Gemultiplext Immunfluoreszenz Analyse und Quantifizierung der intratumorale PD-1⁺ Tim-3⁺ CD8⁺ T-Zellen

Das übergeordnete Ziel dieser Multiplex-Immunfluoreszenzanalyse ist es, Zellen basierend auf ihrem Phänotyp automatisch zu zählen. Diese Methode ermöglicht Multifluoreszenz und automatische Zellzählung, um den Phänotyp und die Funktion von Tumorimmunzellen in einer Tumormikroumgebung zu analysieren. Diese Technologie ermöglichte die Erstellung von zwei Arten von zusammengesetzten Prognosen, die von Ihren Markern vorhergesagt werden, die direkt aus der Tumormikroumgebung abgeleitet werden.

Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da das Verfahren zur Phänotypisierung sehr langwierig ist und die resultierenden Rohdaten eine weitere Verarbeitung erfordern. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir versuchten, den Phänotyp und die immunologischen Interaktionen von Annhodge-Miranty-Zellen zu charakterisieren. Trocknen Sie die Objektträger nach dem Auftauen vorsichtig mit einem Papiertuch um die Gewebeabschnitte herum und kreisen Sie die Gewebe dann mit einem hydrophoben Barrierestift ein.

Wenn die Barriere getrocknet ist, fixieren Sie die Proben fünf Minuten lang in 100 % Aceton, gefolgt von zwei Minuten Lufttrocknung, und waschen Sie die Objektträger dann 10 Minuten lang in TBS. Behandeln Sie die Objektträger 10 Minuten lang im Dunkeln mit 3 Tropfen 0,1 %Avidin vor, dann klopfen oder schnippen Sie auf die Objektträger, um das Gewebe mit der Avidin-Lösung zu bedecken. Geben Sie 3 Tropfen 01%Biotin in jede Probe und klopfen oder schnippen Sie dann mit dem Biotin über die Proben, gefolgt von einer TBS-Wäsche, wie gerade gezeigt.

Blockieren Sie dann jede unspezifische Bindung mit 100 Mikrolitern 5%igem Serum bei TBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation klopfen Sie auf die Objektträger, um das überschüssige Serum zu entfernen, und inkubieren Sie die Objektträger in 100 Mikrolitern des primären Antikörpercocktails von Interesse für eine Stunde in einer befeuchteten Kammer. Waschen Sie die mit Antikörpern markierten Objektträger fünf Minuten lang in TBST.

Nach dem Trocknen werden die Zellen 30 Minuten lang in der befeuchteten Kammer mit 100 Mikrolitern des Sekundärantikörper-Cocktails von Interesse markiert, gefolgt von einer 10-minütigen Wäsche in TBS. Inkubieren Sie die getrockneten Sekundärantikörper-markierten Objektträger mit 100 Mikrolitern des Tertiär-Antikörper-Cocktails von Interesse für 30 Minuten, gefolgt von einer 10-minütigen TBS-Wäsche. Trocknen Sie am Ende der Wäsche die Objektträger und befestigen Sie die Gewebe mit einem mit Dapi ergänzten Einbettmedium.

Dann klee jede Dias mit einem Deckglas und lasse das Eindeckmedium mindestens zwei Stunden lang aushärten. Um die Objektträger zu scannen, öffnen Sie die Mikroskopsoftware und laden Sie das Bildscanprotokoll. Legen Sie den ersten Objektträger auf den Mikroskoptisch.

Klicken Sie dann in der Steuerungsleiste auf "Belichtung einstellen" und passen Sie die Belichtungszeit für jeden Filter an, bis ein ausreichendes, aber nicht sättigendes Signal erhalten wird. Klicken Sie im oberen Bereich auf Start und öffnen Sie den LabID-Ordner. Geben Sie die ID der ersten Folie ein und klicken Sie auf Weiter.

Um einen Überblick über den Objektträger unter hellem Feldlicht bei 4-facher Vergrößerung zu erhalten, klicken Sie auf Monochrome Bildgebung und suchen Sie die Probe. Um den Bereich des zu scannenden Gewebes auszuwählen, drücken Sie die Strg-Taste und verwenden Sie den Cursor, um die zu scannenden Bereiche mit 4-facher Vergrößerung auszuwählen oder abzuwählen. Um ein fluoreszierendes Rot/Blau/Grün-Bild jeder Region zu erhalten, klicken Sie auf Low Power Imagine.

Für die Auswahl eines Hochleistungsfelds drücken Sie die Strg-Taste und wählen Sie mindestens fünf interessante Bereiche aus, die den Bereichen des Gewebes entsprechen, die bei der 20-fachen Vergrößerung gescannt werden. Um dann eine multispektrale Bildaufnahme jedes Feldes zu erhalten, klicken Sie auf High Power Imagine und dann auf Datenspeicher, um die Bilder im entsprechenden Lab-ID-Ordner zu speichern. Um ein neues Projekt zu erstellen, wählen Sie im Menü "Datei" die Option "Neues Projekt" aus, wählen Sie im Menü "Funktion suchen" die Option "Zellsegmentierung" und wählen Sie im Menü "Phänotypisierung" die Option "Phänotypisierung" aus und klicken Sie dann auf "Konfigurieren".

Wählen Sie im Bildformat die Option Multispektral aus. Wählen Sie als Probenformat die Option Fluoreszenz aus. Um die repräsentativen Bilder in das Projekt zu integrieren, klicken Sie im Dateimenü auf Bild öffnen und wählen Sie 10-30 repräsentative Bilder der gesamten Serie aus.

Um die Autofloreszenz zu entfernen, öffnen Sie den ungefärbten Objektträger und wählen Sie die Bibliotheksquelle und die entsprechenden Fluorophore aus. Klicken Sie auf Automatische Fluoreszenz und wählen Sie den Bereich der automatischen Fluoreszenz auf der leeren Folie aus. Um ein Kompositbild zu erzeugen, wählen Sie Alle vorbereiten, um die Fluoreszenzbibliothek und die Autofluoreszenzspektren zu integrieren.

Klicken Sie auf das Augensymbol, um das Ansichtseditor-Fenster zu öffnen, und deaktivieren Sie die automatische Fluoreszenz, um das Autofluoreszenzsignal zu trimmen. Wählen Sie für jede Markierung eine geeignete Farbe aus. Um die Zellen zu segmentieren, wählen Sie im Kompartimentmenü Kerne und Membran aus.

Legen Sie im Menü "Kerne" DAPI als nuklearen Gegenfärbung fest. Klicken Sie auf Zellen segmentieren und überprüfen Sie die Segmentierung der Zellkerne in den Zellmembranen. Um die Zellen zu phänotypisieren, klicken Sie im Menü "Phänotyp" auf "Hinzufügen".

Um die Zellphänotypkategorien zu erstellen, wählen Sie mehr als fünf repräsentative für die Kombination aus Fluorophor und Fluorophor aus, und klicken Sie auf Klassifikator trainieren. Der Klassifikator erstellt einen Algorithmus, der jeder Zelle einen Phänotyp mit einem Konfidenzintervall zuweist. Zoomen Sie und überprüfen Sie die Phänotypen der Zellen.

Klicken Sie dann auf Phänotyp alle, um den Phänotyp-Algorithmus und das Bildprojekt zu speichern, und wählen Sie im Dateimenü die Option Projekt speichern aus. Benennen Sie dann das Projekt und speichern Sie es. Um eine Batch-Analyse der Serie durchzuführen, wählen Sie Badanalyse und wählen Sie das gespeicherte Projekt aus.

Wählen Sie einen Ordner zum Speichern der Batch-Daten aus. Fügen Sie die zu analysierenden Bilder hinzu und klicken Sie dann auf Ausführen. Am Ende der Analyse überprüfen Sie die Qualität des zusammengesetzten Bildes und überprüfen Sie die Phänotypisierung aller Bilder innerhalb der Serie.

Die Analyse des Tumors, der CD8-positive T-Zellen infiltriert, an einer klaren Nierenzellkarzinomprobe mittels Fluoreszenz-Multispektralbildgebung zeigt, dass etwa die Hälfte der CD8-positiven T-Zellen einfach positiv für PD-1 und etwa 1/3 für PD-1 und Tim-3 doppelt positiv ist. Nach der Integration dieser verschiedenen Zellsignale in einen Gewebeschnitt zeigt die Messung der PD-1-Fluoreszenzintensität auf PD-1-positiven Tim-3-positiven im Vergleich zu PD-1-positiven, Tim-3-negativen CD8-positiven T-Zellen, dass der PD-1-MFI höher ist, wenn Tim-3 co-exprimiert wird, was die funktionelle Relevanz der Tim-3-Expression verstärkt. In diesem repräsentativen Experiment waren 66% der Nierentumorpatienten auch positiv für die PD-1-Ligandenexpression und 100% positiv für den Tim-3-Liganden Galactin-9.

Die klinische Bewertung des Tumorgewebes von Nierenzellkarzinom-Patienten zeigte auch die positive Korrelation zwischen der Anzahl und dem Prozentsatz der tumorinfiltrierenden CD-8-positiven T-Zellen, die PD-1 und Tim-3 exprimieren, und den prognostischen Scoring-Parametern, aber nicht PD-1-positiven CD-8-Zellen, die Tim-3 nicht exprimieren. Interessanterweise hatten Nierenzellkarzinompatienten mit CD-8-positiven T-Zellen, die PD1 mit und Tim 3 über dem medianen Prozentsatz exprimierten, eine höhere Wahrscheinlichkeit, einen Rückfall zu erleiden, während sich herausstellte, dass die Expression von PD-1 ohne Tim-3-co-Expression nicht mit dem Rückfall des Patienten korrelierte. Während ich dieses Verfahren ausprobiert habe, ist es wichtig, daran zu denken, den Phänotyp der Zellen mit zwei getrennten Untersuchern zu überprüfen, einschließlich eines Pathologen, wenn möglich.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Angelegenheiten, wie z.B. die Zytometrie, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über den funktionellen Einfluss des Selbstphänotyps nach x-vivo-Stimulation zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Krebses, um Immunreaktionen in betroffenen Organen zu erforschen.