒い線は最初のレプリケート、赤い線は、第二に、青色の線は 3 番目。共通/体系的遺伝子名は、 CYC1/YJR048W ERG5/YMR015C、 DAN1/YJR150C NCE103/YNL036Wです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足的なファイル 1。fastq_pipeline.sh
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補足的なファイル 2。time_course_script。R
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Discussion
本研究では酵母出芽酵母における低酸素の中にすべての遺伝子の mRNA のレベルを測定しました。目標は、制御 - 無酸素環境で成長のためにどのようにグローバル遺伝子発現変動を分析することでした。いくつかの手順は、ここで説明したメソッドが慎重に制御され、再現可能なことを確認に運ばれました。まず、セルの正確に定義された低酸素環境にさらされた: リッチ メディア (YPD) で 99.999% N2 。低酸素症の他の研究がフラスコまたは32を空気管を閉鎖、低酸素・ ミメティック コバルト塩化33を使用または低酸素血症を誘発する嫌気性チャンバーや袋34を採用します。これらの各メソッドは、低酸素血症やその他の意図しない環境の変化のさまざまなレベルであります。野生の酵母より少なく深刻な低酸素状態を経験する可能性がある (例えば90% N2および 10% O2)、混合ガスを系統的に変化させて中の遺伝子発現の研究に有用ででしょう。第二に、エルゴステ ロール、不飽和脂肪酸 (例えば、Tween 80) に追加されませんでした文化メディア以来、前述の導入遺伝子の発現に影響を与える彼ら。第三に、成長のさまざまな段階によって引き起こされる遺伝子発現変動を最小限に抑えるため経験的決定希釈を行ったので、成長 (〜 1-2 107セル/mL x) の中間ログの段階でそれが文化が時間ポイントに達したら。4 番目、クイック フィルタ リングおよび凍結 (~ 15 s) 低酸素状態から削除されている細胞の遺伝子発現変動で発生することができますので重要です < O2セル、遠心分離 (データは示されていない) によって収集されたときに発生するへの暴露の 5 分。無酸素フードまたはチャンバーで細胞の収穫と成長を実行し、セルは O2にさらされている時間を低減されました。第五に、適切なひずみが選ばれましたこの研究;他のゲノムの研究と一致する共通 S288C ラボひずみ背景が採用されました。ただし、S288C 株はhap1の突然変異体の対立遺伝子を含み、従って修理11はあった。これは via Hap1 転写因子11O2レベルに対応するCYC1のような遺伝子の研究を許可されます。
タイム ポイントは、彼らは前の低酸素症実験の大規模な遺伝子発現変動を展示のために選ばれました。ここに示した結果は、今後の実験計画を知らせることができます。たとえばより細かく多様な速度をキャプチャする大きな変化 (例えば、0 から 30 分の低酸素症) を示す間隔中に時間のポイントのより高い解像度を使用すると便利ででしょう。さらに、ここで試金される時間期間 (すなわち、低酸素症の 4 h) を超えて、後のタイム ポイントが表情変化に公開します。
RNA シーケンスは、再現性、広いダイナミック レンジにより大きい倍変更18,35の測定のための mRNA のレベルを測定するために使用されました。RNA は精力的に揺れるビーズを用いた細胞の機械的崩壊により抽出し、列分離精製した.ホット フェノール36など、他の RNA の浄化の方法を使用できます。理想的には、RNA 濃度が 200 ng/μ L - 1000 ng/μ L RNA 濃度を 100 ng/μ L 逆のトランスクリプションそしてライブラリの準備のために薄くなることからの範囲になります。蛍光光度計と RNA 特定色素 RNA 濃度を測定する必要があります。紫外線分光光度計は、RNA と DNA の両方で構成される核酸の濃度を測定するために制限されます。RNA の品質は、ゲルの電気泳動; によって決まりますRNA の劣化を示すスミアとリボソーム RNA バンドはゲルで明確に定義されたはずです。ここで、mrna を濃縮したが、また応答で重要かもしれないこと異なる RNA 型20を隔離するための多様な方法があります。
8 と 12 の間の資源を保存するサンプルが多重し、一緒に 1 車線、各サンプルは、再現性をもって遺伝子ごとの読み取り数を決定するための十分な遺伝子あたり少なくとも 693 読み取りの平均結果のシーケンスします。実際には、以上 12 個の試料 1 車線、ほとんど遺伝子の適切なサンプリングになる多重化される可能性があります。遺伝子あたりの読み取り数を平均を計算するために (HTSeq 出力ファイル) の遺伝子マップ読み取りの総数だった (この研究では、7140) HTSeq に提供された遺伝子の数で割った値。際最低式を示す興味のある遺伝子は一車線で多重化できるサンプルの最大数を推定するには、(すなわち、最小正規化数)、これおよび他の RNA シーケンスの研究からのデータを使用しています。間で遺伝子の正規化された読み取り数が大きく異なる場合、レプリケート、読み取りの数が低すぎる、シーケンス レーン当たり少ないサンプルを多重化する必要があることを示唆している可能性があります。
次世代シーケンシング読み取りおよびその他の情報を含む FASTQ ファイルが生成されます。多重化を行った場合は、バーコードのファイルと追加の FASTQ ファイルが生成されます。これらのファイルは、このプロトコルのように、ローカル解析のためダウンロードすることができます。また、あるいくつかのオンライン次世代シーケンス解析ツールのコマンド ライン ツールまたは R に慣れていない方のためこの点では、銀河 (https://usegalaxy.org/) 37と GenomeSpace (http://www.genomespace.org/) をお勧めします。現在のプロトコルの著者によって書かれている 2 つのスクリプトは FASTQ 処理と発現解析に使用されます。スクリプトはよく注釈し、さまざまな実験的デザインとコンピューターの設定を編集することができます。また、2 つのスクリプトと「材料」の表は、これらのスクリプトで使用するツールをダウンロードするためのウェブサイトを提供します。最初のスクリプトは、"fastq_pipeline.sh"、UNIX/Linux ターミナルのコマンド ・ ラインで実行するシェル スクリプトです。このスクリプトは重複一車線の車線現在サンプルごとに 1 つの FASTQ ファイルを生成する、シーケンサーから得られる読み取りのすべてを含む元の FASTQ ファイルを多重送信します。次に、各 FASTQ ファイルに読み取り、既定設定の21と Trimmomatic を使用してトリミング品質です。トリミングされた読み取り、出芽酵母S288C 参照ゲノム (SGD R64-1-1_20110203) にマップされ、デフォルト設定22TopHat2 を使用します。最後に、スクリプトは HTSeq を使用して、各注釈機能19マップ読み取りの数を決定します。
2 番目のスクリプトでは、"time_course_script。R"はまた著者によって書かれている、R 統計環境24内で実行されます。スクリプト最初に輸入が HTSeq によって生成された読み取り数データです。各サンプルは時間ポイントと見なされます、したがって他の時点を基準にして組織が。Raw 読み取り数は、最初の (すなわち、好気性、時間 0) を基準時点のいずれかで発現される遺伝子を識別するために DESeq2 25、R パッケージにインポートされます。その柔軟性のため、 13時間の関数として式が変更されたかどうかなどの他の統計テストを実行する DESeq2 を使用できます。また、RNA シーケンスのパラメトリック ・非パラメトリック統計を用いたその他のツールを読むカウント データ可能性があります使用される20。スクリプトは、各サンプルのシーケンスの度のコントロールに読み取り数を正規化し、log2 変換カウント。これらの処理された読み取り、主成分分析、各遺伝子の最大のフォールドの変更を決定するため、図 4の式のグラフを作成するを実行する使用されます。
重要な問題は大幅低酸素に対応する遺伝子を識別するために統計を採用する最善の方法です。時間コースの少なくとも 3 つの生物学的複製は、各遺伝子の自然な変動を計算し、偶然予想よりもさらに低酸素に対応する遺伝子を決定するに必要です。また、生物学的複製13,25,38,39せず、時間をかけて対応する遺伝子は正常に識別することが可能です。これらのメソッドの主な欠点をとることはありません考慮各遺伝子の生物学的変動です。ただし、RNA シーケンスの複製を行わない場合個々 の遺伝子発現変動確認でしたを実行して複数の生物と Rt-qpcr 複製13。
応答の複数の時間ポイントを評価する 2 つの主な利点があります。(図 2) を中心に前述したように、まず、時間コースは大きい式変更、追加の時間ポイントが動態の解像度を改善するためにまたはの後で出来事を観察する必要かどうかを知らせる展示間隔を識別、応答。第二に、時間のコースは、各遺伝子の発現動態の分化をことができます。これは、応答の特定の時間で動作するユニークなシグナル伝達経路の特定に役立ち、開始のタイミングと信号の終端に洞察力を与えます。具体的には、ここで行った表現パターンによって遺伝子のクラスタ リング共同調整された遺伝子のセットで起因しました。遺伝子セットのプロモーターは遺伝子表現を変更すると転写因子がアクティブになることを示唆している転写因子結合部位を共有できます。
細胞応答を勉強して、刺激 (例えば、低酸素症) のため、他の実験変数には「観測された変動は理想的。ただし、図 2からわかるように、個々 の研究者やメディア コンポーネントのバッチ、変動への主要な貢献に遺伝子発現。したがって、これらのパラメーターは、最小限の実験的変動と高い再現性を達成するために考慮されなければなりません。実験的変数が時間の経過とともに変更する可能性が高いので、可能な限り短時間は各複製を分ける必要があります。
結論としては、正確に低酸素症の経過中に mRNA のレベル (やヒストン修飾やタンパク質レベルなどその他のイベント) のゲノム変化を監視するこのメソッドを使用できます。メソッドは、他の有機体、液体文化で育つことができる微生物種特に合わせることができます。このような経過もゲノムワイドな解析は細胞の形態、タンパク質の活性と代謝の研究を補完します。一緒に、これらのデータは、細胞応答のより豊かな理解に します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
技術的な助言および RNA ライブラリの準備とシーケンス プリンストン大学統合ゲノミクス シーケンス中核施設、ルイス Sigler 研究所に感謝しますこの作品は、ローワン大学と NIH 日の出 R15GM113187 からの M.J.H. に補助金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1,000 mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500 mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250 mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100 mL) | |||
| 1 mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4 °C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C. | ||
| 2 mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2 mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
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