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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Gemultiplext Immunfluoreszenz Analyse und Quantifizierung der intratumorale PD-1+ Tim-3+ CD8+ T-Zellen

Published: February 8, 2018 doi: 10.3791/56606
Automatic Translation
1, 2,3,4, 2,3, 2,3, 2,3,5, 6, 7, 2, 2, 2, 2,3,6, 8, 2,3, 4, 2,6, *4, *2,4
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou
* These authors contributed equally

Summary

Studium der Tumor Mikroumgebung kann prognostische und prädiktive Biomarker des klinischen Ansprechens auf Immuntherapie identifizieren. Hier präsentiert, ist eine innovative Methode basierend auf in Situ Fluoreszenz multispektralen imaging, zu analysieren und automatisch verschiedene Subpopulationen von CD8 zählen+ T Zellen. Diese reproduzierbare und zuverlässige Technik eignet sich für große Kohorte Analysen.

Abstract

Immunzellen sind wichtige Bestandteile der Tumor Mikroumgebung und Tumor-Wachstum und Entwicklung in allen Phasen der Krebsentstehung beeinflussen. Bemerkenswert ist, ist es inzwischen gut etabliert, dass das Immunsystem Infiltrat in menschlichen Tumoren mit der Prognose und ansprechen auf die Therapie korrelieren kann. Die Analyse der immun zu infiltrieren in der Mikroumgebung Tumor ist eine große Herausforderung für die Klassifizierung von Patienten und das Ansprechen auf die Behandlung geworden.

Der Co Ausdruck der inhibitorischen Rezeptoren wie Programm Cell Death Protein 1 (PD1; auch bekannt als CD279), zytotoxischen T-Lymphozyten Associated Protein 4 (CTLA-4), T-Zell-Immunglobulin und Mucin enthält Protein-3 (Tim-3; auch bekannt als CD366) und Lymphozyten Aktivierung-Gen 3 (Lag-3; auch bekannt als CD223), ist ein Markenzeichen der T-Zell-Erschöpfung. Wir entwickelten ein multiparametric in Situ Immunfluoreszenz beflecken, zum identifizieren und quantifizieren des Co Ausdrucks dieser hemmenden Rezeptoren auf zellulärer Ebene. Auf einer retrospektiven Reihe von tiefgefrorenem Gewebe renal Cell Karzinome (RCC), mit einem multispektrale Fluoreszenz-imaging-Technologie gepaart mit einer Bildanalyse-Software, wurde festgestellt, dass Co Ausdruck der PD-1 und Tim-3 auf Tumor infiltrieren CD8+ T Zellen korreliert mit einer schlechten Prognose in RCC. Nach unserem Kenntnisstand entspricht dies die erste Studie, die zeigt, dass diese multiplex in Situ Technologie automatisiert einige klinischen Relevanz haben kann.

Introduction

In den letzten Jahren hat sich eine sehr vielversprechende Therapie für viele Arten von Krebs, einschließlich RCC Immuntherapie entwickelt. Besonders, Immuntherapie, basierend auf der Hemmung der hemmenden Prüfpunkte wie PD-1 und CTLA-4 wurde berichtet, werden klinisch wirksamen1,2,3,4,5, 6. monoklonale Antikörper gegen CTLA-4, PD-1 oder Programm Tod Liganden 1 (PD-L1) sind bereits in mehreren Krebserkrankungen zugelassen und zu lang anhaltende klinische Reaktionen in mehr als 20 % der Patienten7führen. Dennoch sind nicht alle Patienten Responder, die Kosten der Behandlung sind hoch und diese Behandlungen sind giftig, führt zu möglichen schweren Autoimmun-ähnliche Nebenwirkungen. Daher ist die aktuelle Herausforderung, prädiktive Marker für diese neue Immuntherapien zu identifizieren. Die Rate der Mutationen im Tumor, der Ausdruck der PD-L1 oder die Ebenen der intratumorale CD8+ T-Zell-Infiltration mit klinischem korrelieren gemeldet wurden. Diese Zuordnung ist jedoch immer noch zu schwach, um die Verwendung von diesen klinischen Biomarker in der klinischen Praxis mit Ausnahme der Begleiter-Test für PD-L1 vor der Verabreichung von Pembrolizumab in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) Krebs Patienten8 empfehlen ,9,1011,12. Es wurde nachgewiesen, dass der Co Ausdruck der vielen inhibitorischen Rezeptoren wie PD-1, Tim-3, Lag-3 und CTLA-4, induziert eine Zelle Erschöpfung Phänotyp und Widerstand gegen die Therapie13,14,15. Da peripheren Blut nicht repräsentativ für die Tumor-Mikroumgebung, ist es von großem Interesse für die phänotypische Merkmale der Zellen in Situzu analysieren. PD-1 und Tim-3 zusammen mit dem Ausdruck ihrer T-Zellen sind bekanntermaßen funktionell beeinträchtigt Zellen in mehreren Kontexten13,16,17. In dieser Studie, die prognostische Auswirkungen der Co Ausdruck der zwei inhibitorischen Rezeptoren PD-1 und Tim-3 auf CD8+ T Zellen wurde bewertet.

Bis jetzt, Studium des Co Ausdrucks mehrere Markierungen auf Tumor infiltrieren Lymphozyten (TILs) wurde vor allem durch Flow Cytometry Analyse, macht es notwendig, auf frischen Tumoren und daher Ausschaltung Retrospektive Analysen arbeiten durchgeführt. Mit konventionellen in Situ beflecken, nur eine Färbung zu einem Zeitpunkt ausgeführt werden kann, und die Charakterisierung des Zelltyps, die die Marker Co ausdrückt ist nicht möglich. Z. B. PD-L1 drückt sich durch viele Zelltypen der Tumor Mikroumgebung, durch konventionelle immunhistochemische Analyse festlegen, welche Zellen mit dem Ausdruck PD-L1 desto relevanter für korrelative Studien erschwert. In dieser Arbeit entwickelten wir eine innovative in Situ multiparametric Immunfluoreszenz-Methode mit Computer zählen, um Co Ausdruck der PD-1 und Tim-3 durch Tumor infiltrieren CD8 korrelieren+ T-Zellen mit klinischen Resultaten im RCC. Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile, einschließlich der Möglichkeit, auf eine einzelne Zellenebene und mehrere Markierungen gleichzeitig mit einer multispektralen Kamera, die eingeschränkte Intervallen erfassen können zu analysieren > 10 nm durch Flüssigkristall filtert18. Darüber hinaus ist das Verfahren automatisch eine Inter-Operator-Reproduzierbarkeit und eine verkürzte Analyse im Vergleich zu manuellen Techniken19ermöglicht. Im Bereich Krebs berichteten mehrere Studien überzeugend mehrere Färbungen von immun-Moleküle wie PD-1, PD-L1 und CD8 in Merkel-Zell-Karzinom, Lungenkrebs und Kopf und Nacken Krebs20,21,22, 23. die automatisierte Zellzahl ist möglich mit der Ausbildung durch den Benutzer (Phänotypisierung Schritt). Die Fluoreszenz wird in die andere Zelle Fächer (Zellkerne, Zytoplasma und Membran) gemessen.

Hier, verschiedene Teilmengen der Tumor-Infiltration von CD8+ T-Zellen mit dem Ausdruck Ihrer PD-1 und/oder Tim-3 in einer großen Kohorte von RCC wurden gezählt und die Ergebnisse wurden mit klinischen Schwerkraft Partituren und überleben Parametern korreliert. Es war auch möglich, Membran Fluoreszenz-Intensität in der zellulären Auflösung bedeuten Fluoreszenz Intensität (MFI) Daten wie Zytometrie zu analysieren. Soweit wir wissen, ist dies die erste Berichterstattung prognostische Studienergebnisse mit dieser multispektralen imaging basierend Graf-Technik.

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Protocol

Diese Studie wurde durchgeführt in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki und wurde von der lokalen Ethikkommission (CPP-Ile-de-France nr. 04 / 05 / 2012) genehmigt. Die Einwilligung wurde aus der Teilnehmer in den Kohorten enthalten.

(1) Gewebematerial

  1. RCC Gewebeproben am Tag der Operation zu sammeln. Die chirurgische Probe bei Raumtemperatur (Pathologie Abteilung) zu behandeln.
  2. Eine Tumorprobe von ca. 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm Größe in einem Trockenrohr zu sammeln. Snap in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° c lagern
  3. Bestreichen Sie die Proben in optimale Arbeitstemperatur zusammengesetzte. Teilen Sie die Proben mit einem Kryostaten bei-20 ° C in 4-6 µm dicke Abschnitte. Lassen Sie die Proben an der Luft trocknen auf Folien für 12 h und speichern sie direkt bei-80 ° C um Austrocknung zu vermeiden.
  4. Überprüfen Sie die Qualität der Probe durch Anzeigen einer Hämatoxylin und Eosin befleckt Abschnitt.

2. in Situ Immunfluoreszenz-Färbung von TILs

  1. Verfahrensrichtlinien
    1. Alle experimentellen Schritte bei Raumtemperatur.
    2. Führen Sie für alle Schritte die Verdünnungen mit Tris-Puffer Kochsalzlösung (TBS; siehe Tabelle of Materials).
    3. Durchführen Sie das Waschen in TBS für alle außer nach der primären Antikörper Inkubationszeit. Für Letzteres verwenden Tris-Puffer Kochsalzlösung Tween20 (TBST, siehe Tabelle der Materialien). Für Puffer Zusammensetzung und Rekonstitution siehe ergänzende Tabelle1.
    4. Verwenden Sie eine feuchte Kammer für Antikörper Inkubationen und eine Färbung Gefäß zum Waschen.
    5. Lassen Sie nicht im Abschnitt während des Verfahrens austrocknen.
  2. Vorbehandlung
    1. Tauen Sie die Folie mit der Gewebeprobe und trocknen Sie vorsichtig die Folie um die Probe mit einem Papiertuch. Die Reaktionsfläche, enthält das Gewebe mit einem Stift hydrophobe Barriere abgrenzen (siehe Tabelle der Materialien). 2 min. trocknen lassen.
    2. Korrigieren Sie die Proben in 100 % Aceton für 5 min, 2 min, trocken und mit TBS für 10 min waschen.
  3. Sättigung und blockade
    1. Die Folien für 10 min mit 3 Tropfen von Avidin 0,1 % vorbehandeln, Hahn und/oder Streifen der Folie zu verteilen das Avidin und Luftblasen zu entfernen und dann für 10 min mit 3 Tropfen von Biotin 0,01 % zu behandeln (siehe Tabelle der Materialien), tippen oder streichen. Waschen mit TBS.
    2. Führen Sie eine Fc-Rezeptoren-Blockade. 100 µL einer 5 % Volumen/Volumen des normalen Serum in TBS Verwendung Serum aus der gleichen Wirtsarten als der beschriftete Antikörper sekundäre oder tertiäre verdünnt anwenden (siehe Tabelle der Materialien); Hier wurde Esel Serum verwendet. 30 min inkubieren.
    3. Während der Inkubation kurz drehen Sie die Anti-CD8, PD-1 und Tim-3 Antikörper (Table of Materials). Bereiten Sie die Mischung aus primären Antikörper in TBS wie in ergänzenden Tabelle 2beschrieben.
  4. Immuno-Färbung für CD8, PD-1 und Tim-3
    1. Bereiten Sie die primären Antikörper-Mischung. Siehe Tabelle der Werkstoffe und ergänzenden Tabelle 2 für verwendeten Antikörper (Anti-CD8, PD-1, Tim-3 und ihre entsprechenden Sekundärantikörper) und deren Konzentrationen.
    2. Tippen Sie auf und/oder wechseln Sie die restlichen Esel-Serum (in Schritt 2.3.2 hinzugefügt). Inkubieren Sie die Folien mit 100 µL Primärantikörper nicht beschriftet-Mix für 1 h in eine feuchte Kammer.
    3. Während der Inkubation kurz drehen Sie die Cyanin 5 Anti-Kaninchen, AF488-Anti-Ziege und biotinylierte Anti-Maus-Antikörper, und bereiten Sie die Mischung aus Sekundärantikörper wie in ergänzenden Tabelle 2beschrieben.
    4. Waschen Sie den Folien in TBST für 5 min. trocken Folien.
    5. Inkubieren Sie die Folien mit 100 µL der sekundären Antikörper für 30 min in eine feuchte Kammer.
    6. Bereiten Sie die Mischung aus tertiären Antikörper, Cy3-Streptavidin enthält, wie in ergänzenden Tabelle 2beschrieben.
    7. Waschen Sie den Folien in TBS für 10 min. trocknen die Objektträger.
    8. Inkubieren Sie die Folien mit 100 µL der tertiären Antikörper Mischung für 30 min.
    9. Waschen Sie den Folien in TBS für 10 min. trocknen die Objektträger.
  5. Handy-Halterung
    1. Montieren Sie die Folien in einer 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride DAPI-haltigen Montage Medium (1,5 µg/mL DAPI) mit einem Deckgläschen kompatibel für Fluoreszenz-Mikroskopie (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: Als Negativkontrolle für jedes Experiment, eine Folie mit Antikörper Isotype abgestimmt wurde bei der gleichen Konzentration als entsprechende Antikörper verwendet. Für diese Färbung benutzten wir Maus IgG1, Kaninchen IgG und Ziege IgG negativ-Kontrolle-Antikörper (siehe Tabelle der Materialien). Als Positivkontrolle verwendet wir menschliche hyperplasic Tonsillen, die positiv für die getesteten Marker für jedes Experiment bekannt ist. Eine typische Färbung wird in den Ergebnissen (Abbildung 1) beschrieben. Mono-Färbung der CD8, PD-1 und Tim-3 durchgeführt werden einzeln (eine Färbung pro Folie) mit der gleichen Vorbehandlung und ohne DAPI. Eine Folie in der gleichen Versuchsbedingungen ohne Antikörper und nur DAPI Eindeckmedium sollte auch durchgeführt werden. Eine Folie sollte mit identischen Versuchsbedingungen ohne irgendwelche Antikörper und DAPI abgebildet werden.

3. die Fluoreszenzanalyse und automatisierte Zellzahl

  1. Bildaufnahme mit dem automatisierten Mikroskop
    1. Erstellen Sie ein Protokoll.
      1. Die automatisierte Mikroskop-Software und der Fluoreszenz-Beleuchtung einschalten.
      2. In der Menüleiste klicken Sie auf "Datei", "Protokoll erstellen" wählen Sie "DAPI," "FITC" und "TRITC."
      3. Klicken Sie auf "Next", "Gewebekapitel", und klicken Sie auf "Weiter", "Protokollname." Wählen Sie einen Namen, beispielsweise "CD8-PD-Tim-1-3," klicken Sie auf "Next" und "Speichern".
      4. Manuell legen Sie eine Folie auf der Bühne.
      5. Klicken Sie in der Menüleiste auf "setup", "Einstellungen". Klicken Sie in dem neuen Fenster auf "set home Z".
      6. Passen Sie die Belichtungszeit mit einer positiven Kontrolle schieben, d. h. eine CD8, PD-1 und Tim-3 Dreifach-gebeizt mit DAPI-Probe.
      7. Klicken Sie in der Steuerleiste auf "Kontakt."
      8. Passen Sie die Belichtungszeit für jeden Filter, bis eine ausreichende aber nicht sättigbaren Signal erhält.
      9. Gehen Sie für monochrome Bilder wie folgt vor:
      10. Wählen Sie Erwerb und wählen Sie unter "Autofokus" DAPI-Filter.
      11. In der "Scan-Bereich zu begrenzen" wechseln Sie objektiven oben an der oberen linken Ecke der Folie Klicken Sie auf "Markieren". Machen Sie dasselbe für die untere rechte Ecke.
        Hinweis: Dieser Schritt delimitates Bereich der low-Power imaging (LP-Tomographie) bei 4 X; Achten Sie beim Platzieren der Markierung auch so, die Proben der Baureihe umgeben.
      12. Gehen Sie für hohe Leistung (HP) imaging wie folgt vor:
      13. Wählen Sie unter "Autofokus" "DAPI".
      14. Wählen Sie unter "Erwerb" Band "DAPI", "FITC", "Cy3" und "Cy5". Klicken Sie auf "OK". Klicken Sie auf der Menüleiste "Datei", "Save Protocol".
    2. Die Dias zu scannen.
      1. Laden Sie das Protokoll, indem Sie auf "Datei", "Protokoll" aus der Menüleiste laden. Klicken Sie auf "Start".
      2. Geben Sie "Lab ID" (Ordnerspeicherort für Bildspeicher). Geben Sie die Folien-ID um die Folie zu identifizieren. Klicken Sie auf "Weiter".
      3. Klicken Sie auf "Monochrom Imaging" (um zu scannen die ganze Folie unter Hellfeld Licht und aufeinander folgenden Bildern mit einer 4 X Objektiv zu erwerben).
        Hinweis: Dies führt zu eine Graustufen-Übersicht der Folie.
      4. Klicken Sie auf "Muster finden". Wählen Sie den Bereich des Gewebes mit einer niedrigen Auflösung (4 X) gescannt werden: halten Sie die "Strg"-Taste, und klicken Sie auf ein Feld mit dem Cursor auswählen oder deaktivieren Sie die Option Felder (Abbildung 2A).
      5. Fluoreszierend Rot blaugrün Bildaufnahme der einzelnen Felder klicken Sie auf "LP Imaging" (4 x Bildgebung).
      6. Für HP-Feldauswahl "Strg"-Taste gedrückt und klicken Sie auf ein Feld mit dem Cursor zu aktivieren bzw. deaktivieren Felder, die zum Bereich der Gewebe entsprechen, die in hoher Auflösung (20 X) gescannt werden. Wählen Sie 5 Felder (Abb. 2 b).
      7. Klicken Sie auf "HP Imaging" (20 x Bildgebung) für Multispektrale Bilderfassung der einzelnen Felder (Abbildung 2).
      8. Klicken Sie auf "Datenspeicher" zum Speichern von Bildern im Ordner "", die am Anfang im LabID ausgewählt wurde.
        Hinweis: Der Prozess ist zusammengefasst und in Abbildung 2dargestellt. Für jeden Schritt (Erkennung von Gewebe, Feldauswahl) kann ein Algorithmus inkrementiert und geschult durch den Benutzer für eine gesamte automatische Scan-Vorgang.
  2. Fluoreszenz-Bildanalyse und automatisierter Zelle zählen mit gekoppelte Analysesoftware
    1. Die spektrale Bibliothek zu bauen.
      1. Die Bildanalyse-Software zu öffnen.
      2. Öffnen Sie auf der linken Seite "Bibliotheken bauen". Klicken Sie unter "Load Image" auf "Durchsuchen" und wählen Sie ein Mono-gefärbten Bild (z.B.CD8/Cyanin 5).
      3. Wählen Sie das Fluorophor (z.B.Cyanin 5). Klicken Sie auf "extrahieren". Klicken Sie auf "Speichern" in Bibliothek speichern. Klicken Sie auf "Speichern".
      4. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für PD-1, Tim-3 und DAPI Mono-gefärbten Folien um das Spektrum der jedes Fluorophor des Interesses zu integrieren.
        Hinweis: Aufbau der spektralen Bibliothek integriert das Spektrum für jeden Fluorophor verwendet für das spezifische Gewebe (hier: Niere), aber "synthetische" Bibliotheken, die bereits existieren können verwendet werden. Da die Autofluoreszenz Spektrum streng bezogen auf das Gewebe ist, ist es wichtig, ein Auto-Fluoreszenz und spektralen Bibliothek pro Projekt durchzuführen.
    2. Erstellen Sie ein neues Projekt.
      1. Klicken Sie in der Menüleiste "Datei", "Neues Projekt". Wählen Sie in der Registerkarte "Funktion" suchen "" ""Zelle Segmentierung". Wählen Sie im Register "Phänotypisierung" "Phänotypisierung". Klicken Sie auf "Erstellen".
      2. Die repräsentative Bilder in das Projekt zu integrieren.
        1. Klicken Sie in der Registerkarte "Datei" auf "Bild öffnen". Wählen Sie 10 bis 30 repräsentative Bilder der ganzen Serie. Fügen Sie die Folie nicht befleckt, um Autofluoreszenz entfernen. Auf der rechten Seite: Sammlung auswählen Quelle. Fluorophor und wählen Sie die entsprechenden spektralen Bibliothek zuvor gebaut.
      3. Wenn Gewebe Autofluoreszenz entfernen möchten, klicken Sie auf "AF" und wählen Sie dann den Bereich der Autofluoreszenz auf der leeren Folie.
      4. Bild-Behandlung und zusammengesetzte Bilderzeugung.
        1. Klicken Sie auf "Alle vorbereiten", um die Fluoreszenz-Bibliothek und die Autofluoreszenz-Spektren zu erzeugen das zusammengesetzte Bild (Abbildung 3) zu integrieren. Klicken Sie auf das Symbol "Auge" öffnen Sie das Bedienfeld "Ansicht-Editor" und wählen die angezeigten Daten: Wählen Sie die Marken CD8, PD-1, Tim-3 und DAPI. Entfernen Sie die Autofluoreszenz. Folgen Sie den Schritten, die von der Software vorgestellt.
      5. Segment der Zellen.
        1. Um die Zellen, in "Fach" segmentieren wählen Sie aus "Kerne" und "Membran". Im Register "Kerne" DAPI als die nuklearen Gegenfärbung festgelegt.
        2. Geben Sie in der Registerkarte "Maximale und Minimalgröße (px)" "40" und "176" als minimalen und maximalen Größen bzw.. Legen Sie für "Minimum" Signal "0,13". "Split" Registerkarte "set"2,60". "Kerne" Registerkarte "set"0,81". Wählen Sie "Membran-Signal um Segmentierung zu unterstützen".
        3. Klicken Sie auf "Segment Zellen" im Unterteil des Bildschirms. Überprüfen Sie die Segmentierung der Kerne und Membranen der Zellen und mit unterschiedlichen Parametern zu wiederholen Sie, wenn sie nicht die DAPI und Membran Fluoreszenz der Zellen entspricht.
          Hinweis: Die Software erkennt die Zellen mit den nuklearen DAPI Färbung und basierend auf der Zellengröße. Passen Sie die Zellenparameter (Größe, Split, Pixel) nach dem Projekt.
      6. Phänotyp der Zellen.
        1. Klicken Sie im Register "Phänotyp" auf "hinzufügen". Zelle Phänotyp Kategorien erstellen: CD8 (blauer Punkt) / CD8-PD-1 (roter Punkt) / CD8-PD-1-Tim-3 (grüner Punkt) / andere (schwarzer Punkt) (Abbildung 4).
        2. Wählen Sie aus mehr als 5 Beispiele für Zellen der einzelnen Kategorien. Klicken Sie auf "Train Klassifikator".
          Hinweis: Dadurch wird einen statistische Klassifikation-Algorithmus von der Software generiert.
        3. Klicken Sie auf "Alle Phänotyp", um den Phänotyp der einzelnen Zellen zu erhalten.
          Hinweis: Die Software gibt den Phänotyp einer Zelle mit einem Konfidenzintervall (CI) Genauigkeit.
        4. Den Algorithmus wird gesteigert, die Software training, bis die Differenz zwischen Auge und automatisierte Graf konkordante beträgt (Fehler < 5 %). Wählen Sie eine CI, die akzeptabel für die Zellen von Interesse ist.
          Hinweis: Wir entschieden uns für die Ausbildung auf der Grundlage von 55 % CI als akzeptabel zu machen.
      7. Speichern Sie den Algorithmus und Projekt.
      8. Wählen Sie unter "Datei" "Projekt". Nennen Sie es und klicken Sie auf "Speichern".
    3. Führen Sie Batch Analyse der Serie.
      1. Wählen Sie "Batch-Analyse". Wählen Sie das Projekt. Fügen Sie die Bilder zu analysieren. Wählen Sie einen Ordner von Speicher für die Daten. Klicken Sie auf "Ausführen". Überprüfen Sie die Qualität des zusammengesetzten Bildes. Überprüfen Sie die Phänotypisierung für alle Bilder der Serie.
        Hinweis: Die gekoppelten Bildanalyse-Software integriert alle Zelle Fächer (Membran/Zytoplasma/Kerne) Signale. Die Phänotypisierung Schritt ist entscheidend, wenn auch das Training des Algorithmus eine zeitaufwendige Schritt sein kann. Alle Daten der einzelnen Bilder werden in einer txt-Datei. Die Daten einer Zelle (besonders der Phänotyp mit seiner CI gegeben) sind in einer Zeile. Für jede Folie wurden die Bildaufnahme und späteren Grafen auf 5 Feldern durchgeführt.
  3. Integration der Rohdaten und Generation von automatisierten Zellzahl
    1. Berechnen Sie die Daten mit einem statistischen Programm.
      1. Berechnen Sie die Daten aus den 5 Bildern entsprechend der 5 Felder auf 1 Patienten analysiert. Verwenden Sie eine statistische Plattform, und haben ein erfahrener Statistiker, Data Manager oder Datenwissenschaftler die Analyse durchzuführen. Erstellen Sie eine Skript, die automatisch die Zellen je nach ihrer Phänotyp, Auswahl der CI > 55 % zählt.
      2. Setzen Sie alle txt-Dateien der Serie im gleichen Ordner.
    2. Die Daten zu extrahieren.
      1. Setzen Sie alle txt-Dateien in einem Ordner. Das automatische Skript in Schritt 3.3.1 gebaut. Öffnen Sie die Ausgabe-CSV-Datei durch das R-Skript erzeugt. Als .xl Format speichern. Die Ausgabe erfasst die Anzahl der Zellen für jedes Phänotyp (d.h., CD8 allein, CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) für jeden Patienten.
      2. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von Zellen für jeden Patienten pro Feld: Teilen Sie die Anzahl der Zellen pro die Anzahl der Felder (d. h.5), die Anzahl der Zellen für jeden Patienten pro Feld zu normalisieren.
      3. Berechnung des Prozentsatzes der PD-1+ Zellen unter insgesamt CD8+ T, und Tim PD-1+ -+ 3 Zellen unter insgesamt CD8+ T Zellen. Siehe Abbildung 5 für diesen Schritt im Überblick.
        Hinweis: R Sprache (oder andere Programmier-Software der Wahl) ist erforderlich, um korrekt zu erstellen und die Befehle ausführen, und ein erfahrener Benutzer oder Statistiker/Daten Wissenschaftler ist also unerlässlich. Das R-Programm kann die Daten des gleichen Patienten berechnen sollte, aber die Namen der 5 .txt Dateien eines Patienten einen identischen Anfang, einen eindeutigen Bezeichner der Patienten entsprechend.
  4. Statistische Analyse
    1. Verwenden Sie Statistiksoftware für die statistische Auswertung der Ergebnisse.
    2. Führen Sie entsprechende statistische Analysen mit Hilfe der Statistiker.
      1. Verwendung der nicht-parametrische Wilcoxon unterzeichnet Rang Tests zum Vergleich von PD-1 MFI zwischen zwei Zelle Phänotypen (Abbildung 6). Korrelieren Sie die Kovariate und histologischen Merkmale mit einem Pearson-Chi-Quadrat-Test.
      2. Verwenden Sie eine Kaplan-Meier-Methode zur Schätzung der Progression free Survival und Cox Regressionsmodelle, die Kovariate Auswirkungen auf Zeitereignis-Ergebnisse, wie die Gesamtüberlebenszeit und krankheitsfreien Überlebens zu schätzen.
      3. Prüfen, p-Werte als 0,05 als signifikant zu senken.

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Representative Results

Über das allgemeine Protokoll beschriebenen, wir wollten intratumorale CD8 quantifizieren+ T-Zellen die hemmenden Rezeptoren PD-1 und Tim-3 im gefrorenen Gewebe von Patienten mit RCC und die Ergebnisse korrelieren mit klinischen Ergebnisse25Co zum Ausdruck zu bringen.

Optimierung der CD8/PD-1/Tim-3 Färbung:

Verschiedene Arten von Antikörpern (Maus, Kaninchen und Ziegen, siehe Tabelle Material) wurden ausgewählt, um Kreuz zwischen den verschiedenen Antikörpern zu vermeiden. Das Protokoll wurde auf eine Tonsille ist eine organisierte Lymphgewebe validiert. PD-1 Färbung gefunden in den germinal Zentren (Abbildung 1), während CD8 und Tim-3 Färbung befinden sich rund um die germinal Center. Die Beobachtung der diese typische Färbung bestätigt dieses Protokolls. Die Färbung wurde auch auf das Gewebe von Interesse (z. B. Nierentransplantation) validiert.

Das Fehlen des Signals des primären Antikörpers mit ihren nicht entsprechenden Sekundärantikörper (Daten nicht gezeigt) inkubiert wurde bestätigt. Genau die Fluoreszenz-Färbung zu analysieren und zu bestimmten Spektrenbibliotheken einzelne Folien wurden einzeln gefärbt mit einzelnen Marker (CD8, PD-1, Tim-3 oder DAPI) in das Gewebe des Interesses (Niere). Eine nicht-gefärbten Folie unter den gleichen Bedingungen ist notwendig, die Autofluoreszenz des Gewebes zu extrapolieren. Die Färbung wurde das automatisierte Mikroskop analysiert die Spektren der verschiedenen Fluorophore integriert; jede Markierung war gut differenzierte und keine Überlappung der Marker beobachtet wurde (Abbildung 3).

Quantitative und Qualitative Merkmale der CD8 + In 87 RCC Patienten zu infiltrieren:

Ergebnisse zeigten, dass etwa die Hälfte der CD8-Zellen+ T express PD-1 (mittlere 53,9 %; SE: 30,49 %) und über ein Drittel waren doppelt positiv PD-1+ Tim-3+ (mittlere 38,16 %; SE: 28,11 %). Tim-3 Ausdruck ohne PD-1 Expression in weniger als 3 % der CD8 erkannt wurde+ T Zellen (Daten nicht gezeigt). Die mittlere Zahl der CD8+ T Zelle Subpopulationen waren: total CD8+ T Zellen 116,5 (SE: 216), PD-1+ CD8+T Zellen 89.32 (SE: 191,8), PD-1+ Tim-3+ 66,9 (SE: 143), und PD-1+ Tim-3– CD8 + T-Zellen 22.38 (SE: 57,5) pro Feld. Die Gesamtzahl der intratumorale CD8+ T Zellen korrelierte positiv mit dem Prozentsatz der PD-1+ Tim-3+ auf CD8+ T Zellen.

Funktionelle Charakterisierung der CD8 + T-Zellen abhängig von ihrem Phänotyp PD-1 und Tim-3:

PD-1 Expression Ebene tritt bekanntermaßen korreliert werden mit T-Zell-Erschöpfung so dass wir als nächstes Ziel, PD-1 Expression auf CD8 messen+ T Zellen nach Tim-3 Ausdruck stand. Wie der mittlere Fluoreszenzintensität der verschiedenen Fluorochromes auf zellulärer Ebene berichtet, eine kleine Serie von Patienten wurden manuell analysiert für die Datenverbindungen: Ergebnisse zeigten eine Korrelation von PD-1 Membran MFI mit der Zelle-Untertyp. PD-1 Fluoreszenz Intensität war gemessen (Abbildung 6) auf zellulärer Ebene auf PD-1+ Tim-3+ versus PD-1+ CD8 Tim-3– + T-Zellen (eine Scheibe) und auf der Ebene der einzelnen Patienten nach verschiedenen zu integrieren Zelle Signale auf einem Gewebe-Abschnitt. In einer Reihe von 9 Patienten festgestellt ein Vergleich mit gepaarten Wilcoxon-Test, dass PD-1 MFI höher ist, wenn Tim-3 Co ausgedrückt wird, verstärken die funktionelle Relevanz von Tim-3 Ausdruck (B-Panel).

Ausdruck der PD-1 und Tim-3 Liganden an der Oberfläche der Tumorzellen aus mehreren Co-Färbung:

Da T-Zell-Erschöpfung durch Rezeptor/Ligand Interaktion vermittelt wird, wir beurteilt die Expression von PD-1 und Tim-3 Liganden (PD-L1 und Galectin-9 (Gal-9), beziehungsweise) auf Nierentumor Zellen durch Pan-Keratin Färbung gekennzeichnet. Positivität ist definiert als ein Cut-off von 10 % der Tumorzellen mit dem Ausdruck des Markers: (i) 58 von 87 Patienten (66 %) waren positiv für PD-L1; (Ii) alle 15 Tumoren analysiert waren positiv für die Gal-9 (Abbildung 7A, B).

Klinische Auswirkungen des Co Ausdrucks von Tim-3 + PD-1 + auf CD8 + T-Zellen:

Tumor Node Metastasis (TNM) erzielte, Fuhrman Grade, Tumorgröße und UISS Partitur sind histologische Eigenschaften (kombiniert mit klinischen Score für UISS) verwendet, um die Prognose des primären RCC definieren. Wurde eine positive Korrelation zwischen der Anzahl bzw. Anteil der Tumor infiltrieren CD8 beobachtet+ T Zellen auszudrücken, PD-1 und Tim-3 (aber nicht mit dem Ausdruck nur PD-1 ohne Tim-3) mit allen diesen Parametern (Tabelle 1). Im Einklang mit diesen mehr abwertende Phänotyp, RCC Patienten mit CD8-+ T Zellen zusammen mit dem Ausdruck Ihrer PD-1 und Tim-3 über die mittlere Prozentsatz (34,7) waren eher bis zum Rezidiv (p = 0.046; HR 2,9; 95 % CI: 1.02-8,21). Dieser Zusammenhang wurde nicht beobachtet, mit dem Prozentsatz der PD-1 auf CD8+ T-Zellen unabhängig von Tim-3 Status (Tabelle 2). Auch zeigte sich eine Korrelation zwischen den Prozentsatz der CD8+ T Zellen zusammen mit dem Ausdruck Ihrer PD-1 und Tim-3 und die 36 Monate insgesamt Überlebensrate (Daten nicht gezeigt). Wir überprüft auch die dreifache Immunostaining auf Tonsillen Paraffin Gewebe (Abbildung 1).

Figure 1
Abbildung 1: CD8-PD-1-Tim-3 Immunostaining auf Tonsillen Paraffin-eingebetteten Gewebe. Paraffin eingebettete Gewebe, die Abschnitte anstelle von kryokonservierten Abschnitte für dreifache Immunostaining ausgewählt wurden. Nach entwachsen und Rehydrierung wurde das gleiche Protokoll der kryokonservierten Abschnitte vorher entwickelt Färbung angewendet. CD8+ T Zellen befinden sich außerhalb der germinal Center und nicht-CD8-+ -T-Zellen mit dem Ausdruck PD-1 sind in der germinal Mitte gruppiert. Die Mikroskop-Vergrößerung ist 20 X und die Maßstabsleiste stellt 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: automatisierte Analyse von Gewebeproben renal Cell Carcinoma. Nach der Gewebe-Erkennung im Hellfeld Bild (A, Skala bar 1 mm), 4 x Mikroskop-Vergrößerung niedriger Auflösung Bildgebung in RGB (rot blau grün herkömmlichen Fluoreszenz) zur Auswahl der Felder (B, Skala bar 500 µm dient. Das volle rote Quadrat stellt ein Feld dar. Ein hochauflösendes Bild (multispektrale Cube Fluoreszenzbild spezifisch für diese Technologie) mit 20 X Vergrößerung von multispektralen Mikroskop durchgeführt wird (C, Skala bar 100 µm) angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: multispektralen Mikroskopie und Software gekoppelt Analyse zur Erzeugung von ein zusammengesetztes Bild von Nierenzellkarzinomen (20 x Mikroskop-Vergrößerung). Die hohe Auflösung raw-Bild (A) ist eine fluoreszierende Bild des Feldes nach multispektralen Scannen durch Fluoreszenz Filter Kuben. Blau-Signal ist AF488, rot ist Cyanin 5 und grün ist Cyanin3. Die Zusammenführung zeigt verschiedene Farben, z.B. gelb ist eine Zusammenführung der drei Fluorophore. Dieses Bild wird in der Bildanalyse-Software integriert. Integration der spektralen Library ermöglicht eine präzise Spektrum Trennung der einzelnen Fluorophor und Autofluoreszenz führt zu einem fluoreszierenden zusammengesetztes Bild (B). Repräsentative Farben werden vom Betreiber ausgewählt: blau zeigt Cyanin 5 (CD8), Red Cyanin 3 (PD-1), Green AF488 (Tim-3). Zusammenführen von Mix Farben wie lila dient für doppelte Positive CD8-PD-1. Der Maßstabsbalken entspricht 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: PD-1 und Tim-3 Ausdruck auf Tumor infiltrieren CD8-Zellen auf eine klar Zelle renal Cell Carcinoma Probe analysiert durch Fluoreszenz multispektralen imaging-Technologie (20 x Mikroskop-Vergrößerung)+ T. (A) CD8 (blau), PD-1 (rot) und Tim-3 (grün) waren voller Flecken auf gefrorene Gewebeschnitte von RCC Patienten abgeleitet. NS1 dieser drei Marker kann erkannt werden, durch die Zusammenlegung der Mono-Färbung Bilder. Isotype Kontrollen wurden in jedem Experiment durchgeführt. Der Maßstabsbalken entspricht 20 µm. gelb Boxen Co gefärbten Zellen zu identifizieren: eine Tim-3– PD-1+ CD8-Zellen und eine Tim-3+ PD-1+ CD8-Zellen. (B) Triple Co für CD8 Färbung, PD-1 und Tim-3 (fusioniert) ist auf der linken Seite mit der Meldung, dass grün dargestellt CD8 ist+ T Zellen zusammen mit dem Ausdruck Ihrer PD-1 und/oder Tim-3. Für die automatische Zählung mit der Bildanalyse-Software, setzt die Identifizierung der Zellen auf das Vorhandensein von nuklearen Färbung (DAPI); die Zelle Segmentierung basiert auch auf morphometrische Eigenschaften als rote Grenzen (mittlere Panel) dargestellt. Ein Algorithmus trainiert durch den Nutzer bis Konkordanz mit visuellen Graf (rechts) durchgeführt wird und nach automatisierten Phänotypisierung identifiziert grüne Punkte als CD8+ T Zellen zusammen mit dem Ausdruck PD-1 und Tim-3, rote Punkte als CD8+ T-Zellen mit dem PD-1 ohne Ausdruck Tim-3 und blauen Punkten als CD8+ T-Zellen nicht mit dem Ausdruck Ihrer PD-1 oder Tim-3. Der Maßstabsbalken entspricht 20 µm. gelb zeigt die PD-1 und/oder Tim-3 ausdrücken CD8+ T Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Computing die Rohdaten der multispektralen Analyse. Die Daten des Grafen von jeder Zelle Kategorie vorhanden in den einzelnen Bereichen (d.h., 5 Felder/Patient, d. h., 5 .txt-Dateien) werden nach der Bildanalyse. Eine R-Skript kombiniert die 5 Felder Daten, unter Berücksichtigung nur Zellen mit einem Konfidenzintervall > 55 % Wildreben. Die Mikroskop-Vergrößerung ist 20 X und die Maßstabsleiste repräsentiert 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Zellen zum Ausdruck bringen höhere PD-1 im Vergleich zum PD-1+ Tim-3– CD8+ T-Zellen in Nierenzellkarzinom. Die Intensität der PD-1 wird auf zellulärer Ebene (linken) erkannt, indem in Situ Immunfluoreszenz-Analyse auf PD-1+ Tim-3+ und PD-1+ CD8 Tim-3– + T Zellen. Auf der individuellen Ebene (mittlere Panel): Ergebnisse sind für die gesamte CD8 dargestellt+ T Zelle Teilmengen PD-1+ Tim-3+ versus PD-1+ Tim-3– vorhanden auf einem Gewebe (z.B. ein Patient; Mann-Whitney-Test). Vergleichende Analyse der die mittlere Intensität der PD-1 wurde in einer Reihe von 9 Patienten (rechte Abbildung) gemessen (Wilcoxon-Test, p-Werte geringer als 0,05 als signifikant angesehen wurden). Die Mikroskop-Vergrößerung ist 20 X und die Maßstabsleiste stellt 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: PD-L1 und Gal-9 d.h. PD-1 und Tim-3 Liganden Färbung auf Nierenzellkarzinom. (A) Tumor Zellen werden durch Pan-Keratin Färbung identifiziert. Co Färbung des PD-L1 und Pan-Keratin (eine Scheibe) identifiziert die Expression von PD-L1 auf Tumorzellen in 58 Patienten aus 87 analysiert. (B) Galectin-9 äußerte aller 15 Tumoren von RCC Patienten analysiert. Positivität galt, wenn Sie mindestens 10 % der Zellen für die Marker analysiert gefärbt waren. Isotype Kontrollen waren für jede Färbung enthalten. Gelbe Felder stellen positive Tumor (pan-Keratin +) Zellen für PD-L1 (zentrale A) oder Galectin-9 (Gruppe B). Die Mikroskop-Vergrößerung ist 20 X und die Maßstabsleiste stellt 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

%/CD8+ -T-Zellen PD-1+ PD1+ Tim-3+ PD-+ Tim 1-3–
TNM 0,04 0,003 0,22
Furhman 0,01 0,004 0,74
Größe des Tumors 0,08 0,01 0,37
UISS 0,01 0,01 0,63

Tabelle 1: Korrelation zwischen der Expression von PD-1 allein oder kombiniert mit Tim-3 auf CD8+ T Zellen und Klinische prognostische Parameter des RCC Patienten: p-Werte. Der Anteil der PD-1+, PD-1+ Tim-3+ oder PD-1+ Tim-3– auf CD8+ T Zellen ausgewählt, da eine kontinuierliche Variable gemessen in Situ Immunfluoreszenz in der Kohorte von 87 Patienten korreliert war mit verschiedenen klinischen Parametern definiert als eine Binärdatei (TNM, Fuhrman Grade, UISS Partitur) oder eine kontinuierliche Variable (Größe des Tumors). TNM gliederte sich in zwei Gruppen: lokalisierte Erkrankung (pT1 und pT2) und fortgeschrittener Erkrankung (pT3, pT4, N+oder M+). Fuhrman Grade wurde definiert als Low (Klasse I oder II) und hoch (Grad III oder IV) und die UISS Partitur gliederte sich in 3 Klassen (0, 1 und 2). P-Werte zeigt eine signifikante Korrelation werden fett dargestellt.

CD8+ Teilmenge/CD8 T-Zellen PD-1+ Tim-3+ PD-+ Tim 1-3–
Median (%) 34,7 8.6
Korrelation mit PFS P = 0.046 P = 0,8

Tabelle 2: Zusammenhang zwischen PD-1 und Tim-3 Co Ausdruck auf CD8+ T Zellen und Progression free Survival. Zwei Gruppen von RCC-Patienten (n = 87) je nach dem Prozentsatz der PD-1 ohne Tim-3 (rechts), PD-1 und Tim-3 (links) im Verhältnis zu den Median individualisiert. Die Korrelation mit dem PFS wurde mit dem Median als ein Cut-off ausgewählt. P-Werte zeigt eine signifikante Korrelation werden fett dargestellt.

Zusätzliche Tabelle1: Zusammensetzung der TBS und TBST Puffern. TBS ist für Antikörper Mixe und Verdünnungen verwendet. Für Waschungen werden alle Schritte ausgeführt mit TBS mit Ausnahme der Wäschen nach Primärantikörper, wo TBST empfohlen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Zusätzliche Tabelle 2: detaillierte Antikörper Mischen Zusammensetzung für CD8-PD-1-Tim-3 Immunfluoreszenz beflecken. Denn jeder primäre, sekundäre und tertiäre Antikörper mischt, ist die Verdünnung in das entsprechende Volumen des TBS durchführen für ein Gesamtvolumen von 1 mL gegeben. Für eine Folie ist die notwendige Reaktion insgesamt 100 µL für einen Gewebebereich von 2 cm2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

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Discussion

Modifikationen und Fehlerbehebung:

Die Gewebe-Qualität ist ein wichtiger Parameter. Es kann leicht von Hämatoxylin und Eosin Färbung überprüft werden.

Ein Vorteil des Verfahrens ist die Möglichkeit der gemultiplexten Keramikschalen, aber zur Vermeidung von Fluorophor Spillover empfohlen, um Emission Wellenlängen mit Delta von 10 nm mindestens zu wählen. Hier, weil wir 4 Keramikschalen einschließlich DAPI hatten, wir entschieden uns für die Wellenlängen zu verteilen (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, Cyanin 3:570 nm, Cyanin 5:670 nm). Das Risiko von überlappenden Signale von verschiedenen Fluorophore wird vermieden, durch die Verwendung der Software, um das reine Spektrum der Fluorophor aus einem gemischten Emission Signal, kombiniert mit einer automatisierten Bildanalyse zu berechnen. Die Mono-gefärbten Folien bestätigen auch das Fehlen von Überschneidungen zwischen Fluorophore und wirken als eine Entschädigung durch die spektrale Bibliothek.

Positivität für einen Marker in einer Zelle kann manchmal schwierig zu bestimmen, ob die Färbung/Fluoreszenz schwach ist. Die negative-Kontrolle in jedem Experiment enthalten ist ein guter Weg, um eine Schwelle von Positivität zu bestimmen.

In der gekoppelten Software verwendet, um Bilder zu analysieren ein scoring Schritt zur Bestimmung der Positivität der Zelle vorhanden ist, aber es nur kann zwei Markierungen gleichzeitig analysieren. Weil wir haben dreifach Färbung auf der gleichen Zelle (CD8, PD-1 und Tim-3), wählten wir die Phänotypisierung Schritt.

Die Phänotypisierung Schritt ist oft mühsam, vor allem, wenn die Art der Färbung und Hintergrund Variable aus einer Probe ist.

Grenzen der Technik:

Auch wenn die Anzahl der co-Färbungen ein Vorteil im Vergleich zu herkömmlichen Fluoreszenz ist, ist es nicht möglich, viele Farben wie Durchflusszytometrie zu analysieren. Vor allem, wenn die NS1 mehrere Marker untersucht wird, bewusst sein, für Sensibilität, die niedriger im Vergleich mit der konfokalen Mikroskopie (20 x Mikroskop-Vergrößerung, etwa 0,5 µm im Vergleich zu 0,1 µm pro Pixel für konfokale, je nach Marke) und Überprüfen Sie, ob Fluorophor Spillover (siehe kritische Schritte in das Protokoll, unten).

Eine große Einschränkung der Technik ist die Rohdaten-Format. Die Rohdaten sind txt-Dateien, die möglicherweise schwierig zu bedienen. Da die Software eine .txt-Datei pro Bild mit CI für den Phänotyp gibt, ist die manuelle Behandlung der einzelnen der 5 Dateien pro Patient einer großen Reihe sehr mühsam. Spezialist für Bioinformatik ist erforderlich, um alle Daten in einer Statistik-Software zu berechnen.

Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden:

Gemultiplexten befleckenden Analyse ist problemlos möglich. Im Vergleich zu Durchflusszytometrie, die frische Proben analysiert, ermöglicht diese Technik eine schnelle Zählung in einer reproduzierbaren Methode der anderen Zelle Teilmengen im Tumor Mikroumgebung, in großen Kohorten von gefrorenen Proben mit einem automatisierten Verfahren26 ,27. Konnten wir uns automatisch verlassen, Infiltration von CD8+ T-Zellen mit dem Ausdruck Ihrer PD-1 und Co mit dem Ausdruck ihrer Tim-3 oder nicht in der Umgebung des RCC. Die automatische Zählung vermeidet einige Vorurteile wie Ermüdung der Augen und nicht reproduzierbaren Graf und ist nicht zeitaufwendig.

Da die großen Kohorte studiert auf eingefrorene Samenprobe war, hatten wir Retrospektive Daten, damit wir die absolute Zahl oder ein Prozentsatz von der CD8 verknüpfen könnte+ T Zelle Teilmengen mit biologischen Parametern und Therapieergebnis. Da gibt es eine wichtige Heterogenität der immun Infiltration von einem Patienten auf einen anderen28, bedeutet dies einen Vorteil im Vergleich zu Fluorocytometry, die nur MFI und Prozentsatz aber nicht die Infiltration Grade berichtet.

Die Fluoreszenzintensität wird für jede Zelle quantitativ gemeldet, und in die andere Zelle Fächer (Membran/Zytoplasma/Kerne), bewerten wir die Ebene der PD-1 Färbung von MFI an der Membran. Dies ist ein weiteres interessantes Tool, das Durchflusszytometrie ähnlich ist. Wir fanden, dass die PD-1+ CD8+ T Zellen, die mit dem Ausdruck Tim-3 hatte höheren Ausdruck von PD-1 und standen im Zusammenhang mit einer schlechten Prognose (Auswirkungen auf die Progression free Survival). Unseres Wissens ist es die erste Studie, die mit dieser Methode, die eine klinische Bedeutung einer bestimmten Zelle Teilmenge zeigt.

Zukünftige Anwendungen:

Der Anwendungsbereich ist immens. Wir auch eine andere bestimmte Zelle Teilmenge in Lunge-Krebs-Tumor Mikroumgebung hervorgehoben: die Gewebe Residenten Speicher T-Zellen genannt TRM (CD103+ CD49a+), und sie sind korreliert mit einer besseren allgemeinen überleben21,29 ,30. In einer weiteren Arbeit mit dieser Technik, unser Team gefunden, dass PD-L1 wurde auf Tumorzellen in ein Untertyp von Lungenkrebs mit einer anaplastische Lymphom Kinase (ALK) Neuordnung überexprimiert, und dieser Ausdruck mit CD8 korreliert war+ T10zu infiltrieren. Diese Technik eignet sich für die Bewertung der kritischen biologischen Parameter in verschiedenen Kontexten und ein wertvolles Instrument zur Entdeckung von Biomarkern darstellen kann. Da die Xy-Koordinaten vorgegeben sind, ist es eines der ersten Werkzeuge zu studieren die Topographie und Zell/Zell-Interaktionen mit Leichtigkeit31.

Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls:

Die entscheidenden Schritte gehört die Optimierung der Zusammenarbeit Färbung, was zeitaufwändig sein kann. Die Wahl eines guten Antikörpers ist sehr wichtig, zum Beispiel sind mehrere Klone auf Tim-3 im vorliegenden Fall geprüft worden. Darüber hinaus können verschiedene Fluorophore für die gleiche Markierung unterschiedlichen Ergebnissen führen, so ist es wichtig, verschiedene Kombinationen auszuprobieren. Prüfung der Färbung Spezifität mit Antikörpern, die zusammen nicht reagieren sollte, wird empfohlen. Trotz der Möglichkeit, mehrere Fluorophore zur gleichen Zeit zu analysieren wird es empfohlen, die Spillover mit den Mono-gefärbten Folien werden gesucht. Ein weiterer entscheidender Schritt ist die Phänotypisierung Schritt, von der abhängt, Manual Training sorgfältig durchzuführen.

Insgesamt stellt die Verwendung dieser Multiplex Technik durch einen versierten Operator ein elegantes Werkzeug, um mehrere Zelle Teilmengen der lokalen immun zu infiltrieren, zu analysieren, die von Bedeutung ist, da die peripheren Blut-Analyse nicht Vertreter des lokalen Tumors Umgebung.

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Disclosures

Alle Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse vom Institut National du Cancer (INCA) (ET), Ligue Contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex Immuno-Onkologie (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET). EdG wurde durch ein Stipendium der Fondation ARC finanziert. EV und CD wurden durch ein Stipendium der APHP (Bourse Année recherche) finanziert. ChB ist durch ein Stipendium der Université Sorbonne Paris Cité (Contrat Doktoranden) finanziert. Die Autoren danken Bristol-Myers Squibb für ihre Finanzierung in diesem Projekt. Die Autoren danken die Abteilung für Pathologie des Hopital Européen Georges Pompidou und Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel und Gisèle Legall). Die Autoren danken die Histologie-Plattform von PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging  Perkin Elmer CLS142338
inForm cell analysis 2.1. Perkin Elmer CLS135781
R software https://www.r-project.org
Dakopen delimiting pen Dako S2002
Tris Buffer Salin TBS Tablets Takara, Bio Inc. TAKT9141Z pH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) Takara, Bio Inc. TAKT9142Z pH 7.6 100 tablets
Biotin blocking system Dako X0590 Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serum Jackson Immunoresearch 017-000-001 5% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPI Sigma-aldrich F6057 1.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslip Knittel Gläser, 100039 24x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V novus NBP1-79055 use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NAT abcam ab52587 use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3 R&D AF2365 use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 Roche 7309457001 use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 Cell Signalling 4528 use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9 R&D AF2045 use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-175-152 use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 715-066-150 use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG abcam ab150133 use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidin Amersham PA43001 use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1 Dako X0931 use at 2 µg/mL
IgG from goat serum Sigma-aldrich I5256 use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serum Sigma-aldrich I5006 use at 4µg/mL

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References

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