Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

מרובב ניתוח Immunofluorescence, כימות של CD8 טים-3+ PD-1+ Intratumoral+ T תאים

Published: February 8, 2018 doi: 10.3791/56606
Automatic Translation
1, 2,3,4, 2,3, 2,3, 2,3,5, 6, 7, 2, 2, 2, 2,3,6, 8, 2,3, 4, 2,6, *4, *2,4
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou
* These authors contributed equally

Summary

לומד microenvironment הגידול עשוי לזהות סמנים ביולוגיים prognostic או ניבוי של תגובה קלינית חיסוני. המוצג כאן, שיטה חדשנית מבוסס על בחיי עיר פלורסצנטיות מולטי ספקטריאליות הדמיה לנתח ולספור באופן אוטומטי שונים subpopulations של CD8+ T תאים. טכניקה זו אמינה הדירים מתאים עוקבה גדול ניתוחים.

Abstract

תאים חיסוניים להשפיע על צמיחת הגידול וההתפתחות בכל שלבי carcinogenesis הינם מרכיבים חשובים של microenvironment הגידול. ראוי לציין, היא עכשיו מבוססת היטב כי לחדור מערכת החיסון האנושית גידולים יכולים לתאם עם הפרוגנוזה והתגובה לטיפול. הניתוח של לחדור המערכת החיסונית ב microenvironment הגידול הפך לאתגר מרכזי עבור הסיווג של המטופלים ואת התגובה לטיפול.

הביטוי שיתוף של רצפטורים מעכבים כגון תוכנית לתא המוות חלבון 1 (PD1; ידוע גם בשם CD279), ציטוטוקסיות לימפוציטים-T הקשורים חלבון 4 (CTLA-4), T-Cell בנוגדנים ו Mucin המכיל חלבון-3 (טים-3; ידוע גם בשם CD366) ו לימפוציטים הפעלת גנים 3 (לג-3; ידוע גם בשם CD223), מהווה סימן היכר של תא T תשישות. פיתחנו immunofluorescence של multiparametric בחיי עיר מכתים כדי לזהות ולכמת ברמה התאית הביטוי שיתוף של רצפטורים אלו מעכבות. על סדרה רטרוספקטיבית של רקמות קפוא של תאי הכליה קרצינומה (RCC), תוך שימוש בטכנולוגיה הדמיה מולטי ספקטריאליות קרינה פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח תמונה התוכנה, זה נמצא את הביטוי שיתוף של PD-1 וטים-3 על הגידול שחדר CD8+ T תאים הוא מתואם עם פרוגנוזה גרועה אצל RCC. לידע שלנו, המייצג את המחקר הראשון הוכחת כי זה אוטומטית מולטיפלקס באתרו בתוך טכנולוגיה שיש כמה הרלוונטיות הקלינית.

Introduction

בשנים האחרונות, התפתחה חיסוני לטיפול בסוגים רבים של סרטן, כולל RCC מבטיח מאוד. במיוחד, חיסוני בהתבסס על עיכוב של מחסומים מעכבות כמו PD-1, CTLA-4 דווחה יהיה יעיל קלינית1,2,3,4,5, 6. נוגדנים חד-שבטיים כנגד CTLA-4, PD-1, או תוכנית מוות ליגנד 1 (PD-L1) כבר אושרו ב סרטן מספר ולהוביל לתגובות הקליניות לאורך זמן יותר מ 20% של חולים7. למרות זאת, לא כל המטופלים המגיבים, העלות של הטיפול היא גבוהה, טיפולים אלה הם רעילים, המוביל אל תופעות לוואי כמו מחלה אוטו-אימונית רציני. לכן, האתגר הנוכחי הוא לזהות סמנים חזוי כדי immunotherapies החדשים האלה. קצב מוטציות הגידול, הביטוי של PD-L1 או רמות intratumoral CD8+ תא T הסתננות דווחו לתאם עם תגובה קלינית. עם זאת, עמותה זו היא עדיין חלשה מכדי ממליצים על השימוש אלה סמנים קליניים הקלינית חוץ המבחן לוויה עבור PD-L1 לפני הנהלת Pembrolizumab תאים לא קטנים הריאה סרטן (NSCLC) חולים8 ,9,-10-11,-12. זה הוכח כי הביטוי שיתוף של רצפטורים מעכבים רבים כמו PD-1, טים-3, לג-3 ומשרה CTLA-4, של פנוטיפ תשישות תא והתנגדות טיפול13,14,15. מאז דם היקפיים אינה מייצגת microenvironment גידול, זה עניין גבוהה כדי לנתח את התכונות פנוטיפי של תאים בתוך באתרו. PD-1 וטים-3 תאים T משותפת לביטוי ידועים להיות תאים פונקציונלית לקוי מספר הקשרים13,16,17. מחקר זה, ההשפעה prognostic של ביטוי משותף של קולטני מעכבות שני PD-1 ו- 3 טים-CD8+ T תאים הוערך.

עד עכשיו, לומד את הביטוי משותף של מספר סמני הגידול שחדר לימפוציטים (הפדגוגי) בוצעה בעיקר על-ידי ניתוח cytometry זרימה, ולכן יש צורך לעבוד על גידולים טריים וניתוחים רטרוספקטיבי ולכן מסלק. עם קונבנציונאלי בחיי עיר מכתים, צביעת אחד בלבד בכל פעם יכול להתבצע, אפיון סוג התא שותף שיבטא את סמני אינה אפשרית. לדוגמה, PD-L1 מבוטא על ידי סוגי תאים רבים microenvironment tumoral, ולכן קשה להגדיר על-ידי ניתוח קונבנציונלי אימונוהיסטוכימיה התאים לבטא PD-L1 הם רלוונטיים יותר ללימודי correlative. בעבודה זאת, פיתחנו שיטה multiparametric immunofluorescence חדשנית בחיי עיר עם ספירת המחשב לתאם הביטוי שיתוף של PD-1 וטים-3 על ידי גידול שחדר CD8+ תאי-T עם התוצאות הקליניות של RCC. טכניקה זו היא בעלת מספר יתרונות, כולל את האפשרות לנתח ברמה של תא בודד, מספר סמני במקביל באמצעות מצלמה מולטי ספקטריאליות אשר יכול ללכוד במרווחי זמן מוגבל > 10 ננומטר דרך גביש נוזלי מסנן18. יתר על כן, התהליך הוא אוטומטי אשר מאפשר הפארמצבטית בין המפעיל של ניתוח מקוצרת לעומת טכניקות ידניות19. מספר מחקרים בתחום הסרטן, דיווח משכנע stainings מרובים של מולקולות מערכת החיסון כמו PD-1, PD-L1 ו CD8-מרקל קרצינומה, סרטן ריאות, ואת הראש והצוואר סרטן20,21,22, 23. ספירת אוטומטיות אפשרי עם הכשרה על-ידי המשתמש (שלב phenotyping). ידי קרינה פלואורסצנטית נמדד על תאים תאים שונים (גרעינים ציטופלזמה, ממברנה).

הנה, קבוצות משנה שונים של גידולים הסתננות CD8+ T תאים לביטוי PD-1 ו/או טים-3 במדגם גדול של RCC נספרו, התוצאות היו בקורלציה עם ציונים הכבידה קליניים ופרמטרים הישרדות. גם ניתן היה לנתח ממברנה עוצמת קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה הסלולר עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית מתכוון (MFI) נתונים כמו cytometry. עד כמה שידוע לנו, זה מייצג הראשון דיווח prognostic תוצאות המחקר בעזרת טכניקה המבוססת על ספירת הדמיה מולטי ספקטריאליות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם הצהרת הלסינקי, שאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (CPP Ile de France. ע נ. 2012-05-04). הסכמה מדעת הושג מהמשתתף כלול את גדודים.

1. רקמות חומר

  1. לאסוף דגימות רקמה RCC ביום של הניתוח. להתמודד עם הדגימה כירורגי בטמפרטורת החדר (המחלקה לפתולוגיה).
  2. לאסוף דגימת גידול של 0.5 ס מ x 0.5 ס מ x 0.5 ס מ גודל צינור יבש. הצמד להקפיא במצב חנקן נוזלי ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
  3. מעיל הדגימות בטמפרטורה אופטימלית חיתוך המורכב. בסעיף הדגימות עם cryostat ב-20 ° C 4-6 חלקים עבה מיקרומטר. תן את דגימות אוויר יבש על שקופיות עבור 12 שעות ולאחסן אותן ישירות ב- 80 ° C כדי להימנע לייבוש.
  4. בדוק את איכות המדגם על-ידי הצגת Hematoxylin וחדר אאוזין צבעונית סעיף.

2. בחיי עיר Immunofluorescence כתמים הפדגוגי

  1. הנחיות מנהליות
    1. בצע את כל השלבים ניסיוני בטמפרטורת החדר.
    2. עבור כל השלבים, לבצע את דילולים עם טריס מאגר מלוחים (TBS; ראה טבלה של חומרים).
    3. ביצוע לשטוף את TBS עבור כל הצעדים חוץ לאחר הדגירה נוגדן ראשוני. עבור האחרון, להשתמש טריס מאגר מלוחים Tween20 (TBST, ראה טבלה של חומרים). מאגר הרכב, שיחזור ראה משלימה טבלה 1.
    4. השתמש תא לחות נוגדן incubations וצנצנת מכתימים לרחצה.
    5. אל תתנו את המקטע להתייבש במהלך ההליך.
  2. רעלני
    1. להפשיר את השקופית המכילה את דגימת רקמה ויבש בקפידה את השקופית סביב הדגימה עם מגבת נייר. Delimitate אזור התגובה הכולל את הרקמה עם עט הידרופובי המכשול (ראה טבלה של חומרים). יבש למשך 2 דקות.
    2. לתקן את הדגימות אצטון 100% למשך 5 דקות, יבש למשך 2 דקות, ולשטוף עם TBS למשך 10 דקות.
  3. רוויה ומצור
    1. Pretreat השקופיות 10 דקות עם 3 טיפות של אבידין 0.1%, ברז ו/או פליק השקופית כדי להפיץ את אבידין להסיר בועות אוויר ולאחר מכן לטפל עבור 10 דקות עם 3 טיפות של ביוטין 0.01% (ראה טבלה של חומרים), הקש על, ו/או קפיצי. לשטוף עם TBS.
    2. לבצע המצור רצפטורים של Fc. החל µL 100 של 5% נפח/נפח של סרום נורמלי מדולל TBS. שימוש בסרום של המארח מאותו המין כמו הנוגדן שכותרתו משנית או שלישוני (ראה טבלה של חומרים); . הנה, סרום החמור היה בשימוש. תקופת דגירה של 30 דקות.
    3. במהלך הדגירה, ספין בקצרה את אנטי-CD8 PD-1, טים-3 נוגדנים (טבלה של חומרים). הכינו את התמהיל של נוגדנים ראשי ב- TBS כפי שמתואר משלימה בטבלה 2.
  4. מכתים חיסונית של CD8, PD-1 וטים-3
    1. להכין לתערובת נוגדן ראשוני. עיין בטבלה של חומרים , משלימה בטבלה 2 עבור הנוגדנים בשימוש (anti-CD8, PD-1, טים-3 ונוגדנים משניים המקביל שלהם) וריכוזי שלהם.
    2. הקש על ו/או לסתור את הנסיוב חמור הנותרים (נוסף בשלב 2.3.2). דגירה של השקופיות עם 100 µL של המיקס שכותרתו שאינם נוגדנים העיקרי עבור h 1 בתוך תא humidified.
    3. במהלך הדגירה, בקצרה לסובב את Cyanine 5 ארנב אנטי AF488-נגד-עז, נוגדנים אנטי עכבר biotinylated והכן את התמהיל של נוגדנים משניים כפי שמתואר משלימה בטבלה 2.
    4. לשטוף השקופיות ב- TBST עבור 5 דק יבש השקופיות.
    5. דגירה של השקופיות עם 100 µL של הנוגדנים משני למשך 30 דקות בחדר humidified.
    6. להכין התערובת של נוגדן שלישוני המכיל Cy3-streptavidin, כפי שמתואר משלימה בטבלה 2.
    7. לשטוף השקופיות TBS במשך 10 דקות יבש השקופיות.
    8. דגירה של השקופיות עם 100 µL של תערובת שלישוני נוגדן למשך 30 דקות.
    9. לשטוף השקופיות TBS במשך 10 דקות יבש השקופיות.
  5. הרכבה תא
    1. הר בשקופיות 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride דאפי המכילות הרכבה בינונית (1.5 µg/mL דאפי) עם coverslip תואם למיקרוסקופיה קרינה פלואורסצנטית (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: כפקד שלילי עבור ניסוי, שקופית אחת עם נוגדנים מתאימים isotype שומש ריכוז זהה כמו נוגדנים המתאימים. עבור זה מכתים, השתמשנו העכבר IgG1, ארנב IgG ועז IgG שלילי שליטה נוגדנים (ראה טבלה של חומרים). כפקד חיובית, השתמשנו שקדים hyperplasic האנושי, אשר ידוע להיות חיובי עבור הסמנים שנבדקו, עבור ניסוי. צביעת טיפוסי מתואר בתוצאות (איור 1). מונו-צביעה של CD8, PD-1 וטים-3 צריכה להתבצע באופן אינדיבידואלי (צביעת אחד לכל שקופית) עם אותו טיפול מראש וללא דאפי. שקופית בתנאים ניסיוני אותו ללא כל נוגדן רק דאפי הרכבה בינונית יש גם לבצעו. שקופית צריך לדימות שימוש ניסיוני בתנאים זהים ללא כל נוגדן וללא דאפי.

3. קרינה פלואורסצנטית ניתוח, ספירת התאים אוטומטית

  1. ייבוא תמונות עם המיקרוסקופ אוטומטיות
    1. ליצור פרוטוקול.
      1. הפעל את התוכנה מיקרוסקופ אוטומטיות, המאיר זריחה.
      2. בשורת התפריטים, לחץ על "קובץ", "יצירת פרוטוקול," בחר "דאפי," "FITC", "TRITC".
      3. לחץ על "הבא," "סעיף הרקמה," ולחץ על "הבא","""פרוטוקול שם. לבחור שם, לדוגמה, "CD8-PD-1-טים-3," לחץ על "הבא", ו "שמור".
      4. באופן ידני במקום שקופית על הבמה.
      5. בשורת התפריטים, לחץ על "הגדרות", "הגדרות". לחץ על "קבע Z הביתה" בחלון חדש.
      6. להתאים את זמן החשיפה עם פקד חיובי שקופית קרי CD8, PD-1 וטים-3 טריפל-צבעונית עם דגימת דאפי.
      7. בבר בקרת לחץ על "קבע חשיפה".
      8. התאם את זמן החשיפה כל מסנן עד אות מספיק אבל לא קולח, מתקבל.
      9. עבור הדמיה בשחור-לבן, בצע את הפעולות הבאות:
      10. בחר רכישה ובחרו ' תחת 'פוקוס אוטומטי' מסנן דאפי.
      11. "סריקה אזור גבול", לעבור המטרה העליונה לפינה השמאלית העליונה של השקופית. לחץ על "סימן". לעשות את אותו הדבר עבור פינה הימנית התחתונה.
        הערה: שלב זה delimitates האזור של צריכת חשמל נמוכה, הדמיה (הדמיה LP) ב 4 X; להיות מודע כדי למקם את הסימן טוב אז כדי להקיף את כל הדוגמאות של הסדרה.
      12. לכוח גבוה (HP) הדמיה, בצע את הפעולות הבאות:
      13. תחת 'פוקוס אוטומטי', בחרו "דאפי".
      14. תחת 'רכישה' בנד, בחר "דאפי", "FITC", "Cy3" ו- "Cy5". לחץ על "אישור". בשורת התפריטים לחץ על "קובץ", "שמור פרוטוקול".
    2. סריקת השקופיות.
      1. לטעון את הפרוטוקול על ידי לחיצה על "קובץ", "טען פרוטוקול" של שורת התפריטים. לחץ על "התחל".
      2. הזן 'המעבדה ' ID (מיקום התיקייה לאחסון תמונות). הזן מזהה שקופית כדי לזהות את השקופית. לחץ על "הבא".
      3. לחץ על "הדמיה מונוכרום" (כדי לסרוק כל השקופית תחת אור בהיר שדה ולרכוש רציפים תמונות באמצעות מטרה 4 x).
        הערה: זה מייצר סקירה גווני אפור של השקופית.
      4. לחץ על "חיפוש הדגימה". בחר את אזור הרקמה לסרוק ברזולוציה נמוכה (4x): החזק את מקש 'Ctrl' ולחץ על שדה באמצעות הסמן לבחור או לבטל את שדות (איור 2 א).
      5. לחץ על "LP הדמיה" (4 x הדמיה) עבור רכישת התמונה אדום כחול ירוק ניאון של כל שדה.
      6. עבור בחירת שדה HP, החזק את מקש 'Ctrl' ולחץ על שדה באמצעות הסמן לבחור או לבטל את שדות המקבילים לאזור של רקמות זה ייסרקו ברזולוציה גבוהה (20 x). בחר שדות 5 (איור 2B).
      7. לחץ על "HP הדמיה" (20 x הדמיה) ייבוא תמונות מולטי ספקטריאליות של כל שדה (איור 2C).
      8. לחץ על "אחסון נתונים" כדי לאחסן תמונות בתיקיה שנבחרה ההתחלה ב- LabID.
        הערה: התהליך הוא סיכם, מאויר באיור2. עבור כל שלב (זיהוי הרקמה, בחירת שדה) אלגוריתם יכול להיות גדל בהפרש קבוע, שהוכשרו על-ידי המשתמש עבור תהליך סריקה אוטומטית כל.
  2. ניתוח תמונות פלורסצנטיות ותא אוטומטית ספירה עם ניתוח בשילוב תוכנה
    1. לבנות את ספריית ספקטרלי.
      1. פתח את תוכנת ניתוח של התמונה.
      2. בלוח השמאלי, פתח את "לבנות ספריות". תחת "טען תמונה", לחץ על "עיון" ובחר שהוכתמו מונו תמונה אחת (למשל, 5 CD8/Cyanine).
      3. בחר את fluorophore, (למשל, Cyanine 5). לחץ על "לחלץ". לחץ על 'שמור' כדי לאחסן בספריה. לחץ על "שמור".
      4. חזור על התהליך זהה עבור PD-1, טים-3 ודאפי שהוכתמו מונו שקופיות כדי לשלב את הספקטרום של fluorophore בכל עניין.
        הערה: בניין הספרייה ספקטרלי משלב את הספקטרום עבור כל fluorophore המשמש את רקמות ספציפיות (כאן, כליות), אך ניתן להשתמש בספריות "סינתטיים" שכבר קיימים. כמו הקשת autofluorescence הוא אך ורק ביחס הרקמה, חשוב לבצע אחד אוטומטי-זריחה וספריית ספקטרלי לכל פרוייקט.
    2. יצירת פרוייקט חדש.
      1. בשורת התפריטים, לחץ על "קובץ", "פרויקט חדש". הכרטיסיה 'תכונת החיפוש', בחר "תא פילוח". הכרטיסיה 'Phenotyping', בחר "phenotyping". לחץ על "צור".
      2. לשלב את התמונות נציג בפרוייקט.
        1. בכרטיסיה 'קובץ', לחץ על 'פתח תמונה'. בחרו 10 עד 30 תמונות נציג כל הסדרה. להוסיף את השקופית שאינו מוכתם להסיר את autofluorescence. בלוח השמאלי: בחר ספריית המקור. בחר fluorophore ובחר את אלה המתאימים לספרייה ספקטרלי שנבנו בעבר.
      3. כדי להסיר את רקמת autofluorescence, לחץ על כפתור"AF" ולאחר מכן בחר את האזור של autofluorescence בשקופית הריקה.
      4. טיפול תמונות ויצירת תמונה ללא הפרדות צבע.
        1. לחץ על "הכנת כל" כדי לשלב את הספרייה פלורסצנטיות, ספקטרום autofluorescence כדי ליצור תמונה מורכבת (איור 3). לחץ על הסמל 'עין' כדי לפתוח את החלונית 'עריכת תצוגה', בחר את הנתונים המוצגים: בחר את הסמנים CD8, PD-1, טים-3 ודאפי. להסיר את autofluorescence. בצע את השלבים שהוצגו על ידי התוכנה.
      5. קטע את התאים.
        1. כדי לחלק את התאים, 'תא', בחר באפשרות "גרעינים" ואת "קרום". בכרטיסיה "גרעינים", הגדר דאפי counterstain הגרעין.
        2. בכרטיסיה "גודל מזערי (px) ומקסימום" להזין "40", "176" הערכים המינימליים והמקסימליים, בהתאמה. האות 'מינימום', להגדיר "0.13". בכרטיסייה "פיצול", להגדיר "2.60". בכרטיסייה "גרעינים", להגדיר "0.81". בחר "השתמש ממברנה אות כדי לסייע פילוח".
        3. לחץ על "קטע תאים" בחלק התחתון של המסך. בדוק את חלוקת הגרעינים וממברנות התאים ונסה שנית עם פרמטרים שונים, אם זה לא תואם את פלורסצנטיות דאפי, הממברנה של התאים.
          הערה: התוכנה מזהה את התאים עם דאפי גרעיני מכתים, בהתבסס על גודל התא. כוונן את הפרמטרים תא (גודל, פיצול, פיקסלים) על פי הפרויקט.
      6. פנוטיפ התאים.
        1. הכרטיסיה 'פנוטיפ', לחץ על "הוסף". צור תא פנוטיפ קטגוריות: CD8 (נקודה כחולה) / CD8-PD-1 (נקודה אדומה) / CD8-PD-1-טים-3 (נקודה ירוקה) / אחרים (נקודה שחורה) (איור 4).
        2. בחר יותר מ- 5 דוגמאות תאים של כל קטגוריה. לחץ על "רכבת מסווג".
          הערה: זה יוצר באלגוריתם סיווג סטטיסטי באמצעות התוכנה.
        3. לחץ על "פנוטיפ כל" כדי להשיג את פנוטיפ של כל תא.
          הערה: התוכנה מעניקה את פנוטיפ של תא אחד עם מרווח ביטחון (CI) של דיוק.
        4. לשפר את האלגוריתם על ידי אימון התוכנה עד ההבדל בין העין לבין ספירה אוטומטית concordant (שגיאה < 5%). לבחור מודיע שהיא מקובלת עבור התאים עניין.
          הערה: בחרנו לעשות את האימון על בסיס של 55% CI כמקובלת.
      7. שמור את אלגוריתם ואת הפרוייקט.
      8. תחת 'קובץ' בחר "פרויקט". שם ולחץ על "שמור".
    3. לבצע ניתוח אצווה של הסדרה.
      1. בחר "אצווה ניתוח". בחר את הפרוייקט. להוסיף את התמונות כדי לנתח. בחר תיקיית אחסון עבור הנתונים. לחץ על "הפעל". בדוק את האיכות של תמונה מורכבת. ודא את phenotyping לכל התמונות של הסדרה.
        הערה: התוכנה ניתוח בשילוב תמונה משתלב כל אותות התאים תאים (ממברנה ציטופלזמה גרעין). הצעד phenotyping הוא מכריע אמנם ההכשרה של האלגוריתם יכול להיות צעד גוזלת זמן. כל הנתונים של כל תמונה הם אחד קובץ. txt. כל הנתונים של תא אחד (במיוחד שלה פנוטיפ בהתחשב עם CI שלה) הם בשורה אחת. עבור כל שקופית, ייבוא תמונות וספירות הבאים בוצעו בשדות 5.
  3. אינטגרציה של נתונים גולמיים, דור של ספירת אוטומטיות
    1. חשב את הנתונים עם תוכנית סטטיסטית.
      1. חשב כל הנתונים מן התמונות 5 התואמים לשדות 5 ניתוח לחולה 1. השתמש פלטפורמה סטטיסטי, ויש סטטיסטיקאי מנוסה, עם נתונים מנהל או מדען נתונים לבצע את הניתוח. לבנות קובץ script באופן אוטומטי סופרת את התאים בהתאם שלהם פנוטיפ, בחירה של CI > 55%.
      2. לשים את כל קבצי. txt של הסדרה באותה תיקיה.
    2. לחלץ את הנתונים.
      1. לשים את כל קבצי. txt בתיקיה אחת. להריץ את הסקריפט האוטומטי נבנה בשלב 3.3.1. פתח את הקובץ. csv פלט שנוצרו על-ידי קובץ ה-script R. שמור כתבנית .xl. הפלט שאוסף את מספר התאים עבור כל פנוטיפ (קרי, CD8 לבד, CD8-PD-1, CD8-PD-1-טים-3) עבור כל מטופל.
      2. לחשב את המספר הממוצע של תאים עבור כל מטופל לכל שדה: לחלק את מספר התאים לפי מספר שדות (כלומר, 5) לנרמל את מספר התאים עבור כל מטופל לכל שדה.
      3. לחשב את אחוז תאים PD-1+ בין CD8 הכולל+ T תאים ותאים PD-1+ טים-3+ בין CD8 הכולל+ T תאים. לקבלת סיכום של שלב זה, ראה איור 5 .
        הערה: השפה R (או תוכנה אחרת תכנות של הבחירה) נדרש כדי ליצור ולבצע כראוי את הפקודות, אז משתמש מנוסה או מדען סטטיסטיקאי/נתונים חיוניים. התוכנית R ניתן לחשב את הנתונים של המטופל אותו, אבל השם של קבצי. txt 5 של מטופל אחד צריכה להיות התחלה זהה, המתאים החולה מזהה ייחודי.
  4. ניתוח סטטיסטי
    1. השתמש בתוכנה סטטיסטית לניתוח סטטיסטי של התוצאות.
    2. לבצע ניתוחים סטטיסטיים המתאימה בעזרת סטטיסטיקאי.
      1. השימוש Wilcoxon ללא פרמטרי חתם על דרגה בדיקות להשוואה של PD-1 MFI בין תא שני פנוטיפים (איור 6). לתאם את covariate ואת מאפייני היסטולוגית עם מבחן כי בריבוע פירסון.
      2. להשתמש בשיטה קפלן-מאייר כדי להעריך את ההישרדות ללא התקדמות, ומודלים קוקס רגרסיה כדי להעריך את ההשפעות covariate על תוצאות זמן-כדי-אירוע, כגון הכללית ועל ההישרדות ללא מחלה.
      3. שקול p-ערכים נמוך מ- 0.05 כמו משמעותית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות פרוטוקול כללי שתוארו לעיל, כיוונו לכמת intratumoral CD8+ T תאים שותף ביטוי קולטני מעכבות PD-1 וטים-3 ברקמות קפוא מחולים עם RCC, כדי לתאם את התוצאות עם התוצאות הקליניות25.

אופטימיזציה של ההכתמה CD8/PD-1/טים-3:

מינים שונים של נוגדנים (עכבר, ארנב, עז, ראה טבלה של חומר) נבחרו כדי למנוע תגובת לחצות בין נוגדנים שונים. הפרוטוקול אומתה על שקדים, אשר הוא רקמת הלימפה מאורגן. צביעת PD-1 יכול להימצא במרכזים נבטי (איור 1), ואילו CD8 וטים-3 מכתים נמצאים סביב המרכזים נבטי. ההתבוננות הזאת מכתימה טיפוסי לאמת פרוטוקול זה. ההכתמה אומתה גם על הרקמה של הריבית (כליות).

העדר של האות של נוגדן ראשוני מודגרות עם שלהם ללא התואם משני נוגדנים (נתונים לא מוצג) אושר. כדי לנתח באופן מדויק פלורסצנטיות ההכתמה וכדי להפוך ספריות ספקטרלי מסוים, שקופיות בודדות היו מוכתמים ביחידים כל סמן (CD8, PD-1, טים-3 או דאפי) ברקמה עניין (כליות). שקופית שאינו מוכתם, באותם התנאים יש צורך לנחש את autofluorescence של הרקמה. ההכתמה נותחה על ידי המיקרוסקופ אוטומטיות, אשר משולב של מנסרה של fluorophores שונים; כל סמן היטב הבדיל, אין חפיפה של סמני נצפתה (איור 3).

מאפיינים כמותיים ואיכותיים של CD8 + לחדור חולי RCC 87:

תוצאות המחקר הראו כי שנהנתם מחצית CD8+ T תאים אקספרס PD-1 (כלומר 53.9%; SE: 30.49%) על שליש היו כפול חיובי PD-1+ טים-3+ (כלומר 38.16%; SE: 28.11%). טים-3 הביטוי בלי PD-1 הביטוי זוהתה ב פחות מ 3% של CD8+ T תאים (נתונים לא מוצג). המספרים הממוצע של CD8+ תא T subpopulations היו: סה כ CD8+ T תאים 116.5 (SE: 216), PD-1+ CD8+T תאים 89.32 (SE: 191.8), PD-1+ טים-3+ 66.9 (SE: 143), ו- PD-1+ CD8 טים-3– + T תאים 22.38 (SE: 57.5) לכל שדה. המספר הכולל של intratumoral CD8+ T תאים היה בקורלציה חיובית עם האחוז של PD-1+ טים-3+ -CD8+ T תאים.

אפיון פונקציונלי CD8 + T תאים בהתאם שלהם פנוטיפ PD-1 וטים-3:

רמת ביטוי PD-1 ידוע בקורלציה עם תשישות תא T אז כיוונו הבא כדי למדוד את הביטוי PD-1 ב- CD8+ T תאים על פי מצב ביטוי טים-3. כאשר עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע fluorochromes שונים מדווחת ברמה התאית, סדרה קטנה של חולים נותחו באופן ידני עבור הנתונים הסלולרית: תוצאות המחקר הראו מתאם של PD-1 קרום MFI עם המשנה תא. עוצמת פלורסנט PD-1 היה נמדד (איור 6) ברמה התאית ב- PD-1+ טים-3+ לעומת PD-1+ CD8 טים-3– + T תאים (פאנל) וברמת הפרט החולה לאחר שילוב אלה שונים אותות התאים על קטע רקמה. בסדרה של חולים 9, השוואה עם מבחן מדגמים מזווגים Wilcoxon מצא כי PD-1 MFI הוא גבוה יותר כאשר טים-3 מתבטאת במשותף, חיזוק הרלוונטיות פונקציונלי לביטוי טים-3 (לוח ב').

ביטוי של ליגנדים PD-1 וטים-3 על פני השטח של תאי גידול מ מרובים משותפת מכתים:

תא T תשישות הוא המתווך כתהליכי קולטן/ליגנד, אנחנו העריכו את הביטוי של ליגנדים PD-1 וטים-3 (PD-L1 ו- Galectin-9 (גל-9), בהתאמה) על תאים סרטניים כליות המזוהה על-ידי פאן-קרטין מכתים. חיוביות מוגדרת של ניתוק של 10% של תאים סרטניים הבעת דה מרקר: (i) 58 מתוך 87 חולים (66 אחוז) היו חיוביות עבור PD-L1; (ii) כל הגידולים 15 ניתח היו חיוביות עבור גל-9 (איור 7 א, ב').

ההשפעה הקלינית של הביטוי שיתוף של טים-3 + PD-1 + ב- CD8 + תאי T:

הגידול הצומת גרורות (TNM) הניקוד, פורמן כיתה, גודל הגידול UISS הציון הינם מאפיינים היסטולוגית (בשילוב עם ציון קליני עבור UISS) משמש להגדרת הערך הפרוגנוזה של RCC העיקרי. מתאם חיובי נצפתה בין מספר ו/או אחוז של CD8 גידולים הסתננות של+ T תאים המבטאים PD-1 וטים-3 (אך לא מבטא רק PD-1 ללא טים-3) עם כל הפרמטרים הללו (טבלה 1). בקנה אחד עם פנוטיפ יותר המזלזל הזה, חולי RCC CD8+ T תאים שותף לביטוי PD-1, טים-3 לעיל האחוז החציוני (34.7) היו בסבירות גבוהה יותר אם כל חטאת (p = 0.046; HR 2.9; 95% CI: 1.02-8.21). המתאם הזה לא נצפתה עם האחוז של PD-1 ב- CD8+ T תאים ללא תלות טים-3 מצב (טבלה 2). מתאם הודגם גם בין האחוז של CD8+ T תאים שותף לביטוי PD-1 ואת טים-3 שיעור ההישרדות הכוללת 36 חודשים (נתונים לא מוצג). אנחנו גם לאמת את immunostaining משולשת על רקמות פרפין שקדים (איור 1).

Figure 1
איור 1: CD8-PD-1-טים-3 immunostaining-רקמה פרפין-מוטבע שקדים- שעוות פרפין רקמות מוטבע מקטעים במקום סעיפים cryopreserved נבחרו בשל immunostaining טריפל. לאחר dewaxing, התייבשות, הוחל באותו הפרוטוקול של צביעת בעבר מפותח עבור מקטעים cryopreserved. CD8+ T תאים נמצאים מחוץ למרכז נבטי, הלא-CD8+ T תאים המבטאים PD-1 מקובצים במרכז נבטי. ההגדלה של מיקרוסקופ הוא 20 x ומייצג סרגל קנה מידה 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: אוטומטי ניתוח של דגימות רקמה קרצינומה של תאי הכליה. לאחר זיהוי הרקמה בתמונת שדה בהיר (A, סולם בר 1 מ מ), 4 x מיקרוסקופ הגדלה הדמיה ברזולוציה נמוכה ב- RGB (כחול ירוק קונבנציונאלי פלואורסצנטי אדום) משמש כדי לבחור את השדות (B, סולם בר 500 מיקרומטר. הכיכר האדומה מלא מייצג שדה. תמונה ברזולוציה גבוהה (קוביה מולטי ספקטריאליות קרינה פלואורסצנטית ספיציפית טכנולוגיה זו תמונה) בהגדלה 20 x שבוצעה על-ידי המיקרוסקופ מולטי ספקטריאליות מוצג (C, סולם בר 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: מיקרוסקופ מולטי ספקטריאליות ותוכנות בשילוב ניתוח לדור של תמונה מורכבת של קרצינומה של תאי הכליה (20 x מיקרוסקופ הגדלה). תמונת raw ברזולוציה גבוהה (A) היא תמונה פלורסנט השדה לאחר סריקה מולטי ספקטריאליות על-ידי קרינה פלואורסצנטית מסנן קוביות. סימן כחול AF488, אדום הוא Cyanine 5, Cyanin3 הוא ירוק. המיזוג מציג צבעים שונים לדוגמה, צהוב הוא מיזוג של fluorophores 3. תמונה זו מעוגנת בתוכנת ניתוח התמונה. שילוב הספריה ספקטרלי מאפשר של ההפרדה ספקטרום מדויק של כל fluorophore וכל autofluorescence שמוביל תמונה מורכבת פלורסנט (B). נציג הצבעים נבחרו על ידי המפעיל: כחול מדגים Cyanine 5 (CD8), אדום Cyanine 3 (PD-1), AF488 גרין (טים-3). מיזוג שילוב צבע כגון סגול משמש עבור חיובי זוגי CD8-PD-1. סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: PD-1 וטים-3 ההבעה על גידולים הסתננות CD8+ T תאים על דגימה קרצינומה של תאי הכליה התא ברורה נותחו על ידי קרינה פלואורסצנטית מולטי ספקטריאליות טכנולוגיית הדמיה (20 x מיקרוסקופ הגדלה). (א) CD8 (כחול), PD-1 (אדום) וטים-3 (ירוק) היו מוכתמים על מקטעי רקמת קפוא נגזר חולי RCC. ניתן להבחין colocalization של שלושה סמנים אלה על-ידי מיזוג תמונות מכתים מונו. פקדים Isotype בוצעו ניסוי. סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר. צהוב תיבות לזהות תאים מוכתם משותפת: תא CD8 PD-1+ טים-3– לבין תא CD8 טים-3+ PD-1+ . טריפל (B) צביעת משותפת עבור CD8, PD-1 וטים-3 (מיזגתם) המוצג בצד השמאל עם התיבה המציינת כי ירוק הוא CD8+ T תאים שותף לביטוי PD-1 ו/או טים-3. לספירת אוטומטית עם התוכנה ניתוח תמונה, זיהוי התאים מסתמך על המצאות גרעיני מכתימים (דאפי); פילוח תא מבוססת גם על מאפיינים morphometric מיוצג גבולות אדומים (לוח האמצעי). אלגוריתם שהוכשרו על-ידי המשתמש עד קונקורדנציה עם ספירת חזותי מתבצע (מימין), ואחרי phenotyping אוטומטי, זיהוי נקודות ירוקות כמו CD8+ T תאים שותף לבטא PD-1 וטים-3, אדום נקודות כמו CD8+ T תאים המבטאים PD-1 ללא הנקודות טים-3 וכחול כמו CD8+ T תאים לא הבעת PD-1 או טים-3. סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר. צהוב תיבת מראה PD-1 ו/או הבעת CD8 טים-3+ T תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: מחשוב הנתונים הגולמיים של ניתוח מולטי ספקטריאליות. לאחר ניתוח תמונות נאספים נתונים של הרוזן של כל קטגוריה תא נוכח בכל שדה (קרי, שדות 5/מטופל, קרי, 5 קבצי. txt). קובץ script R משלב 5 שדות הנתונים, שוקל תאים phenotyped עם סמך > 55%. ההגדלה של מיקרוסקופ הוא 20 x ומייצג סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: PD-1+ טים-3+ CD8+ T תאים אקספרס רמות גבוהות יותר של PD-1 בהשוואה ל- PD-1+ CD8 טים-3– + T תאי קרצינומה של תאי הכליה. עוצמת PD-1 הוא זוהה ברמה התאית (פאנל שמאלי) על ידי באתרו בתוך immunofluorescence ניתוח על PD-1+ + טים-3 ו- PD-1+ CD8 טים-3– + T תאים. ברמת הפרט (לוח האמצעי): התוצאות יוצגו עבור CD8 כל+ T תא קבוצות משנה PD-1+ טים-3+ לעומת PD-1+ טים-3– הנוכחי על קטע רקמה (קרי, מטופל אחד; מאן ויטני מבחן). ניתוח השוואתי של עוצמת PD-1 אומר נמדדה בסדרה של 9 חולים (לוח נכון) (בדיקה Wilcoxon, p-ערכים נמוכים מ- 0.05 נחשבו משמעותי). ההגדלה של מיקרוסקופ הוא 20 x ומייצג סרגל קנה מידה 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: PD-L1 וגל-9 כלומר PD-1 וטים-3 ליגנדים מכתים-קרצינומה של תאי הכליה. (א) גידול תאים מזוהים על ידי צביעת פאן-קרטין. צביעת משותפת של PD-L1, פאן-קראטין (פאנל) מזהה את הביטוי של PD-L1 על תאים סרטניים בחולים 58 מתוך 87 ניתח. Galectin (B)-9 היה ביטוי כל הגידולים 15 מחולים RCC מנותח. הגישה החיובית נחשב אם לפחות 10% של תאים היו מוכתם דה מרקר מנותח. פקדים Isotype היו כלולות עבור כל מכתים. תיבות צהובות מייצגים גידול חיובי (פאן-קראטין +) תאים PD-L1 (לוח א') או Galectin-9 (לוח ב'). ההגדלה של מיקרוסקופ הוא 20 x ומייצג סרגל קנה מידה 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תאי T %/CD8+ PD-1+ PD1+ טים-3+ PD-1+ טים-3–
TNM 0.04 0.003 0.22
Furhman 0.01 0.004 0.74
גודל הגידול 0.08 0.01 0.37
UISS 0.01 0.01 0.63

טבלה 1: מתאם בין הביטוי של PD-1 לבד או בשילוב עם טים 3-CD8+ T תאים ופרמטרים prognostic קליני של חולי RCC: p-ערכים. אחוז PD-1+, PD-1+ טים-3+ או PD-1+ טים-3– -CD8+ T תאים שנבחר משתנה רציף נמדדת ב באתרו immunofluorescence במדגם של חולים 87 היה בקורלציה עם פרמטרים קליניים שונים כהגדרתו בינארי (TNM, כיתה פורמן, UISS ציון) או משתנה רציף (גודל הגידול). TNM חולקה לשתי קבוצות: לשפות אחרות (pT1 ו pT2) ומחלת מחלה מתקדמת (pT3, pT4, N+, או M+). פורמן כיתה הוגדר נמוך (כיתה I או II) ואת גבוהה (כיתה III או IV) והניקוד UISS היה מחולק 3 כיתות (0, 1 ו- 2). P-ערכים המציין מובהק מוצגות בגופן מודגש.

CD8+ תא T משנה/CD8 PD-1+ טים-3+ PD-1+ טים-3–
חציון (%) 34.7 8.6
קורלציה עם PFS P = 0.046 P = 0.8

טבלה 2: מתאם בין PD-1 וטים-3 ביטוי משותף-CD8+ T תאים והתקדמות חינם הישרדות. שתי קבוצות של חולי RCC (n = 87) בהתאם אחוז PD-1 ללא טים-3 (מימין), היו פרטנית PD-1 וטים-3 (משמאל) יחסית כדי לחשב את החציון. המתאם עם PFS בוצע עם החציון נבחר של ניתוק. P-ערכים המציין מובהק מוצגות בגופן מודגש.

משלימה טבלה 1: מאגר הרכב של TBS, TBST. TBS משמש דילולים ותערובות של נוגדן. עבור שוטף, כל הצעדים מבוצעים עם TBS חוץ מנקי בעקבות נוגדנים הראשי, שבו מומלץ TBST. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה בטבלה 2: נוגדנים מפורט לערבב הרכב עבור צביעת immunofluorescence CD8-PD-1-טים-3- עבור כל נוגדן ראשוני, משניות ושלישוניות מערבב, הדילול לביצוע באמצעי האחסון המתאים של TBS ניתנת על הנפח הכולל של 1 מ"ל. עבור שקופית אחת, אמצעי האחסון הדרושים התגובה הכולל הוא µL 100 עבור אזור הרקמה של 2 ס מ2. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שינויים, פתרון בעיות:

איכות רקמת הוא פרמטר חשוב; זה יכול בקלות להיבדק על ידי הגיוון hematoxylin ואאוזין.

אחד היתרונות של השיטה היא האפשרות של stainings מרובבת, אך כדי למנוע fluorophore והתאמת, מומלץ לבחור אורכי גל פליטה עם דלתא של מינימום 10 ננומטר. כאן, כי היינו stainings 4 כולל דאפי, בחרנו להפיץ את אורכי הגל (דאפי: 460 nm, AF488: 519 ננומטר, Cyanine 3:570 ננומטר, Cyanine 5:670 ננומטר). הסיכון של חופפים אותות שונים fluorophores נמנעת באמצעות התוכנה לחישוב הספקטרום טהור של fluorophore של אות פליטה מעורבת, בשילוב עם ניתוח התמונה האוטומטי. השקופיות שהוכתמו מונו לאשר גם העדר חפיפה בין fluorophores לבין מעשה כפיצוי בזכות ספריית ספקטרלי.

לפעמים חיוביות עבור סמן אחד בתא אחד יכול להיות קשה לקבוע אם צביעת/זריחה חלשה. הפקד שלילי כולל ניסוי היא דרך טובה כדי לקבוע את הסף של הגישה החיובית.

בתוכנה בשילוב המשמשת כדי לנתח תמונות, קיים צעד הניקוד לקביעת את הגישה החיובית של התא, אך זה רק יכול לנתח שני סמנים בו זמנית. כי אפשר להכתים משולשת באותו התא (CD8, PD-1 וטים-3), בחרנו את השלב phenotyping.

הצעד phenotyping יכולה להיות מייגעת, במיוחד אם הסוג של צביעת ואת הרקע משתנה מדוגמא אחת לאחרת.

מגבלות של הטכניקה:

גם אם המספר של co-stainings הוא יתרון בהשוואה פלורסצנטיות המקובלת, אין אפשרות לנתח הרבה צבעים כמו cytometry זרימה. במיוחד כאשר colocalization של מספר סמני הוא למד, להיות מודע כי רגישות נמוכים בהשוואה מיקרוסקופיה קונפוקלית (בשביל 20 x מיקרוסקופ הגדלה, כ- 0.5 מיקרומטר לעומת 0.1 מיקרומטר לפיקסל עבור קונאפוקלית, בהתאם למותג) ו בדוק fluorophore והתאמת (עיין קריטי צעדים בתוך לפרוטוקול, להלן).

מגבלה גדולה של הטכניקה היא תבנית נתונים גולמיים. הנתונים הגולמיים נמצאים קבצי. txt אשר עלול להיות מסובך לשימוש. כמו התוכנה נותן קובץ. txt אחד לכל תמונה עם CI עבור פנוטיפ, הטיפול ידני של כל אחד מהקבצים 5 לכל מטופל סדרה ענק הוא מייגע מאוד. מומחה ביואינפורמטיקה נדרש לחשב את כל הנתונים תוכנה סטטיסטית.

משמעות לגבי שיטות קיימות:

ניתוח מכתימים מרובבת אפשרי בקלות. בהשוואה cytometry זרימה, אשר מנתח את דגימות טריות, טכניקה זו מאפשרת ספירה מהירה בשיטה ישימה של תאים שונים ערכות המשנה נוכח microenvironment הגידול, בעוד קוהורטות גדולות של דגימות קפוא בהליך אוטומטי26 ,27. שנוכל באופן אוטומטי לסמוך שחדר CD8+ T תאים לביטוי PD-1 ושיתוף לביטוי טים-3 או לא בסביבה של RCC. הרוזן אוטומטית מונע הטיות מספר כמו עין עצלה וספירה שאינם לשחזור, והוא לא לארוך זמן רב.

כמו עוקבה גדול למד היה על מדגם קפוא, היה לנו נתונים רטרוספקטיבי אז נחבר את המספר המוחלט או אחוז CD8+ T תא קבוצות משנה עם ביולוגי פרמטרי והתוצאה הקלינית. מאחר הטרוגניות חשוב של חדירה המערכת החיסונית חולה אחד עוד28, זה מייצג יתרון בהשוואה fluorocytometry מדווח רק MFI, אחוז אבל לא את הציון הסתננות.

עוצמת קרינה פלואורסצנטית באופן כמותי דיווח עבור כל תא, בתאים שונים התא (קרום ציטופלזמה גרעין), אנו יכולים להעריך את רמת PD-1 מכתים מאת MFI ב הקרום. זה מייצג כלי מעניין נוסף הדומה cytometry זרימה. מצאנו כי ה PD-1+ CD8+ T תאים המבטאים טים-3 היה גבוה יותר ביטוי של PD-1, היו קשורים עם פרוגנוזה גרועה (השפעה על ההישרדות ללא התקדמות). הידע שלנו, זהו המחקר הראשון בשיטה זו שמראה משמעות קלינית של קבוצת משנה תא ספציפי.

יישומים עתידיים:

השדה של היישום הוא עצום. אנחנו גם מודגשת microenvironment של הגידול בסרטן ריאות משנה תא ספציפי אחר: הזיכרון תושב רקמות T תאים הנקרא TRM (CD103+ CD49a+), ו הם נמצאים בקורלציה עם יותר הכוללת הישרדות21,29 ,30. בעבודה נוספת בעזרת טכניקה זו, הצוות שלנו מצא כי PD-L1 היה overexpressed על תאים סרטניים בתוך תת סוג של סרטן ריאות עם התמורות קינאז (ALK) לימפומה אנפלסטית, ביטוי זה היה בקורלציה עם CD8+ T לחדור10. טכניקה זו מתאימה הערכת פרמטרים ביולוגי קריטיים בהקשרים מספר ולייצג כלי רב ערך עבור גילוי סמן. מאז מקבלים את קואורדינטות xy, זה אחד הכלים הראשונים ללמוד הטופוגרפיה ואף תא תא אינטראקציות עם נוחות31.

שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול:

אחד השלבים הקריטיים הוא אופטימיזציה של שיתוף ההכתמה, שיכולה להיות זמן רב. הבחירה של נוגדן טוב הוא חיוני, למשל מספר שיבוטים נבדקו עבור טים-3 במקרה הנוכחי. יתר על כן, fluorophores שונים עבור דה מרקר אותו יכול לתת תוצאות שונות ולכן חשוב לנסות מספר שילובים. בחינת יחודיות מכתימים עם נוגדנים ולא צריך להגיב ביחד מומלץ. למרות האפשרות לנתח מספר fluorophores באותו זמן, בדיקת והתאמת עם השקופיות שהוכתמו מונו מומלץ. צעד חשוב נוסף הוא הצעד phenotyping המסתמך על ידני הכשרה כדי לבצע בזהירות.

בסך הכל, השימוש בטכניקה זו מרובבת על ידי מפעיל מיומן מייצג כלי אלגנטי לנתח מספר קבוצות משנה תא של לחדור המערכת החיסונית המקומית, אשר הוא בעל חשיבות מאז הניתוח דם היקפיים לא יכול להיות נציג של הגידול המקומי סביבה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים יש אין ניגוד אינטרסים להכריז.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים אינסטיטוט הארצי du לסרטן (האינקה) (ET), ליגה חדר מרווח וחדיש le סרטן (ET), אוניברסיטת סורבון פריז סיטה (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex חיסונית-אונקולוגיה (ET), CARPEM SIRIC (CG, ואח '). הקצוות עם הגבלת זמן מומן על ידי מלגת ד'ארק Fondation. EV ו- CD, במימון של אחוות APHP (bourse באסכולה הסוציולוגית רשרש). ChB ממומן על ידי מלגת של אוניברסיטת סורבון פריז סיטה (contrat דוקטורט). המחברים מודים בריסטול מאיירס סקוויב על המימון בפרויקט זה. המחברים תודה המחלקה לפתולוגיה של חולים Européen פומפידו, נקר (Laurianne Chambolle, מישל אלודי, Gisèle Legall). המחברים תודה פלטפורמת היסטולוגיה של PARCC, חולים Européen פומפידו (קורין Lesaffre).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging  Perkin Elmer CLS142338
inForm cell analysis 2.1. Perkin Elmer CLS135781
R software https://www.r-project.org
Dakopen delimiting pen Dako S2002
Tris Buffer Salin TBS Tablets Takara, Bio Inc. TAKT9141Z pH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) Takara, Bio Inc. TAKT9142Z pH 7.6 100 tablets
Biotin blocking system Dako X0590 Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serum Jackson Immunoresearch 017-000-001 5% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPI Sigma-aldrich F6057 1.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslip Knittel Gläser, 100039 24x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V novus NBP1-79055 use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NAT abcam ab52587 use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3 R&D AF2365 use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 Roche 7309457001 use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 Cell Signalling 4528 use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9 R&D AF2045 use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-175-152 use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 715-066-150 use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG abcam ab150133 use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidin Amersham PA43001 use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1 Dako X0931 use at 2 µg/mL
IgG from goat serum Sigma-aldrich I5256 use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serum Sigma-aldrich I5006 use at 4µg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  2. Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
  3. Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
  4. Robert, C., et al. Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation. N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).
  5. Robert, C., et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).
  6. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  7. Schadendorf, D., et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).
  8. Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. What does PD-L1 positive or negative mean? J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).
  9. Rizvi, N. A., et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 348 (6230), 124-128 (2015).
  10. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. OncoImmunology. 6 (4), e1286437 (2017).
  11. Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. Biomarqueurs prédictifs de réponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices. Bull Cancer. 103, Suppl 1. S151-S159 (2016).
  12. Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  13. Fourcade, J., et al. Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).
  14. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
  15. Wherry, E. J., Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).
  16. Cai, C., et al. Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma. World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).
  17. Sakuishi, K., et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity. J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).
  18. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  19. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).
  20. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).
  21. Nizard, M., et al. Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine. Nat Commun. 8, 15221 (2017).
  22. Nghiem, P. T., et al. PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).
  23. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. Oncoimmunology. (4), (2017).
  24. Woods, K., et al. Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma. J Immunother Cancer. 4, 10 (2016).
  25. Granier, C., et al. Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma. Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  26. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  27. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3, 47 (2015).
  28. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  29. Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines. Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).
  30. Sandoval, F., et al. Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors. Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120 (2013).
  31. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nat Commun. 8, 15095 (2017).

Tags

אימונולוגיה גיליון 132 מולטיפלקס בחיי עיר הדמיה מולטי ספקטריאליות טכניקת immunofluorescence דימות דיגיטלי קרצינומה של תאי הכליה טים-3 PD-1 microenvironment הגידול מעכבי במחסום בחיי עיר תא בודד ניתוח
מרובב ניתוח Immunofluorescence, כימות של CD8 טים-3<sup>+</sup> PD-1<sup>+</sup> Intratumoral<sup>+</sup> T תאים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Granier, C., Vinatier, E., Colin,… More

Granier, C., Vinatier, E., Colin, E., Mandavit, M., Dariane, C., Verkarre, V., Biard, L., El Zein, R., Lesaffre, C., Galy-Fauroux, I., Roussel, H., De Guillebon, E., Blanc, C., Saldmann, A., Badoual, C., Gey, A., Tartour, É. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. J. Vis. Exp. (132), e56606, doi:10.3791/56606 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter