Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Мультиплексированных помощью иммунофлуоресцентного анализа и количественной оценки внутриопухолевых PD-1+ Тим-3+ CD8 клетки+ T

Published: February 8, 2018 doi: 10.3791/56606
Automatic Translation
1, 2,3,4, 2,3, 2,3, 2,3,5, 6, 7, 2, 2, 2, 2,3,6, 8, 2,3, 4, 2,6, *4, *2,4
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou
* These authors contributed equally

Summary

Изучая микроокружения опухоли может идентифицировать прогностическое или интеллектуального биомаркеров клинической реакции на иммунотерапию. Представленные здесь, инновационный метод основан на в situ флуоресценции многоспектральных изображений для анализа и рассчитывать автоматически различных субпопуляций CD8+ T клетки. Этот воспроизводимый и надежный метод подходит для анализа больших когорты.

Abstract

Иммунные клетки являются важными компонентами микроокружения опухоли и влияние роста опухоли и эволюция на всех стадиях канцерогенеза. В частности теперь хорошо известно, что иммунной проникнуть в человека опухоли можно соотнести с prognosis и ответа на терапию. Анализ иммунной проникнуть в микроокружения опухоли стал серьезной проблемой для классификации пациентов и ответ на лечение.

Совместное выражение рецепторов ингибирующих такие программы клеток смерть белок 1 (PD1; также известен как CD279), цитотоксических Т-лимфоцитов связанные белка (CTLA-4 4), Т-клеток иммуноглобулина и муцина содержащих протеин-3 (Тим-3; также известен как CD366) и лимфоцитов Активации генов 3 (ЛАГ-3; также известен как CD223), является отличительной чертой истощения Т-клеток. Мы разработали многопараметрических в situ иммунофлюоресценции, пятнать для идентификации и количественной оценки на клеточном уровне совместного выражение этих рецепторов ингибирующих. На ретроспективной серии замороженные ткани почечно-клеточной карциномы (РСС), с использованием многоспектральных изображений технологии флуоресценции в сочетании с анализа изображений программное обеспечение, что Сопредседатель выражение PD-1 и Тим-3 было установлено на опухоли, проникнув CD8+ T клетки связан с плохой прогноз в РКЦ. Насколько нам известно, это представляет собой первое исследование демонстрирует, что это Автоматизированная технология мультиплексный в situ могут иметь некоторые клиническое значение.

Introduction

В последние несколько лет иммунотерапия стала весьма перспективным лечения для многих видов рака, включая РСС. В частности иммунотерапия, основанные на ингибирование ингибирующее контрольно-пропускных пунктов, как PD-1 и CTLA-4 было сообщено быть клинически эффективным1,2,3,4,5, 6. моноклональных антител против CTLA-4, PD-1, или программа смерти лигандом 1 (PD-L1) уже утвержденных в несколько рака и привести к длительной клинических ответов в более чем 20% больных7. Тем не менее не все пациенты ответчиков, стоимость лечения является высокой, и эти процедуры являются токсичными, приводит к потенциальные серьезные аутоиммунных как побочные эффекты. Таким образом текущий задача заключается в определении прогнозных маркеров для этих новых immunotherapies. Соотнести с клинической реакции были зарегистрированы темпы мутаций в опухоли, выражение PD-L1 или уровней внутриопухолевых CD8+ Т-клеток инфильтрата. Однако эта Ассоциация еще слишком слаб, чтобы рекомендовать использование этих клинических биомаркеров в клинической практике за исключением компаньона тест для PD-L1 до отправления Pembrolizumab в немелкоклеточного легких рака легкого (НМРЛ) пациентов8 ,9,1011,12. Доказано, что Сопредседатель выражение многих рецепторов ингибирующих как PD-1, Тим-3, ЛАГ-3, и CTLA-4, индуцирует ячейки истощение фенотипа и устойчивость к терапии13,14,15. Так как периферической крови не является представителем микроокружения опухоли, он представляет большой интерес для анализа Фенотипические особенности клеток в situ. PD-1 и Тим-3 совместно выражая Т-клетки известны как функционально нарушениями клеток в нескольких контекстах13,16,17. В это исследование, прогнозные последствия совместного выражение двух рецепторов ингибирующих PD-1 и Тим-3 на CD8+ T оценивалась клетки.

Вверх до сих пор, изучая Сопредседатель выражение несколько маркеров на опухоли, проникнув лимфоцитов (Тилс) главным образом выполнялись cytometry анализ потока, что делает необходимым для работы на свежие опухоли и поэтому исключающие ретроспективный анализ. С обычными в situ окрашивание, только один пятная единовременно может быть выполнена, и характеристика типа клеток, которые совместно выражает маркеры не возможен. Например PD-L1 выражается многие типы клеток микроокружения опухолевых, что делает его трудно определить путем анализа обычных иммуногистохимии, какие ячейки, выражая PD-L1 более актуальны для корреляционного исследования. В этой работе, мы разработали инновационные в situ многопараметрических иммунофлюоресценции метод подсчета компьютер для корреляции со выражение PD-1 и Тим-3 опухоли, проникнув CD8+ Т-клеток с клинические исходы в РКЦ. Этот метод имеет ряд преимуществ, включая возможность для анализа на уровне одной ячейки и несколько маркеров в то же время с помощью многоспектральной камеры, которые могут захватить ограниченным интервалом > 10 Нм через жидкий кристалл фильтры18. Кроме того процедура является автоматической что позволяет воспроизводимость между оператором и сокращенный анализ по сравнению с методами руководства19. В области рака несколько исследований сообщалось, убедить несколько stainings молекул иммунной как PD-1, ПД-L1 и CD8 в Меркель клеточной карциномы, рака легких и головы и шеи рак20,21,22, 23. число автоматизированных ячеек возможна с подготовки пользователем (фенотип шаг). Флюоресценция измеряется в различных клеточных компартментов (ядер, цитоплазмы и мембраны).

Здесь, различные подмножества проникновения опухоли CD8+ T-клеток выражая PD-1 и/или Тим-3 в большой когорты РСС были подсчитаны и результаты коррелировали с параметрами выживания и тяжести клинической оценки. Было также можно анализировать интенсивности флуоресценции мембраны на сотовой резолюции с данными означают интенсивности флуоресценции (MFI) как в цитометрии. Насколько нам известно, это первый отчетности прогнозные результаты исследования с использованием этой многоспектральных изображений на основе фото технике.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Это исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларации и был одобрен Комитетом местных этики (CPP Иль де Франс nr. 2012-05-04). Информированное согласие было получено от участника, включены в когортах.

1. ткань материала

  1. Сбор образцов ткани РСС на день операции. Обработайте хирургического образца при комнатной температуре (отделение патологии).
  2. Соберите образец опухоли примерно 0,5 х 0,5 см x 0.5 см размер в сухую пробирку. Оснастки замораживание в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C.
  3. Герб образцы оптимального раскроя температуры смеси. Раздел образцы с криостата при-20 ° C толстые разделов 4-6 мкм. Пусть образцы воздуха сухой на слайдах для 12 h и непосредственно хранить их в-80 ° C, чтобы избежать высыхания.
  4. Проверьте качество образца, просмотрев гематоксилином и эозином, окрашенных раздел.

2. в месте иммунофлюоресценции окрашивание Тилс

  1. Процедурные руководящие принципы
    1. Выполните все экспериментальные при комнатной температуре.
    2. Для всех шагов выполняют разведений с трис буфер солевой (TBS; см. Таблицу материалы).
    3. Выполните промывку в TBS для всех шагов за исключением после основное антитело инкубации. Для последних, используйте буфер Tris физиологический Tween20 (TBST, смотрите Таблицу материалы). Для буфера композиции и воссоздание см Справочная таблица 1.
    4. Используйте камеру влажности для инкубаций антитела и окрашивание jar для стирки.
    5. Не позволяйте секции высохнуть во время процедуры.
  2. Предварительная обработка
    1. Оттепель слайд, содержащий образец ткани и тщательно высушить слайд вокруг образца с бумажным полотенцем. Разграничивать области реакции, содержащий ткань с ручкой гидрофобный барьер (см. Таблицу материалы). Химчистка на 2 мин.
    2. Исправьте образцы в 100% ацетона для 5 мин, сухой за 2 мин и мыть с TBS за 10 мин.
  3. Насыщенность и блокада
    1. Предварительной обработки слайды для 10 мин с 3 капли 0,1% авидин, крана и/или фильм на слайд, чтобы распространять авидин и удалить пузырьки воздуха и затем обращаться за 10 мин с 3 капли биотина 0,01% (см. Таблицу материалы), кран, или Флик. Вымойте с TBS.
    2. Выполните ФК блокады рецепторов. Применить 100 мкл 5% Объем/объем нормальной сыворотки, разбавленный TBS. использования сыворотки от того же вида узла как обозначенное антитело вторичного или третичного (см. Таблицу материалы); Здесь был использован осла сыворотки. Инкубируйте 30 мин.
    3. Во время инкубации кратко спина анти CD8, ПД-1 и Тим-3 антител (Таблица материалов). Подготовьте смесь первичных антител в TBS, как описано в дополнительной таблице 2.
  4. Иммуно окрашивание для CD8, ПД-1 и Тим-3
    1. Подготовьте смесь основное антитело. Обратитесь к Таблице материалы и Дополнительная таблица 2 для антитела, которые используются (анти CD8, ПД-1, Тим-3 и их соответствующие вторичные антитела) и их концентрации.
    2. Коснитесь и/или проведите оставшиеся осла сыворотки (Добавлено в шаге 2.3.2). Инкубируйте слайды с 100 мкл-меченых первичного антитела смеси на 1 ч в камере увлажненной.
    3. Во время инкубации кратко спина анти кролик цианиновые 5, AF488-анти коза и биотинилированным против мышиных антител и подготовить смесь вторичные антитела, как описано в дополнительной таблице 2.
    4. Вымойте слайды в TBST для 5 минут сухой слайды.
    5. Инкубируйте слайды с 100 мкл вторичных антител на 30 мин в камере увлажненной.
    6. Подготовьте смесь третичного антитела, содержащих Cy3-стрептавидина, как описано в дополнительной таблице 2.
    7. Вымойте слайды в TBS на 10 мин сухой слайды.
    8. Инкубируйте слайды с 100 мкл третичного антитела смеси для 30 мин.
    9. Вымойте слайды в TBS на 10 мин сухой слайды.
  5. Мобильный монтаж
    1. Смонтировать слайды в 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, дигидрохлорида DAPI-содержащих монтаж среднего (1,5 мкг/мл DAPI) с coverslip совместимый для микроскопии флуоресцирования (см. Таблицу материалы).
      Примечание: Как отрицательный контроль для каждого эксперимента, один слайд с соответствием isotype антитела был использован на такой же концентрации как соответствующих антител. Для этого окрашивание, мы использовали IgG1 мыши, кролик IgG и отрицательный контроль антитела козочки IgG (см. Таблицу материалы). Как положительный контроль мы использовали человеческого hyperplasic миндалины, который как известно, быть положительным для протестированных маркеры для каждого эксперимента. Типичный пятнать описан в результатах (рис. 1). Моно окрашивание CD8, ПД-1 и Тим-3 должны быть выполнены индивидуально (одного окрашивания на слайд) с предварительно одинаково и без DAPI. Должны также выполняться слайд в тех же экспериментальных условиях без каких-либо антитела и только DAPI монтажа средних. Слайд должны отражаться с использованием одинаковых экспериментальных условиях без каких-либо антитела и DAPI.

3. флуоресцентный анализ и автоматизированных число ячеек

  1. Получение изображения с автоматизированной микроскопа
    1. Создание протокола.
      1. Включите программное обеспечение автоматизированных микроскопа и флуоресцентной подсветки.
      2. В строке меню, нажмите на «Файл», «создать протокол,» выберите «DAPI,» «FITC» и «TRITC.»
      3. Нажмите кнопку «Далее», «Ткани секция,» и нажмите «Далее», «Имя протокола». Выберите имя, например, «CD8-PD-1-Тим-3,» нажмите «Далее» и «сохранить».
      4. Вручную место слайда на сцене.
      5. В строке меню нажмите кнопку «Настройка», «параметры». Нажмите кнопку «установить дома Z» в новом окне.
      6. Отрегулируйте время экспозиции с позитивным элементом управления слайд- т.е. CD8, PD-1 и Тим-3 тройной витражи с DAPI образца.
      7. В панели управления нажмите кнопку «установить экспозиции».
      8. Отрегулируйте время экспозиции для каждого фильтра, пока не получен сигнал достаточно, но не насыщения.
      9. Для монохромных изображений, выполните следующие действия:
      10. Выберите приобретения и под «автофокус» выбрать DAPI фильтр.
      11. В «сканирования области предел» переместите объективных Верхний верхний левый угол слайда. Нажмите кнопку «Пометить». Сделайте то же самое, на правом нижнем углу.
        Примечание: Этот шаг delimitates области низкой мощности визуализации (LP Вообразимый) 4 X; Помните, что вы поместите знак хорошо так что касается окружают все образцы серии.
      12. Для высокой мощности (HP) изображений выполните следующие действия:
      13. В разделе «Автофокусом» выберите «DAPI».
      14. В разделе Группа «Приобретение» выберите «DAPI», «FITC», «Cy3» и «Cy5». Нажмите кнопку «ОК». В строке меню нажмите кнопку «Файл», «сохранить протокол».
    2. Сканирование слайдов.
      1. Загрузите протокол, нажав кнопку «Файл», «загрузить протокол» в строке меню. Нажмите кнопку «Пуск».
      2. Введите «Lab ID» (расположение папки для хранения снимков). Введите слайд ID для идентификации слайд. Нажмите кнопку «Далее».
      3. Нажмите «Монохромных изображений» (чтобы сканировать весь слайд под светлые области света и приобрести последовательных изображений, используя цель 4 x).
        Примечание: Это производит обзор серого слайда.
      4. Нажмите «Найти образец». Выберите область ткани проверяемых с низким разрешением (4 x): удерживайте клавишу «Ctrl» и нажмите на поле, используя курсор, чтобы выбрать или deselect поля (рис. 2A).
      5. Нажмите кнопку «LP Imaging» (4 x изображений) для флуоресцентные красный синий зеленый образ приобретение каждого поля.
      6. Для выбора поля HP удерживайте нажатой клавишу «Ctrl» и нажмите на поле, используя курсор, чтобы выбрать или deselect поля, которые соответствуют области тканей, которые будут проверяться с высоким разрешением (20 x). Выберите 5 поля (рис. 2B).
      7. Нажмите кнопку «HP Imaging» (20 x изображений) для приобретения Мультиспектральное изображение каждого поля (рис. 2 c).
      8. Нажмите кнопку «Хранения данных» для хранения изображений в папке, которая была выбрана в начале в этой.
        Примечание: Этот процесс кратко и показано на рисунке 2. Для каждого шага (обнаружение ткани, выбор поля) алгоритм может увеличивается и подготовленных пользователей для всей автоматизированной проверки процесса.
  2. Анализ изображений флуоресценции и автоматизированных клеток подсчета с спаренных анализ программного обеспечения
    1. Построение спектральной библиотеки.
      1. Откройте программное обеспечение для анализа изображения.
      2. На левой панели откройте «Построения библиотек». В разделе «Загрузка изображения» нажмите кнопку «Обзор» и выберите один моно витражные изображения (например, CD8/цианиновые 5).
      3. Выберите Флюорофор, (например, цианиновые 5). Нажмите кнопку «извлечь». Нажмите «Сохранить», чтобы сохранить в библиотеке. Нажмите кнопку «Сохранить».
      4. Повторите тот же процесс для PD-1, Тим-3 и DAPI моно окрашенных слайды для того, чтобы интегрировать спектр каждого Флюорофор интерес.
        Примечание: Строительство спектральной библиотеки интегрирует спектр для каждого Флюорофор, для конкретных тканей (здесь, почек), но может быть использован «синтетических» библиотек, которые уже существуют. Как спектр аутофлюоресценция строго по отношению к ткани, важно выполнять одно auto флуоресценции и спектральной библиотеки в проект.
    2. Создайте новый проект.
      1. В строке меню выберите «Файл», «Новый проект». В закладке «Функция поиска» выберите «ячейки сегментации». В закладке «Фенотип» выберите «фенотип». Нажмите кнопку «Создать».
      2. Интегрируйте представитель изображения в проекте.
        1. На вкладке «Файл» нажмите на «открыть изображение». Выберите 10-30 представитель изображения всей серии. Добавьте слайд витражи для удаления аутофлюоресценция. На правой панели: Источник выберите Библиотека. Выберите Флюорофор и выбрать те соответствующие спектральной библиотеки ранее построен.
      3. Чтобы удалить ткани аутофлюоресценция, нажмите кнопку «AF» и затем выберите область аутофлюоресценция на пустом слайде.
      4. Обработка изображений и создания композитных изображений.
        1. Нажмите кнопку «Подготовить все «интегрировать библиотеки флуоресценции и аутофлюоресценция спектры для создания составного изображения (рис. 3). Нажмите на значок «глаз», чтобы открыть панель «представление редактора» и выберите отображаемые данные: выберите маркеры CD8, ПД-1, Тим-3 и DAPI. Удаление аутофлюоресценция. Выполните действия, представленные программного обеспечения.
      5. Сегмент клетки.
        1. Для разделения клетки, в «Отсек», выберите «Ядра» и «Мембраны». В закладке «Ядра» задайте DAPI как ядерной изображение.
        2. В закладке «Максимальный и минимальный размер (в пикселях)» введите «40» и «176» как минимальные и максимальные размеры, соответственно. Для «Минимум» сигнала Установите «0,13». В «Сплит» на вкладке установите «2.60». В «Ядра» на вкладке установите «0.81». Выберите «использовать сигнал мембраны для помощи сегментации».
        3. Нажмите «Сегмент клетки» в нижней части экрана. Проверьте сегментации ядер и мембран клеток и повторите с различными параметрами, если он не соответствует флуоресценции DAPI и мембраны клеток.
          Примечание: Программное обеспечение распознает клетки с ядерной DAPI окрашивание и на основе размера ячейки. Отрегулируйте параметры ячейки (размер, Сплит, пикселей) в соответствии с проектом.
      6. Фенотипа клетки.
        1. На вкладке «Фенотип» нажмите «Добавить». Создайте ячейки фенотип категории: CD8 (синяя точка) / CD8-PD-1 (красная точка) / CD8-PD-1-Тим-3 (зеленая точка) / другие (черная точка) (Рисунок 4).
        2. Выберите более чем 5 Примеры клеток в каждой категории. Нажмите «Поезд классификатора».
          Примечание: Это создает алгоритм статистической классификации программного обеспечения.
        3. Нажмите кнопку «Фенотип все» для получения фенотип каждой ячейки.
          Примечание: Программное обеспечение дает фенотип одной ячейки с доверительным интервалом (ди) точности.
        4. Улучшить алгоритм подготовки программного обеспечения, до тех пор, пока разница между глаз и автоматизированных количество совпадающих (ошибка < 5%). Выберите CI, что является приемлемым для клетки интереса.
          Примечание: Мы решили сделать обучение на основе 55% ди как приемлемые.
      7. Сохраните проект и алгоритм.
      8. В разделе «Файл» выберите «проект». Имя и нажмите кнопку «Сохранить».
    3. Выполните анализ пакетный серии.
      1. Выберите «Пакет анализа». Выберите проект. Добавьте изображения для анализа. Выберите папку для хранения данных. Нажмите «Запустить». Проверьте качество составного изображения. Проверьте фенотипирование для всех изображений серии.
        Примечание: Программное обеспечение для анализа связанных изображений интегрирует все сигналы отсеков (мембраны/цитоплазме/ядер) клеток. Фенотипирование шаг имеет решающее значение, хотя и обучения алгоритм может быть длительным шагом. Все данные каждого изображения находятся в одном файле .txt. Все данные одной ячейки (особенно ее фенотип, с его CI) находятся в одной линии. Для каждого слайда загрузки изображений и последующим пунктам были исполнены на 5 полей.
  3. Интеграция исходных данных и генерации число автоматизированных ячеек
    1. Вычислите данные с помощью статистической программы.
      1. Вычислите все данные из 5 изображений, соответствующий 5 полей, проанализированы для 1 пациента. Использовать статистической платформе и у опытных статистик, диспетчер данных или данных ученый выполнения анализа. Создать сценарий, который автоматически подсчитывает количество ячеек в зависимости от их фенотип, выбрав CI > 55%.
      2. Положите все файлы .txt серии в той же папке.
    2. Извлечение данных.
      1. Положите все TXT-файлы в одну папку. Выполните автоматический сценарий построен на шаге 3.3.1. Откройте выходной CSV-файл, созданный сценарием R. Сохраните в формате .xl. Выходные данные собирает количество ячеек для каждого фенотипа (т.е., CD8 одиночку, CD8-PD-1, CD8-PD-1-Тим-3) для каждого пациента.
      2. Вычислить среднее количество клеток для каждого пациента на поле: Разделите количество ячеек на количество полей (т.е., 5) для нормализации количество ячеек для каждого пациента на поле.
      3. Рассчитать процент клеток PD-1+ среди всего CD8+ T клетки и Тим-3 PD-1+ + клетки среди всего CD8+ T клетки. Смотрите Рисунок 5 резюме этого шага.
        Примечание: Язык R (или другие программное обеспечение по выбору) необходимо правильно создавать и выполнять команды, и поэтому важно опытный пользователь или ученый статистик/данных. R программа может вычислить данные той же пациентки, но имя 5 TXT-файлов одного пациента должны иметь идентичные начала, соответствующий уникальный идентификатор пациента.
  4. Статистический анализ
    1. Использование статистического программного обеспечения для статистического анализа результатов.
    2. Выполните соответствующие статистические анализы с помощью статистик.
      1. Использование непараметрических Вилкоксон подписали ранга тесты для сравнения МФО PD-1 между двумя клетки фенотипов (рис. 6). Коррелируют ковариаций и гистологической характеристики с хи-квадрат Тест Пирсона.
      2. Используйте метод Каплана-Мейера для оценки безрецидивная выживаемость прогрессии и кокс регрессии модели для оценки воздействия залежки на события времени исходы, такие как общая выживаемость и безрецидивной выживаемости.
      3. Рассмотрим p-значения меньше чем 0,05 как значительный.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Использование общего протокола, описанных выше, мы стремились количественно внутриопухолевых CD8+ T клетки совместно выражая ингибирующее рецепторов PD-1 и Тим-3 в замороженных тканях от пациентов с СРК и соотнести результаты с клиническим исходам25.

Оптимизация окрашивания CD8/PD-1/Tim-3:

Различные виды антител (мыши, кролик и коза, см. Таблицу материала) были выбраны для того, чтобы избежать перекрестной реакции между различных антител. Протокол был апробирован на миндалины, который является организованной лимфоидной ткани. PD-1 окрашивания можно найти в зародышевых центров (рис. 1), тогда как CD8 и Тим-3 окрашивание присутствуют, окружающих зародышевых центров. Наблюдение за этой типичной окраски проверить этот протокол. Окрашивание также проверяются на ткани интерес (почки).

Было подтверждено отсутствие сигнала первичного Антитела инкубированы с их не соответствующее вторичное антитело (данные не показаны). Для анализа точно флуоресценции окрашивание и сделать конкретные спектральной библиотеки, отдельные слайды были поодиночке витражи с каждым маркером (CD8, ПД-1, Тим-3, или DAPI) в тканях интерес (почки). Слайд-окрашенных в тех же условиях необходимо экстраполировать аутофлюоресценция ткани. Окрашивание был проанализирован автоматизированных Микроскоп, который интегрированы спектров различных флуорофоров; Каждый маркер был высокодифференцированных и не перекрытие маркеров было отмечено (рис. 3).

Количественные и качественные характеристики CD8 + Проникнуть в 87 больных СРК:

Результаты показали, что приблизительно половина из CD8 клетки+ T Экспресс PD-1 (среднее 53,9%; SE: 30,49%) и одна треть были двойной положительный PD-1+ Тим-3+ (средняя 38.16%; SE: 28.11%). Тим-3 выражение без PD-1 выражение был обнаружен в менее чем 3% CD8+ T-клеток (данные не показаны). Среднее количество CD8+ Т-клеток субпопуляций были: всего CD8+ T-клеток 116,5 (SE: 216), PD-1+ CD8 клетки+T 89.32 (SE: 191.8), PD-1+ + 66,9 Тим-3 (SE: 143) и PD-1+ CD8 Тим-3– + T-клеток 22.38 (SE: 57,5) в поле. Общее количество внутриопухолевых CD8+ T клетки положительно коррелирует с процентом PD-1 Тим-3+ + на CD8+ T клетки.

Функциональная характеристика CD8 + Т-клеток в зависимости от их фенотип PD-1 и Тим-3:

PD-1 выражение уровня, как известно, быть соотнесена с Т-клеток истощения так мы далее направлены для измерения PD-1 выражение на CD8+ T клетки по Тим-3 выражение статуса. Как интенсивность средняя флуоресценции различных флуорохромов сообщается на клеточном уровне, небольшой серии пациентов вручную были проанализированы для сотовых данных: результаты показали корреляцию PD-1 мембраны МРИ с ячейки подтип. Интенсивности флуоресценции PD-1 был измерений (рис. 6) на клеточном уровне PD-1 Тим-3+ + против PD-1 CD8 Тим-3– + + T-клеток (Группа А) и на уровне отдельных пациентов после интеграции этих различных Сотовый сигналы на ткани секции. В серии 9 больных в сравнении с Вилкоксон парный тест обнаружил, что МФО PD-1 выше, когда Тим-3 совместно выражается, усиление функциональной значимости Тим-3 выражения (Группа B).

Выражение PD-1 и Тим-3 лигандов на поверхности опухолевых клеток от нескольких совместно окрашивания:

Как Т-клеток истощения опосредовано через рецептор/лигандом взаимодействия, мы оценивали выражение PD-1 и Тим-3 лигандами (PD-L1 и Galectin-9 (Гал-9), соответственно) на почечной опухоли клетки определены путем пятнать Пан кератин. Позитивность определяется как отсечения 10% опухолевых клеток, выражая маркер: (i) 58 из 87 пациентов (66%) были положительными для PD-L1; (ii) все 15 опухоли проанализированы были положительными для Гал-9 (рис. 7A, B).

Клинические последствия совместного выражения Тим - 3 + PD-1 + на CD8 + Т-клеток:

Опухолевых узлов метастазы (TNM) забил, Фурман класс, размер опухоли и UISS оценка являются гистологические характеристики (в сочетании с клиническая оценка UISS) используется для определения прогноза значение первичного РСС. Наблюдалась положительная корреляция между количество или процент проникновения опухоли CD8+ T-клеток выражая PD-1 и Тим-3 (но не выражая только PD-1 без Тим-3) со всеми этими параметрами (Таблица 1). В соответствии с этой более уничижительным фенотип больных СРК с CD8 клетки+ T совместно выражая PD-1 и Тим-3 выше средний процент (34,7) были более склонны рецидив (p = 0,046; HR 2.9; 95% ДИ: 1.02-8.21). Это соотношение не наблюдалось с процентом PD-1 на CD8 клетки+ T независимо от статуса Тим-3 (Таблица 2). Корреляция была также продемонстрирована между процент CD8+ T клетки совместно выражая PD-1 и Тим-3 и 36-месячный общей выживаемости (данные не показаны). Мы также проверяются тройной иммуноокрашивания на миндалинах парафин ткани (рис. 1).

Figure 1
Рисунок 1: CD8-PD-1-Тим-3 иммуноокрашивания на парафин врезанных ткани миндалин. Парафин встроенных ткани, выбранные разделы вместо криоконсервированных разделы для тройной иммуноокрашивания. После депарафинизации и регидратации был применен тот же протокол пятнать ранее разработанной для криоконсервированных секций. CD8+ T клетки расположены за пределами зародышевого центра и не CD8+ Т-клеток выразить PD-1 сгруппированы в зародышевого центра. Увеличение микроскоп 20 x и линейки шкалы представляет собой 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: автоматизированный анализ образцов ткани почечно-клеточная карцинома. После признания ткани в светлые области изображения (A, шкалы бар 1 мм), 4 x микроскоп увеличением низким разрешением изображения в RGB (красный синий зеленый обычных флуоресценции) используется для выбора поля (B, шкалы бар 500 мкм. Полный красный квадрат представляет поле. С высоким разрешением изображения (многоспектральных куб флуоресценции конкретной для данной технологии) с при 20-кратном исполнении многоспектральных Микроскоп показано (C, шкалы бар 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: многоспектральный микроскопии и программное обеспечение в сочетании анализ для создания составного образа ренальной карциномы клетки (20 x микроскоп увеличением). Raw изображений высокого разрешения (A) является флуоресцентный изображение поля после многоспектральных сканирования флуоресценции фильтр кубов. Синий сигнал AF488, красный является цианиновые 5, и зеленый Cyanin3. Слияние показывает различные цвета, например, желтый слияние трех флуорофоров. Это изображение включено в программное обеспечение для анализа изображения. Спектральной библиотеки интеграции обеспечивает точный спектр разделение каждой Флюорофор и аутофлюоресценция, ведущих к флуоресцентные составное изображение (B). Представитель цвета выбираются оператором: синий иллюстрирует цианиновые 5 (CD8), красный цианиновые 3 (PD-1), зеленая AF488 (Тим-3). Слияние сочетание цветов как фиолетовый используется для двойной положительный CD8-PD-1. Линейки шкалы представляет 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: PD-1 и Тим-3 выражение на проникновения опухоли CD8 клетки+ T на Светлоклеточная почечно-клеточной карциномы образец проанализирован технологии флуоресценции многоспектральных изображений (20 x микроскоп увеличением). (A) CD8 (синий), PD-1 (красный) и Тим-3 (зеленый) были пятнами на разделах замороженные ткани, полученных от больных СРК. Colocalization этих трех маркеров могут быть обнаружены путем слияния моно окрашивание фотографии. Isotype элементы управления были проведены в каждом эксперименте. Линейки шкалы представляет 20 мкм. желтый коробки определить совместно окрашенных клеток: Тим-3– PD-1+ CD8 клетки и клетки CD8 PD-1 Тим-3+ + . (B) тройной совместно пятная для CD8, ПД-1 и Тим-3 (слияния) показано слева с окно, в котором указывается, что зеленый является CD8 клетки+ T совместно выражая PD-1 и/или Тим-3. Для автоматического подсчета с программное обеспечение для анализа изображений, идентификации клеток зависит от присутствия ядерного окрашивание (DAPI); Сегментация клетки основывается также на Морфометрические характеристики представлены в виде красной границы (средняя группа). Обучение пользователя до согласования с визуальных игр производится (справа) и после автоматизированных фенотипа, алгоритм идентифицирует зеленые точки как CD8+ T-клеток совместно выражая PD-1 и Тим-3, красный точки как CD8 клетки+ T, выражая PD-1 без Тим-3 и синие точки как CD8 клетки+ T, не выражая PD-1 или Тим-3. Линейки шкалы представляет 20 мкм. желтый ящик показывает PD-1 и/или выражая CD8 Тим-3+ T клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: вычисления необработанные данные многоспектральных анализа. После анализа изображения собираются данные количество каждой категории клетки присутствуют в каждом поле (т.е., 5 полей/пациента, то есть, 5 TXT-файлов). Сценарий R сочетает в себе 5 полей данных, только учитывая клетки phenotyped с доверительный интервал > 55%. Увеличение микроскоп 20 x и линейки шкалы представляет собой 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: PD-1+ + CD8 Тим-3+ T клетки выразить более высоких уровней PD-1 по сравнению с PD-1 CD8 Тим-3– + + T-клеток в почечно-клеточной карциномы. В situ помощью иммунофлуоресцентного анализа на PD-1 Тим-3+ + и PD-1 CD8 Тим-3– + + T на клеточном уровне (левая панель) определяется интенсивность PD-1 клетки. На индивидуальном уровне (средняя группа): отображаются результаты для всего CD8+ T мобильных подмножеств PD-1 Тим-3+ + против PD-1+ Тим-3– настоящее на ткани секции (то есть, один пациент; Манн Уитни тест). Сравнительный анализ средней интенсивности PD-1 была измерена в серии 9 больных (правая панель) (Вилкоксон тест, p-значения меньше 0,05 рассматривались как значительный). Увеличение микроскоп 20 x и линейки шкалы представляет 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: PD-L1 и Гал-9 т.е. PD-1 и Тим-3 лигандов окрашивания на почечно-клеточная карцинома. (A) опухоли клетки определяются путем пятнать Пан кератин. Совместное окрашивание PD-L1 и Пан кератин (Группа А) определяет выражение PD-L1 на опухолевые клетки в 58 пациентов из 87 проанализированы. Galectin-9 (B) была выражена во всех 15 опухолей от больных СРК проанализированы. Позитивность считался если по крайней мере 10% клеток были витражи для маркера проанализированы. Isotype контроля были включены для каждого пятнать. Желтые прямоугольники представляют собой позитивные опухоли (Пан-кератин +) клетки для PD-L1 (Группа A) или Galectin-9 (Группа B). Увеличение микроскоп 20 x и линейки шкалы представляет собой 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Т-клетки %/CD8+ PD-1+ PD1+ Тим-3+ PD-1+ Тим-3–
TNM 0,04 0.003 0,22
Furhman 0.01 0,004 0.74
Размер опухоли 0,08 0.01 0,37
UISS 0.01 0.01 0,63

Таблица 1: Корреляция между выражением PD-1 отдельно или в сочетании с Тим-3 на CD8+ T клетки и клинические прогнозные параметры больных СРК: p-значения. PD-1+, PD-1 Тим-3+ + или PD-1+ Тим-3– на CD8 процент+ T клетки, выбранный как непрерывная переменная измеряется в situ иммунофлюоресценции в когорте 87 пациентов коррелировалось с различные клинические параметры, определенные в двоичном виде (TNM, Фурман класс, UISS Оценка) или непрерывной переменной (размер опухоли). TNM была разделена на две группы: локализованных болезни (pT1 и pT2) и заболевания (pT3, pT4, N+, или M+). Фурман класс был определен как низкий (класс I или II) и высокой (класс III или IV) и оценка UISS был разделен на 3 класса (0, 1 и 2). P-значения, указывающие существенная корреляция указаны жирным шрифтом.

CD8+ Т-клеток подмножество/CD8 PD-1+ Тим-3+ PD-1+ Тим-3–
Медиана (%) 34.7 8.6
Корреляция с PFS P = 0,046 P = 0,8

Таблица 2: Корреляция между PD-1 и совместного выражения CD8 Тим-3+ T клетки и прогрессии свободных выживания. Две группы РСС пациентов (n = 87) в зависимости от доли PD-1 без Тим-3 (справа), индивидуальный PD-1 и Тим-3 (слева) относительно медианы. Корреляции с PFS было сделано с медиана, выбран в качестве отсечения. P-значения, указывающие существенная корреляция указаны жирным шрифтом.

Справочная таблица 1: состав TBS и TBST буфер. TBS используется для антитела смесей и растворов. Для смывки все действия выполняются с TBS за исключением моет, после первичного антитела, где рекомендуется TBST. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Справочная таблица 2: подробные антитела перемешать композиции для окрашивания иммунофлюоресценции CD8-PD-1-Тим-3. Для каждого первичного, вторичного и третичного антитела смеси, разрежения для выполнения соответствующего объема TBS предоставляется для общего объема 1 мл. Для одного слайда объем необходимых общая реакция — 100 мкл для области ткани 2 см2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Модификации и устранения неполадок:

Качество ткани является важным параметром; Он может легко проверяться окраской гематоксилином и эозином.

Одним из преимуществ этого метода является возможность мультиплексных stainings, но чтобы избежать распространения Флюорофор, рекомендуется выбирать выбросов длин волн с дельта минимум 10 Нм. Здесь, потому что мы имели 4 stainings, включая DAPI, мы решили распространять длин волн (DAPI: 460 Нм, AF488: 519 Нм, цианиновые 3:570 Нм, цианиновые 5:670 нм). С помощью программного обеспечения для расчета чистого спектр Флюорофор от смешанных выбросов сигнала, в сочетании с автоматизированной изображения анализ избежать риска дублирования сигналов от различных флуорофоров. Моно окрашенных слайды также подтверждают отсутствие дублирования между флуорофоров и Закон о компенсации благодаря спектральной библиотеки.

Иногда может быть трудно определить, если окрашивание/флюоресценцию слаба позитивность для одного маркера в одну ячейку. Отрицательный контроль, включенных в каждом эксперименте является хорошим способом для определения порога позитивность.

В сочетании программное обеспечение, используемое для анализа изображений скоринг шаг для определения позитивность ячейки существует, но она только может анализировать двух маркеров одновременно. Потому что мы можем иметь тройной окрашивания на той же клетке (CD8, ПД-1 и Тим-3), мы выбрали фенотипирование шаг.

Фенотипирование шаг может быть трудоемким, особенно если переменной из одного образца на другой тип окрашивания и фона.

Ограничения метода:

Даже если количество co-stainings является преимуществом по сравнению с обычными флуоресценции, это не позволяет анализировать много цветов, как и проточной цитометрии. Особенно, когда изучал colocalization несколько маркеров, имейте для чувствительности, что ниже по сравнению с confocal микроскопии (для 20 x микроскоп увеличением, примерно 0,5 мкм против 0,1 мкм на пиксель для конфокальный, в зависимости от марки) и проверить для распространения Флюорофор (обратитесь к критические шаги в рамках протокола, ниже).

Ограничением большой техника является формат необработанных данных. Необработанные данные являются TXT-файлов, которые может быть сложно использовать. Как программное обеспечение дает один .txt файл изображения с CI для фенотипа, ручной обработки каждого из 5 файлов одного пациента огромный серии является весьма трудоемким. Для вычисления все данные статистического программного обеспечения требуется специалист биоинформатики.

Значение в отношении существующих методов:

Мультиплексированных окрашивание анализ легко можно. По сравнению с проточной цитометрии, который анализирует свежих образцов, эта техника позволяет быстрый подсчет в воспроизводимый метод подмножеств различных клеток в опухоли микроокружения, в большой когорты замороженных образцов с автоматизированной процедуры26 ,27. Мы могли бы автоматически рассчитывать, проникнув CD8+ T-клеток выражая PD-1 и совместного выражая Тим-3 или не в параметре РСС. Автоматический счетчик избегает несколько предубеждения как усталость глаз и невоспроизводимых count и не занимает много времени.

Как большая когорта учился на замороженных образцов, мы имели ретроспективных данных, так что мы могли бы связать абсолютное число или процент CD8+ T мобильных подмножества параметров биологических и клинических исходов. Существует важный неоднородность иммунной инфильтрации от одного пациента к другой28, представляет преимущество по сравнению с fluorocytometry, что доклады только МФО и процент, но не класс инфильтрации.

Интенсивность флуоресценции количественно сообщается для каждой ячейки, и в различных клеточных компартментов (мембраны/цитоплазме/ядер), мы могли бы оценить уровень PD-1 окрашивания, МФО на мембрану. Это представляет собой еще один интересный инструмент, который похож на проточной цитометрии. Мы обнаружили, что PD-1+ CD8+ T клетки, выражая Тим-3 выше выражение PD-1 и были связаны с плохим прогнозом (влияние на прогрессирование безрецидивная выживаемость). Насколько нам известно это первое исследование, используя этот метод, который показывает клиническое значение подмножества определенных ячеек.

Будущих приложений:

Области применения огромна. Мы также отметили в микроокружения опухоли рака легких другого подмножества ячеек: ткани резидентная память T-клеток называется TRM (CD103+ CD49a+), и они связаны с более общей выживаемости21,29 ,30. В другой работе, используя эту технику, наша команда обнаружили, что PD-L1 был оверэкспрессировали на опухолевые клетки в субклассе рака легких с перегруппировки Анапластическая лимфомы киназы (АЛК), и это выражение коррелировалось с CD8+ T проникновения10. Этот метод подходит для оценки важнейших биологических параметров в нескольких контекстах и может представлять собой ценный инструмент для открытия биомаркеров. Так как даны координаты xy, это один из первых инструментов для изучения рельефа и ячейке взаимодействия с легкостью31.

Важнейшие шаги в рамках протокола:

Одним из важных шагов является оптимизация совместного окрашивание, которая может занять много времени. Выбор Хорошее антитело имеет решающее значение, например несколько клонов были протестированы для Тим-3 в настоящем случае. Кроме того различные флуорофоров же маркера может дать различные результаты, поэтому важно попробовать несколько комбинаций. Рекомендуется изучение окрашивание специфика с антителами, которые не должны реагировать вместе. Несмотря на возможность анализировать несколько флуорофоров в то же время рекомендуется проверка для распространения с моно окрашенных слайды. Еще одним важным шагом является фенотипирование шаг, который опирается на подготовку руководства для выполнения тщательно.

В целом использование этой мультиплексированных техники адепт оператором представляет элегантный инструмент для анализа нескольких подмножеств клеток местной иммунной инфильтрат, который имеет важное значение, поскольку анализ периферической крови не может быть представителем местной опухоли окружающей среды.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все авторы имеют никакого конфликта интересов объявить.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантов от Института национального du рака (ИНКОВ) (ET), le Лига против рака (ET), Университет Сорбонна Париж Сите (ET), НРУ (Selectimmunco) (ET), Labex иммуно-онкология (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET). ЭДГ финансировался стипендий Fondation дуги. EV и CD финансировались братство APHP (биржа année исследований). ChB финансируется стипендий университета Сорбонна Париж Сите (contrat докторской). Авторы благодарят Bristol-Myers Squibb за их финансирование в этом проекте. Авторы благодарят Департамент патологии Hopital Européen Жоржа Помпиду и Некер (Laurianne Шамболь, Элоди Мишель и Жизель ЛЕГАЛЬ). Авторы благодарят гистология платформы PARCC, Hopital Européen Жоржа Помпиду (Corinne Lesaffre).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging  Perkin Elmer CLS142338
inForm cell analysis 2.1. Perkin Elmer CLS135781
R software https://www.r-project.org
Dakopen delimiting pen Dako S2002
Tris Buffer Salin TBS Tablets Takara, Bio Inc. TAKT9141Z pH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) Takara, Bio Inc. TAKT9142Z pH 7.6 100 tablets
Biotin blocking system Dako X0590 Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serum Jackson Immunoresearch 017-000-001 5% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPI Sigma-aldrich F6057 1.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslip Knittel Gläser, 100039 24x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V novus NBP1-79055 use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NAT abcam ab52587 use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3 R&D AF2365 use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 Roche 7309457001 use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 Cell Signalling 4528 use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9 R&D AF2045 use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-175-152 use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 715-066-150 use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG abcam ab150133 use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidin Amersham PA43001 use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1 Dako X0931 use at 2 µg/mL
IgG from goat serum Sigma-aldrich I5256 use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serum Sigma-aldrich I5006 use at 4µg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  2. Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
  3. Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
  4. Robert, C., et al. Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation. N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).
  5. Robert, C., et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).
  6. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  7. Schadendorf, D., et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).
  8. Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. What does PD-L1 positive or negative mean? J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).
  9. Rizvi, N. A., et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 348 (6230), 124-128 (2015).
  10. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. OncoImmunology. 6 (4), e1286437 (2017).
  11. Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. Biomarqueurs prédictifs de réponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices. Bull Cancer. 103, Suppl 1. S151-S159 (2016).
  12. Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  13. Fourcade, J., et al. Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).
  14. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
  15. Wherry, E. J., Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).
  16. Cai, C., et al. Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma. World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).
  17. Sakuishi, K., et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity. J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).
  18. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  19. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).
  20. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).
  21. Nizard, M., et al. Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine. Nat Commun. 8, 15221 (2017).
  22. Nghiem, P. T., et al. PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).
  23. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. Oncoimmunology. (4), (2017).
  24. Woods, K., et al. Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma. J Immunother Cancer. 4, 10 (2016).
  25. Granier, C., et al. Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma. Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  26. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  27. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3, 47 (2015).
  28. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  29. Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines. Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).
  30. Sandoval, F., et al. Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors. Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120 (2013).
  31. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nat Commun. 8, 15095 (2017).

Tags

Иммунология выпуск 132 мультиплексный в situ многоспектральных изображений иммунофлюоресценции техники цифровых изображений почечно-клеточной карциномы Тим-3 ПД-1 микроокружения опухоли ингибиторы контрольно-пропускного пункта на месте анализ одну ячейку
Мультиплексированных помощью иммунофлуоресцентного анализа и количественной оценки внутриопухолевых PD-1<sup>+</sup> Тим-3<sup>+</sup> CD8 клетки<sup>+</sup> T
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Granier, C., Vinatier, E., Colin,… More

Granier, C., Vinatier, E., Colin, E., Mandavit, M., Dariane, C., Verkarre, V., Biard, L., El Zein, R., Lesaffre, C., Galy-Fauroux, I., Roussel, H., De Guillebon, E., Blanc, C., Saldmann, A., Badoual, C., Gey, A., Tartour, É. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. J. Vis. Exp. (132), e56606, doi:10.3791/56606 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter