Method Article

Gemultiplext Immunfluoreszenz Analyse und Quantifizierung der intratumorale PD-1+ Tim-3+ CD8+ T-Zellen

DOI:

10.3791/56606

⸱

February 8th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Studium der Tumor Mikroumgebung kann prognostische und prädiktive Biomarker des klinischen Ansprechens auf Immuntherapie identifizieren. Hier präsentiert, ist eine innovative Methode basierend auf in Situ Fluoreszenz multispektralen imaging, zu analysieren und automatisch verschiedene Subpopulationen von CD8 zählen+ T Zellen. Diese reproduzierbare und zuverlässige Technik eignet sich für große Kohorte Analysen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunzellen sind wichtige Bestandteile der Tumor Mikroumgebung und Tumor-Wachstum und Entwicklung in allen Phasen der Krebsentstehung beeinflussen. Bemerkenswert ist, ist es inzwischen gut etabliert, dass das Immunsystem Infiltrat in menschlichen Tumoren mit der Prognose und ansprechen auf die Therapie korrelieren kann. Die Analyse der immun zu infiltrieren in der Mikroumgebung Tumor ist eine große Herausforderung für die Klassifizierung von Patienten und das Ansprechen auf die Behandlung geworden.

Der Co Ausdruck der inhibitorischen Rezeptoren wie Programm Cell Death Protein 1 (PD1; auch bekannt als CD279), zytotoxischen T-Lymphozyten Associated Protein 4 (CTLA-4), T-Zell-Immunglobulin und Mucin enthält Protein-3 (Tim-3; auch bekannt als CD366) und Lymphozyten Aktivierung-Gen 3 (Lag-3; auch bekannt als CD223), ist ein Markenzeichen der T-Zell-Erschöpfung. Wir entwickelten ein multiparametric in Situ Immunfluoreszenz beflecken, zum identifizieren und quantifizieren des Co Ausdrucks dieser hemmenden Rezeptoren auf zellulärer Ebene. Auf einer retrospektiven Reihe von tiefgefrorenem Gewebe renal Cell Karzinome (RCC), mit einem multispektrale Fluoreszenz-imaging-Technologie gepaart mit einer Bildanalyse-Software, wurde festgestellt, dass Co Ausdruck der PD-1 und Tim-3 auf Tumor infiltrieren CD8+ T Zellen korreliert mit einer schlechten Prognose in RCC. Nach unserem Kenntnisstand entspricht dies die erste Studie, die zeigt, dass diese multiplex in Situ Technologie automatisiert einige klinischen Relevanz haben kann.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In den letzten Jahren hat sich eine sehr vielversprechende Therapie für viele Arten von Krebs, einschließlich RCC Immuntherapie entwickelt. Besonders, Immuntherapie, basierend auf der Hemmung der hemmenden Prüfpunkte wie PD-1 und CTLA-4 wurde berichtet, werden klinisch wirksamen1,2,3,4,5, 6. monoklonale Antikörper gegen CTLA-4, PD-1 oder Programm Tod Liganden 1 (PD-L1) sind bereits in mehreren Krebserkrankungen zugelassen und zu lang anhaltende klinische Reaktionen in mehr als 20 % der Patienten7führen. Dennoch sind nicht alle Patienten Responder, die Kosten der Behandlung sind hoch und diese Behandlungen sind giftig, führt zu möglichen schweren Autoimmun-ähnliche Nebenwirkungen. Daher ist die aktuelle Herausforderung, prädiktive Marker für diese neue Immuntherapien zu identifizieren. Die Rate der Mutationen im Tumor, der Ausdruck der PD-L1 oder die Ebenen der intratumorale CD8+ T-Zell-Infiltration mit klinischem korrelieren gemeldet wurden. Diese Zuordnung ist jedoch immer noch zu schwach, um die Verwendung von diesen klinischen Biomarker in der klinischen Praxis mit Ausnahme der Begleiter-Test für PD-L1 vor der Verabreichung von Pembrolizumab in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) Krebs Patienten8 empfehlen ,9,1011,12. Es wurde nachgewiesen, dass der Co Ausdruck der vielen inhibitorischen Rezeptoren wie PD-1, Tim-3, Lag-3 und CTLA-4, induziert eine Zelle Erschöpfung Phänotyp und Widerstand gegen die Therapie13,14,15. Da peripheren Blut nicht repräsentativ für die Tumor-Mikroumgebung, ist es von großem Interesse für die phänotypische Merkmale der Zellen in Situzu analysieren. PD-1 und Tim-3 zusammen mit dem Ausdruck ihrer T-Zellen sind bekanntermaßen funktionell beeinträchtigt Zellen in mehreren Kontexten13,16,17. In dieser Studie, die prognostische Auswirkungen der Co Ausdruck der zwei inhibitorischen Rezeptoren PD-1 und Tim-3 auf CD8+ T Zellen wurde bewertet.

Bis jetzt, Studium des Co Ausdrucks mehrere Markierungen auf Tumor infiltrieren Lymphozyten (TILs) wurde vor allem durch Flow Cytometry Analyse, macht es notwendig, auf frischen Tumoren und daher Ausschaltung Retrospektive Analysen arbeiten durchgeführt. Mit konventionellen in Situ beflecken, nur eine Färbung zu einem Zeitpunkt ausgeführt werden kann, und die Charakterisierung des Zelltyps, die die Marker Co ausdrückt ist nicht möglich. Z. B. PD-L1 drückt sich durch viele Zelltypen der Tumor Mikroumgebung, durch konventionelle immunhistochemische Analyse festlegen, welche Zellen mit dem Ausdruck PD-L1 desto relevanter für korrelative Studien erschwert. In dieser Arbeit entwickelten wir eine innovative in Situ multiparametric Immunfluoreszenz-Methode mit Computer zählen, um Co Ausdruck der PD-1 und Tim-3 durch Tumor infiltrieren CD8 korrelieren+ T-Zellen mit klinischen Resultaten im RCC. Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile, einschließlich der Möglichkeit, auf eine einzelne Zellenebene und mehrere Markierungen gleichzeitig mit einer multispektralen Kamera, die eingeschränkte Intervallen erfassen können zu analysieren > 10 nm durch Flüssigkristall filtert18. Darüber hinaus ist das Verfahren automatisch eine Inter-Operator-Reproduzierbarkeit und eine verkürzte Analyse im Vergleich zu manuellen Techniken19ermöglicht. Im Bereich Krebs berichteten mehrere Studien überzeugend mehrere Färbungen von immun-Moleküle wie PD-1, PD-L1 und CD8 in Merkel-Zell-Karzinom, Lungenkrebs und Kopf und Nacken Krebs20,21,22, 23. die automatisierte Zellzahl ist möglich mit der Ausbildung durch den Benutzer (Phänotypisierung Schritt). Die Fluoreszenz wird in die andere Zelle Fächer (Zellkerne, Zytoplasma und Membran) gemessen.

Hier, verschiedene Teilmengen der Tumor-Infiltration von CD8+ T-Zellen mit dem Ausdruck Ihrer PD-1 und/oder Tim-3 in einer großen Kohorte von RCC wurden gezählt und die Ergebnisse wurden mit klinischen Schwerkraft Partituren und überleben Parametern korreliert. Es war auch möglich, Membran Fluoreszenz-Intensität in der zellulären Auflösung bedeuten Fluoreszenz Intensität (MFI) Daten wie Zytometrie zu analysieren. Soweit wir wissen, ist dies die erste Berichterstattung prognostische Studienergebnisse mit dieser multispektralen imaging basierend Graf-Technik.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde durchgeführt in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki und wurde von der lokalen Ethikkommission (CPP-Ile-de-France nr. 04 / 05 / 2012) genehmigt. Die Einwilligung wurde aus der Teilnehmer in den Kohorten enthalten.

(1) Gewebematerial

  1. RCC Gewebeproben am Tag der Operation zu sammeln. Die chirurgische Probe bei Raumtemperatur (Pathologie Abteilung) zu behandeln.
  2. Eine Tumorprobe von ca. 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm Größe in einem Trockenrohr zu sammeln. Snap in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° c lagern
  3. Bestreichen Sie die Proben in optimale Arbeitstemperatur zusammengesetzte. Teilen Sie die Proben mit einem Kryostaten bei-20 ° C in 4-6 µm dicke Abschnitte. Lassen Sie die Proben an der Luft trocknen auf Folien für 12 h und speichern sie direkt bei-80 ° C um Austrocknung zu vermeiden.
  4. Überprüfen Sie die Qualität der Probe durch Anzeigen einer Hämatoxylin und Eosin befleckt Abschnitt.

2. in Situ Immunfluoreszenz-Färbung von TILs

  1. Verfahrensrichtlinien
    1. Alle experimentellen Schritte bei Raumtemperatur.
    2. Führen Sie für alle Schritte die Verdünnungen mit Tris-Puffer Kochsalzlösung (TBS; siehe Tabelle of Materials).
    3. Durchführen Sie das Waschen in TBS für alle außer nach der primären Antikörper Inkubationszeit. Für Letzteres verwenden Tris-Puffer Kochsalzlösung Tween20 (TBST, siehe Tabelle der Materialien). Für Puffer Zusammensetzung und Rekonstitution siehe ergänzende Tabelle1.
    4. Verwenden Sie eine feuchte Kammer für Antikörper Inkubationen und eine Färbung Gefäß zum Waschen.
    5. Lassen Sie nicht im Abschnitt während des Verfahrens austrocknen.
  2. Vorbehandlung
    1. Tauen Sie die Folie mit der Gewebeprobe und trocknen Sie vorsichtig die Folie um die Probe mit einem Papiertuch. Die Reaktionsfläche, enthält das Gewebe mit einem Stift hydrophobe Barriere abgrenzen (siehe Tabelle der Materialien). 2 min. trocknen lassen.
    2. Korrigieren Sie die Proben in 100 % Aceton für 5 min, 2 min, trocken und mit TBS für 10 min waschen.
  3. Sättigung und blockade
    1. Die Folien für 10 min mit 3 Tropfen von Avidin 0,1 % vorbehandeln, Hahn und/oder Streifen der Folie zu verteilen das Avidin und Luftblasen zu entfernen und dann für 10 min mit 3 Tropfen von Biotin 0,01 % zu behandeln (siehe Tabelle der Materialien), tippen oder streichen. Waschen mit TBS.
    2. Führen Sie eine Fc-Rezeptoren-Blockade. 100 µL einer 5 % Volumen/Volumen des normalen Serum in TBS Verwendung Serum aus der gleichen Wirtsarten als der beschriftete Antikörper sekundäre oder tertiäre verdünnt anwenden (siehe Tabelle der Materialien); Hier wurde Esel Serum verwendet. 30 min inkubieren.
    3. Während der Inkubation kurz drehen Sie die Anti-CD8, PD-1 und Tim-3 Antikörper (Table of Materials). Bereiten Sie die Mischung aus primären Antikörper in TBS wie in ergänzenden Tabelle 2beschrieben.
  4. Immuno-Färbung für CD8, PD-1 und Tim-3
    1. Bereiten Sie die primären Antikörper-Mischung. Siehe Tabelle der Werkstoffe und ergänzenden Tabelle 2 für verwendeten Antikörper (Anti-CD8, PD-1, Tim-3 und ihre entsprechenden Sekundärantikörper) und deren Konzentrationen.
    2. Tippen Sie auf und/oder wechseln Sie die restlichen Esel-Serum (in Schritt 2.3.2 hinzugefügt). Inkubieren Sie die Folien mit 100 µL Primärantikörper nicht beschriftet-Mix für 1 h in eine feuchte Kammer.
    3. Während der Inkubation kurz drehen Sie die Cyanin 5 Anti-Kaninchen, AF488-Anti-Ziege und biotinylierte Anti-Maus-Antikörper, und bereiten Sie die Mischung aus Sekundärantikörper wie in ergänzenden Tabelle 2beschrieben.
    4. Waschen Sie den Folien in TBST für 5 min. trocken Folien.
    5. Inkubieren Sie die Folien mit 100 µL der sekundären Antikörper für 30 min in eine feuchte Kammer.
    6. Bereiten Sie die Mischung aus tertiären Antikörper, Cy3-Streptavidin enthält, wie in ergänzenden Tabelle 2beschrieben.
    7. Waschen Sie den Folien in TBS für 10 min. trocknen die Objektträger.
    8. Inkubieren Sie die Folien mit 100 µL der tertiären Antikörper Mischung für 30 min.
    9. Waschen Sie den Folien in TBS für 10 min. trocknen die Objektträger.
  5. Handy-Halterung
    1. Montieren Sie die Folien in einer 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride DAPI-haltigen Montage Medium (1,5 µg/mL DAPI) mit einem Deckgläschen kompatibel für Fluoreszenz-Mikroskopie (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: Als Negativkontrolle für jedes Experiment, eine Folie mit Antikörper Isotype abgestimmt wurde bei der gleichen Konzentration als entsprechende Antikörper verwendet. Für diese Färbung benutzten wir Maus IgG1, Kaninchen IgG und Ziege IgG negativ-Kontrolle-Antikörper (siehe Tabelle der Materialien). Als Positivkontrolle verwendet wir menschliche hyperplasic Tonsillen, die positiv für die getesteten Marker für jedes Experiment bekannt ist. Eine typische Färbung wird in den Ergebnissen (Abbildung 1) beschrieben. Mono-Färbung der CD8, PD-1 und Tim-3 durchgeführt werden einzeln (eine Färbung pro Folie) mit der gleichen Vorbehandlung und ohne DAPI. Eine Folie in der gleichen Versuchsbedingungen ohne Antikörper und nur DAPI Eindeckmedium sollte auch durchgeführt werden. Eine Folie sollte mit identischen Versuchsbedingungen ohne irgendwelche Antikörper und DAPI abgebildet werden.

3. die Fluoreszenzanalyse und automatisierte Zellzahl

  1. Bildaufnahme mit dem automatisierten Mikroskop
    1. Erstellen Sie ein Protokoll.
      1. Die automatisierte Mikroskop-Software und der Fluoreszenz-Beleuchtung einschalten.
      2. In der Menüleiste klicken Sie auf "Datei", "Protokoll erstellen" wählen Sie "DAPI," "FITC" und "TRITC."
      3. Klicken Sie auf "Next", "Gewebekapitel", und klicken Sie auf "Weiter", "Protokollname." Wählen Sie einen Namen, beispielsweise "CD8-PD-Tim-1-3," klicken Sie auf "Next" und "Speichern".
      4. Manuell legen Sie eine Folie auf der Bühne.
      5. Klicken Sie in der Menüleiste auf "setup", "Einstellungen". Klicken Sie in dem neuen Fenster auf "set home Z".
      6. Passen Sie die Belichtungszeit mit einer positiven Kontrolle schieben, d. h. eine CD8, PD-1 und Tim-3 Dreifach-gebeizt mit DAPI-Probe.
      7. Klicken Sie in der Steuerleiste auf "Kontakt."
      8. Passen Sie die Belichtungszeit für jeden Filter, bis eine ausreichende aber nicht sättigbaren Signal erhält.
      9. Gehen Sie für monochrome Bilder wie folgt vor:
      10. Wählen Sie Erwerb und wählen Sie unter "Autofokus" DAPI-Filter.
      11. In der "Scan-Bereich zu begrenzen" wechseln Sie objektiven oben an der oberen linken Ecke der Folie Klicken Sie auf "Markieren". Machen Sie dasselbe für die untere rechte Ecke.
        Hinweis: Dieser Schritt delimitates Bereich der low-Power imaging (LP-Tomographie) bei 4 X; Achten Sie beim Platzieren der Markierung auch so, die Proben der Baureihe umgeben.
      12. Gehen Sie für hohe Leistung (HP) imaging wie folgt vor:
      13. Wählen Sie unter "Autofokus" "DAPI".
      14. Wählen Sie unter "Erwerb" Band "DAPI", "FITC", "Cy3" und "Cy5". Klicken Sie auf "OK". Klicken Sie auf der Menüleiste "Datei", "Save Protocol".
    2. Die Dias zu scannen.
      1. Laden Sie das Protokoll, indem Sie auf "Datei", "Protokoll" aus der Menüleiste laden. Klicken Sie auf "Start".
      2. Geben Sie "Lab ID" (Ordnerspeicherort für Bildspeicher). Geben Sie die Folien-ID um die Folie zu identifizieren. Klicken Sie auf "Weiter".
      3. Klicken Sie auf "Monochrom Imaging" (um zu scannen die ganze Folie unter Hellfeld Licht und aufeinander folgenden Bildern mit einer 4 X Objektiv zu erwerben).
        Hinweis: Dies führt zu eine Graustufen-Übersicht der Folie.
      4. Klicken Sie auf "Muster finden". Wählen Sie den Bereich des Gewebes mit einer niedrigen Auflösung (4 X) gescannt werden: halten Sie die "Strg"-Taste, und klicken Sie auf ein Feld mit dem Cursor auswählen oder deaktivieren Sie die Option Felder (Abbildung 2A).
      5. Fluoreszierend Rot blaugrün Bildaufnahme der einzelnen Felder klicken Sie auf "LP Imaging" (4 x Bildgebung).
      6. Für HP-Feldauswahl "Strg"-Taste gedrückt und klicken Sie auf ein Feld mit dem Cursor zu aktivieren bzw. deaktivieren Felder, die zum Bereich der Gewebe entsprechen, die in hoher Auflösung (20 X) gescannt werden. Wählen Sie 5 Felder (Abb. 2 b).
      7. Klicken Sie auf "HP Imaging" (20 x Bildgebung) für Multispektrale Bilderfassung der einzelnen Felder (Abbildung 2).
      8. Klicken Sie auf "Datenspeicher" zum Speichern von Bildern im Ordner "", die am Anfang im LabID ausgewählt wurde.
        Hinweis: Der Prozess ist zusammengefasst und in Abbildung 2dargestellt. Für jeden Schritt (Erkennung von Gewebe, Feldauswahl) kann ein Algorithmus inkrementiert und geschult durch den Benutzer für eine gesamte automatische Scan-Vorgang.
  2. Fluoreszenz-Bildanalyse und automatisierter Zelle zählen mit gekoppelte Analysesoftware
    1. Die spektrale Bibliothek zu bauen.
      1. Die Bildanalyse-Software zu öffnen.
      2. Öffnen Sie auf der linken Seite "Bibliotheken bauen". Klicken Sie unter "Load Image" auf "Durchsuchen" und wählen Sie ein Mono-gefärbten Bild (z.B.CD8/Cyanin 5).
      3. Wählen Sie das Fluorophor (z.B.Cyanin 5). Klicken Sie auf "extrahieren". Klicken Sie auf "Speichern" in Bibliothek speichern. Klicken Sie auf "Speichern".
      4. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für PD-1, Tim-3 und DAPI Mono-gefärbten Folien um das Spektrum der jedes Fluorophor des Interesses zu integrieren.
        Hinweis: Aufbau der spektralen Bibliothek integriert das Spektrum für jeden Fluorophor verwendet für das spezifische Gewebe (hier: Niere), aber "synthetische" Bibliotheken, die bereits existieren können verwendet werden. Da die Autofluoreszenz Spektrum streng bezogen auf das Gewebe ist, ist es wichtig, ein Auto-Fluoreszenz und spektralen Bibliothek pro Projekt durchzuführen.
    2. Erstellen Sie ein neues Projekt.
      1. Klicken Sie in der Menüleiste "Datei", "Neues Projekt". Wählen Sie in der Registerkarte "Funktion" suchen "" ""Zelle Segmentierung". Wählen Sie im Register "Phänotypisierung" "Phänotypisierung". Klicken Sie auf "Erstellen".
      2. Die repräsentative Bilder in das Projekt zu integrieren.
        1. Klicken Sie in der Registerkarte "Datei" auf "Bild öffnen". Wählen Sie 10 bis 30 repräsentative Bilder der ganzen Serie. Fügen Sie die Folie nicht befleckt, um Autofluoreszenz entfernen. Auf der rechten Seite: Sammlung auswählen Quelle. Fluorophor und wählen Sie die entsprechenden spektralen Bibliothek zuvor gebaut.
      3. Wenn Gewebe Autofluoreszenz entfernen möchten, klicken Sie auf "AF" und wählen Sie dann den Bereich der Autofluoreszenz auf der leeren Folie.
      4. Bild-Behandlung und zusammengesetzte Bilderzeugung.
        1. Klicken Sie auf "Alle vorbereiten", um die Fluoreszenz-Bibliothek und die Autofluoreszenz-Spektren zu erzeugen das zusammengesetzte Bild (Abbildung 3) zu integrieren. Klicken Sie auf das Symbol "Auge" öffnen Sie das Bedienfeld "Ansicht-Editor" und wählen die angezeigten Daten: Wählen Sie die Marken CD8, PD-1, Tim-3 und DAPI. Entfernen Sie die Autofluoreszenz. Folgen Sie den Schritten, die von der Software vorgestellt.
      5. Segment der Zellen.
        1. Um die Zellen, in "Fach" segmentieren wählen Sie aus "Kerne" und "Membran". Im Register "Kerne" DAPI als die nuklearen Gegenfärbung festgelegt.
        2. Geben Sie in der Registerkarte "Maximale und Minimalgröße (px)" "40" und "176" als minimalen und maximalen Größen bzw.. Legen Sie für "Minimum" Signal "0,13". "Split" Registerkarte "set"2,60". "Kerne" Registerkarte "set"0,81". Wählen Sie "Membran-Signal um Segmentierung zu unterstützen".
        3. Klicken Sie auf "Segment Zellen" im Unterteil des Bildschirms. Überprüfen Sie die Segmentierung der Kerne und Membranen der Zellen und mit unterschiedlichen Parametern zu wiederholen Sie, wenn sie nicht die DAPI und Membran Fluoreszenz der Zellen entspricht.
          Hinweis: Die Software erkennt die Zellen mit den nuklearen DAPI Färbung und basierend auf der Zellengröße. Passen Sie die Zellenparameter (Größe, Split, Pixel) nach dem Projekt.
      6. Phänotyp der Zellen.
        1. Klicken Sie im Register "Phänotyp" auf "hinzufügen". Zelle Phänotyp Kategorien erstellen: CD8 (blauer Punkt) / CD8-PD-1 (roter Punkt) / CD8-PD-1-Tim-3 (grüner Punkt) / andere (schwarzer Punkt) (Abbildung 4).
        2. Wählen Sie aus mehr als 5 Beispiele für Zellen der einzelnen Kategorien. Klicken Sie auf "Train Klassifikator".
          Hinweis: Dadurch wird einen statistische Klassifikation-Algorithmus von der Software generiert.
        3. Klicken Sie auf "Alle Phänotyp", um den Phänotyp der einzelnen Zellen zu erhalten.
          Hinweis: Die Software gibt den Phänotyp einer Zelle mit einem Konfidenzintervall (CI) Genauigkeit.
        4. Den Algorithmus wird gesteigert, die Software training, bis die Differenz zwischen Auge und automatisierte Graf konkordante beträgt (Fehler < 5 %). Wählen Sie eine CI, die akzeptabel für die Zellen von Interesse ist.
          Hinweis: Wir entschieden uns für die Ausbildung auf der Grundlage von 55 % CI als akzeptabel zu machen.
      7. Speichern Sie den Algorithmus und Projekt.
      8. Wählen Sie unter "Datei" "Projekt". Nennen Sie es und klicken Sie auf "Speichern".
    3. Führen Sie Batch Analyse der Serie.
      1. Wählen Sie "Batch-Analyse". Wählen Sie das Projekt. Fügen Sie die Bilder zu analysieren. Wählen Sie einen Ordner von Speicher für die Daten. Klicken Sie auf "Ausführen". Überprüfen Sie die Qualität des zusammengesetzten Bildes. Überprüfen Sie die Phänotypisierung für alle Bilder der Serie.
        Hinweis: Die gekoppelten Bildanalyse-Software integriert alle Zelle Fächer (Membran/Zytoplasma/Kerne) Signale. Die Phänotypisierung Schritt ist entscheidend, wenn auch das Training des Algorithmus eine zeitaufwendige Schritt sein kann. Alle Daten der einzelnen Bilder werden in einer txt-Datei. Die Daten einer Zelle (besonders der Phänotyp mit seiner CI gegeben) sind in einer Zeile. Für jede Folie wurden die Bildaufnahme und späteren Grafen auf 5 Feldern durchgeführt.
  3. Integration der Rohdaten und Generation von automatisierten Zellzahl
    1. Berechnen Sie die Daten mit einem statistischen Programm.
      1. Berechnen Sie die Daten aus den 5 Bildern entsprechend der 5 Felder auf 1 Patienten analysiert. Verwenden Sie eine statistische Plattform, und haben ein erfahrener Statistiker, Data Manager oder Datenwissenschaftler die Analyse durchzuführen. Erstellen Sie eine Skript, die automatisch die Zellen je nach ihrer Phänotyp, Auswahl der CI > 55 % zählt.
      2. Setzen Sie alle txt-Dateien der Serie im gleichen Ordner.
    2. Die Daten zu extrahieren.
      1. Setzen Sie alle txt-Dateien in einem Ordner. Das automatische Skript in Schritt 3.3.1 gebaut. Öffnen Sie die Ausgabe-CSV-Datei durch das R-Skript erzeugt. Als .xl Format speichern. Die Ausgabe erfasst die Anzahl der Zellen für jedes Phänotyp (d.h., CD8 allein, CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) für jeden Patienten.
      2. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von Zellen für jeden Patienten pro Feld: Teilen Sie die Anzahl der Zellen pro die Anzahl der Felder (d. h.5), die Anzahl der Zellen für jeden Patienten pro Feld zu normalisieren.
      3. Berechnung des Prozentsatzes der PD-1+ Zellen unter insgesamt CD8+ T, und Tim PD-1+ -+ 3 Zellen unter insgesamt CD8+ T Zellen. Siehe Abbildung 5 für diesen Schritt im Überblick.
        Hinweis: R Sprache (oder andere Programmier-Software der Wahl) ist erforderlich, um korrekt zu erstellen und die Befehle ausführen, und ein erfahrener Benutzer oder Statistiker/Daten Wissenschaftler ist also unerlässlich. Das R-Programm kann die Daten des gleichen Patienten berechnen sollte, aber die Namen der 5 .txt Dateien eines Patienten einen identischen Anfang, einen eindeutigen Bezeichner der Patienten entsprechend.
  4. Statistische Analyse
    1. Verwenden Sie Statistiksoftware für die statistische Auswertung der Ergebnisse.
    2. Führen Sie entsprechende statistische Analysen mit Hilfe der Statistiker.
      1. Verwendung der nicht-parametrische Wilcoxon unterzeichnet Rang Tests zum Vergleich von PD-1 MFI zwischen zwei Zelle Phänotypen (Abbildung 6). Korrelieren Sie die Kovariate und histologischen Merkmale mit einem Pearson-Chi-Quadrat-Test.
      2. Verwenden Sie eine Kaplan-Meier-Methode zur Schätzung der Progression free Survival und Cox Regressionsmodelle, die Kovariate Auswirkungen auf Zeitereignis-Ergebnisse, wie die Gesamtüberlebenszeit und krankheitsfreien Überlebens zu schätzen.
      3. Prüfen, p-Werte als 0,05 als signifikant zu senken.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Über das allgemeine Protokoll beschriebenen, wir wollten intratumorale CD8 quantifizieren+ T-Zellen die hemmenden Rezeptoren PD-1 und Tim-3 im gefrorenen Gewebe von Patienten mit RCC und die Ergebnisse korrelieren mit klinischen Ergebnisse25Co zum Ausdruck zu bringen.

Optimierung der CD8/PD-1/Tim-3 Färbung:

Verschiede...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modifikationen und Fehlerbehebung:

Die Gewebe-Qualität ist ein wichtiger Parameter. Es kann leicht von Hämatoxylin und Eosin Färbung überprüft werden.

Ein Vorteil des Verfahrens ist die Möglichkeit der gemultiplexten Keramikschalen, aber zur Vermeidung von Fluorophor Spillover empfohlen, um Emission Wellenlängen mit Delta von 10 nm mindestens zu wählen. Hier, weil wir 4 Keramikschalen einschließlich DAPI hatten, wir entschieden uns für die Wellenlän...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse vom Institut National du Cancer (INCA) (ET), Ligue Contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex Immuno-Onkologie (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET). EdG wurde durch ein Stipendium der Fondation ARC finanziert. EV und CD wurden durch ein Stipendium der APHP (Bourse Année recherche) finanziert. ChB ist durch ein Stipendium der Université Sorbonne Paris Cité (Contrat Doktoranden) finanziert. Die Autoren danken Bristol-Myers Squibb für ihre Finanzierung in diesem Projekt. Die Autoren danken die Abteilung für Pathologie des Hopital Européen Georges Pompidou und Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel und Gisèle Legall). Die Autoren danken die Histologie-Plattform von PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Vectra 3 Automatisierte quantitative Bildgebung in der PathologiePerkin ElmerCLS142338 inForm-Zellanalyse
2.1.Perkin ElmerCLS135781
R Softwarehttps://www.r-project.org
Dakopen TrennstiftDakoS2002
Tris Buffer Salin TBS TablettenTakara, Bio Inc.TAKT9141ZpH7,6 100 Tabletten
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)Takara, Bio Inc.TAKT9142ZpH 7,6 100 Tabletten
Biotin BlockierungssystemDakoX0590Avidin 0,1% und Biotin 0,01%
normales EselsserumJackson Immunoresearch017-000-0015% vol./vol. Konzentration
Fluoroshield mit DAPISigma-aldrichF60571,5 µ g/mL Konzentration
Knittel GlasdeckglasKnittel Glä ser,10003924x60 mm 100 Deckgläser
Kaninchen Anti-CD8 Klon P17-VnovusNBP1-79055Einsatz bei 4µ g/mL
Maus anti-PD-1 Klon NATabcamab52587Verwendung bei 2 & Mikro; g/mL
Ziege Anti-Tim-3R& DAF2365Einsatz bei 3 & Mikro; g/mL
Kaninchen Anti-PD-L1 Klon SP142Roche7309457001Anwendung bei 1 & Mikro; g/mL
Maus AF647 markiert pan- Keratin Klon C11Cell Signalling4528Verwendung bei 0,5 & Mikro; g/mL
Ziege anti-human gal9R& DAF2045Verwendung bei 0,3 &μ; g/mL
Cyan 5 konjugierter Esel Anti-KaninchenJackson Immunoresearch711-175-152Verwendung bei 5 & Mikro; g/ml
biotinyliertes F(ab" 2) Esel Anti-Maus IgGJackson Immunoresearch715-066-150Verwendung bei 3 & Mikro; g/mL
Alexa Fluor488 konjugierter Esel Anti-Ziegen IgGabcamab150133Verwendung bei 5 & Mikro; g/mL
Cy3-markiertes StreptavidinAmershamPA43001Anwendung bei 3 & Mikro; g/mL
Negativkontrollmaus IgG1DakoX0931Verwendung bei 2 & Mikro; g/mL
IgG aus ZiegenserumSigma-aldrichI5256Anwendung bei 3 & Mikro; g/mL
IgG aus KaninchenserumSigma-aldrichI5006Anwendung bei 4µ g/mL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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