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Cancer Research

Multiplexed immunofluorescenza analisi e quantificazione di Intratumoral PD-1+ + Tim-3 CD8+ T cellule

Published: February 8, 2018 doi: 10.3791/56606
Automatic Translation
1, 2,3,4, 2,3, 2,3, 2,3,5, 6, 7, 2, 2, 2, 2,3,6, 8, 2,3, 4, 2,6, *4, *2,4
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou
* These authors contributed equally

Summary

Studiando il microambiente tumorale può identificare biomarcatori prognostici o predittivi della risposta clinica all'immunoterapia. Presentato qui, è un metodo innovativo basato su in situ di fluorescenza multispectral imaging per analizzare e contare automaticamente varie sottopopolazioni di CD8+ T cellule. Questa tecnica riproducibile ed affidabile è adatta per analisi di grande gruppo.

Abstract

Le cellule immunitarie sono componenti importanti del microambiente tumorale e influenzano la crescita del tumore e l'evoluzione in tutte le fasi di carcinogenesi. In particolare, è ora ben stabilito che il sistema immunitario si infiltrano in tumori umani possono correlare con prognosi e risposta alla terapia. L'analisi del sistema immunitario infiltrarsi nel microambiente tumorale è diventata una sfida importante per la classificazione dei pazienti e la risposta al trattamento.

La co-espressione di recettori inibitori quali programma delle cellule morte Protein 1 (PD1; anche conosciuto come CD279), citotossica dei linfociti T Associated Protein 4 (CTLA-4), T-cellula immunoglobulina e mucina contenente proteine-3 (Tim-3; anche conosciuto come CD366) e dei linfociti Attivazione genica 3 (Gal-3; anche conosciuto come CD223), è un segno distintivo dell'esaurimento delle cellule T. Abbiamo sviluppato una multiparametrica in situ l'immunofluorescenza che macchia per identificare e quantificare a livello cellulare il co-espressione di questi recettori inibitori. Su una serie retrospettiva di tessuto congelato dei carcinoma delle cellule renali (RCC), utilizzando una tecnologia di imaging multispettrale fluorescenza accoppiato con un software di analisi di immagine, è stato trovato che il co-espressione del PD-1 e Tim-3 il tumore infiltrante CD8+ T cellule è correlata con una prognosi difficile in RCC. A nostra conoscenza, questo rappresenta il primo studio che dimostra che questo automatizzato tecnologia multiplex in situ può avere qualche rilevanza clinica.

Introduction

Negli ultimi anni, l'immunoterapia è emerso come un trattamento molto promettente per molti tipi di cancri, compreso il controllo delle chiamate remote. In particolare, l'immunoterapia basata sull'inibizione di punti di controllo inibitori come PD-1 e CTLA-4 è stato segnalato per essere clinicamente efficace1,2,3,4,5, 6. anticorpi monoclonali contro CTLA-4, PD-1, o programma morte Ligand 1 (PD-L1) sono già approvati in parecchi cancri e portare a lunga durata le risposte cliniche in oltre il 20% dei pazienti7. Tuttavia, non tutti i pazienti sono di intervento, il costo del trattamento è elevato, e questi trattamenti sono tossici, che conduce a potenziali gravi effetti collaterali autoimmune-come. Pertanto, la sfida attuale consiste nell'identificare marcatori predittivi per quelle nuove immunoterapie. Il tasso di mutazioni nel tumore, l'espressione del PD-L1 o i livelli di intratumoral CD8+ infiltrazione delle cellule di T sono stati segnalati per correlare con la risposta clinica. Tuttavia, questa associazione è ancora troppo debole per raccomandare l'uso di questi biomarcatori clinici nella pratica clinica, ad eccezione del test di compagno per PD-L1 prima dell'amministrazione di Pembrolizumab non a piccole cellule del polmone cancro (NSCLC) pazienti8 ,9,1011,12. È stato dimostrato che la co-espressione di molti recettori inibitori come PD-1, Tim-3, Gal-3, e CTLA-4, induce un fenotipo delle cellule di esaurimento e la resistenza alla terapia13,14,15. Poiché il sangue periferico non è rappresentativo del microambiente tumorale, è di grande interesse per analizzare le caratteristiche fenotipiche delle cellule in situ. Cellule di T di co-espressione PD-1 e Tim-3 sono noti per essere cellule funzionalmente alterate in diversi contesti13,16,17. In questo studio, l'impatto prognostico della co-espressione di recettori inibitori due PD-1 e Tim-3 il CD8+ T cellule è stata valutata.

Fino a ora, studiando il co-espressione di marcatori multipli su tumore infiltrante linfociti (TILs) è stata effettuata principalmente dall'analisi di citometria a flusso, rendendo necessario per lavorare su tumori freschi e pertanto senso che osta alla analisi retrospettive. Con la colorazione convenzionale in situ può essere eseguita solo una colorazione in un momento e la caratterizzazione del tipo cellulare che co-esprime i marcatori non è possibile. Ad esempio, PD-L1 è espressa da molti tipi di cellule del microambiente tumorale, che lo rende difficile da definire mediante analisi immunohistochemistry convenzionali quali le cellule che esprimono PD-L1 sono più rilevanti per gli studi correlativi. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un metodo innovativo in situ multiparametrica immunofluorescenza con computer-contando per correlare il co-espressione di PD-1 e Tim-3 da tumore infiltrante CD8 T-cellule+ con i risultati clinici in RCC. Questa tecnica ha diversi vantaggi, tra cui la possibilità di analizzare a livello di singola cellula e marcatori multipli allo stesso tempo utilizzando una macchina fotografica multispettrale che può catturare intervalli limitati > 10 nm attraverso cristalli liquidi filtri18. Inoltre, la procedura è automatica e consente una riproducibilità inter-operatore e un'analisi ridotta rispetto alle tecniche manuali19. Nel campo del cancro, parecchi studi riferito convincente stainings multiple di molecole immuni come PD-1, PD-L1 e CD8 nel carcinoma delle cellule di Merkel, cancro ai polmoni e testa e collo cancro20,21,22, 23. il conteggio delle cellule automatizzato è possibile con la formazione da parte dell'utente (passaggio phenotyping). La fluorescenza è misurata nei compartimenti cellulari differenti (nuclei, citoplasma e membrana).

Qui, diversi sottoinsiemi di tumore-infiltrazione CD8+ T cellule esprimenti PD-1 e/o Tim-3 in un'ampia coorte di RCC sono stati contati e i risultati sono stati correlati con punteggi di gravità clinica e parametri di sopravvivenza. È stato anche possibile analizzare l'intensità di fluorescenza della membrana alla risoluzione del cellulare con i dati di intensità di fluorescenza media (MFI) come in citometria. Per quanto ne sappiamo, questo rappresenta i primi risultati prognostici Report Studio utilizzando questa tecnica di conteggio base imaging multispettrale.

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Protocol

Questo studio è stato condotto in conformità con la dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal comitato etico locale (CPP Ile de France nr. 2012-05-04). Consenso informato è stato ottenuto dal partecipante incluso nelle coorti.

1. tessuto materiale

  1. Raccogliere campioni di tessuto RCC il giorno dell'intervento. Gestire l'esemplare chirurgico a temperatura ambiente (reparto di patologia).
  2. Raccogliere un campione di tumore di circa 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm taglia in un tubo secco. Snap congelamento in azoto liquido e conservato a-80 ° C.
  3. Rivestire i campioni a temperatura ottimale di taglio composto. Sezione i campioni con un criostato a-20 ° C in 4-6 µm spessore sezioni. Lasciate che i campioni di aria secca su vetrini per 12 h e memorizzarli direttamente a-80 ° C per evitare il disseccamento.
  4. Verificare la qualità del campione visualizzando un ematossilina ed eosina macchiate sezione.

2. colorazione di immunofluorescenza in Situ di TILs

  1. Linee guida procedurale
    1. Eseguire tutte le fasi sperimentali a temperatura ambiente.
    2. Per tutti i passaggi, eseguire le diluizioni con tampone Tris salino (TBS; Vedi Tabella materiali).
    3. Eseguire il lavaggio in TBS per tutti i passaggi tranne dopo l'incubazione dell'anticorpo primario. Per quest'ultimo, utilizzare Tris Buffer Saline Tween20 (TBST, Vedi Tabella materiali). Per la composizione di buffer e ricostituzione vedere supplementare nella tabella 1.
    4. Utilizzare una camera umida per le incubazioni dell'anticorpo e una vaschetta di colorazione per il lavaggio.
    5. La sezione non lasciare asciugare durante la procedura.
  2. Pretrattamento
    1. Scongelare la diapositiva contenente il campione di tessuto e asciugare accuratamente la diapositiva attorno al campione con un tovagliolo di carta. Delimitare l'area di reazione contenente il tessuto con una penna di barriera idrofoba (Vedi Tabella materiali). A secco per 2 min.
    2. Difficoltà i campioni in 100% di acetone per 5 min, secco per 2 min e lavare con TBS per 10 min.
  3. Saturazione e blocco
    1. Pretrattare i vetrini per 10 min con 3 gocce di avidina 0,1%, rubinetto e/o flick la diapositiva per distribuire l'avidina e rimuovere le bolle d'aria e quindi trattare per 10 min con 3 gocce di biotina 0,01% (Vedi Tabella materiali), toccare, e/o flick. Lavare con TBS.
    2. Eseguire un blocco di recettori Fc. Applicare 100 µ l di un 5% volume/volume del normale siero diluito in siero di TBS. uso delle stesse specie di host come l'anticorpo marcato secondario o terziario (Vedi Tabella materiali); qui, asino siero è stato utilizzato. Incubare per 30 min.
    3. Durante l'incubazione, brevemente gira la anti-CD8, PD-1 e gli anticorpi Tim-3 (Tabella materiali). Preparare la miscela di anticorpi primari in TBS come descritto nella tabella supplementare 2.
  4. Immunocolorazione per CD8, PD-1 e Tim-3
    1. Preparare la miscela di anticorpo primario. Riferimento alla Tabella materiali e supplementare tabella 2 per gli anticorpi utilizzati (anti-CD8, PD-1, Tim-3 e loro corrispondenti anticorpi secondari) e le relative concentrazioni.
    2. Toccare e/o scorri il rimanente siero di asino (aggiunto nel passaggio 2.3.2). Incubare i vetrini con 100 µ l della miscela non marcato gli anticorpi primari per 1h in una camera umidificata.
    3. Durante l'incubazione, brevemente spin la cianina 5 anti-coniglio AF488-anti-capra e anticorpi biotinilati anti-topo e preparare la miscela di anticorpi secondari, come descritto nella tabella supplementare 2.
    4. Lavare i vetrini in TBST per 5 min. a secco le diapositive.
    5. Incubare i vetrini con 100 µ l di anticorpi secondari per 30 min in una camera umidificata.
    6. Preparare la miscela di anticorpo terziario contenente Cy3-streptavidina, come descritto nella tabella supplementare 2.
    7. Lavare i vetrini in TBS per 10 min. a secco le diapositive.
    8. Incubare i vetrini con 100 µ l della miscela dell'anticorpo terziario per 30 min.
    9. Lavare i vetrini in TBS per 10 min. a secco le diapositive.
  5. Montaggio delle cellule
    1. Montare i vetrini in un 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, dicloridrato DAPI-contenente mezzo (1,5 µ g/mL DAPI) con un vetrino coprioggetto compatibile per microscopia di fluorescenza di montaggio (vedere Tabella materiali).
      Nota: Come controllo negativo per ogni esperimento, è stata utilizzata una diapositiva con anticorpi isotipo-abbinato alla stessa concentrazione come corrispondenti anticorpi. Per la colorazione, abbiamo usato IgG1 di topo, coniglio IgG e gli anticorpi controllo negativo IgG di capra (Vedi Tabella materiali). Come controllo positivo, abbiamo usato la tonsilla iperplasiche umana che è noto per essere positivo per i marcatori testati, per ogni esperimento. Una tipica colorazione è descritto nei risultati (Figura 1). Mono-macchiatura di CD8, PD-1 e Tim-3 deve essere eseguita individualmente (una colorazione per vetrino) con lo stesso pre- trattamento e senza DAPI. Deve essere eseguita anche una diapositiva nelle stesse condizioni sperimentali senza alcun anticorpo e il solo mezzo di montaggio DAPI. Una diapositiva dovrebbe essere imaged con identiche condizioni sperimentali senza alcun anticorpo e senza DAPI.

3. fluorescenza analisi e conteggio delle cellule automatizzato

  1. Acquisizione di immagini con il microscopio automatizzato
    1. Creare un protocollo.
      1. Attivare il software automatizzato microscopio e l'illuminatore a fluorescenza.
      2. Nella barra dei menu, fare clic su "File", "creare il protocollo," selezionare "DAPI," "FITC" e "TRITC."
      3. Fare clic su "Next", "Sezione di tessuto" e fare clic su "Avanti", "Nome del protocollo." Scegliere un nome, ad esempio, "CD8-PD-1-Tim-3," fare clic "Next" e "Salva".
      4. Inserire manualmente una diapositiva sul palco.
      5. Nella barra dei menu, fare clic su "setup", "Impostazioni". Fare clic su "set casa Z" nella nuova finestra.
      6. Regolare il tempo di esposizione con un controllo positivo slide cioè un CD8, PD-1 e Tim-3 triple-macchiato con il campione DAPI.
      7. Nella barra di controllo, fare clic su "imposta l'esposizione".
      8. Regolare il tempo di esposizione per ogni filtro fino ad ottenuta un segnale sufficiente ma non saturante.
      9. Per formazione immagine monocromatica, eseguire le seguenti operazioni:
      10. Selezionare acquisizione e sotto 'autofocus' scegliere filtro DAPI.
      11. Nel "limite di zona di scansione", spostare l'obiettivo superiore all'angolo superiore sinistro della diapositiva. Fare clic su "Mark". Fare lo stesso per l'angolo inferiore destro.
        Nota: Questo passaggio delimita l'area di bassa potenza imaging (imaging LP) 4x; essere consapevoli di pignoramento e quindi il marchio circondano tutti i campioni della serie.
      12. Per alta potenza (HP) di imaging, eseguire le seguenti operazioni:
      13. Sotto "Autofocus", scegliere "DAPI".
      14. In band «Acquisizione», scegliere "DAPI", "FITC", "Cy3" e "Cy5". Fare clic su "OK". Sulla barra dei menu fare clic su "File", "Salva protocol".
    2. Scansione di diapositive.
      1. Caricare il protocollo facendo clic su "File", "caricare il protocollo" dalla barra dei menu. Cliccare su "Start".
      2. Immettere 'Lab ID' (percorso della cartella per la memorizzazione delle immagini). Inserisci diapositiva ID per identificare la diapositiva. Fare clic su "Avanti".
      3. Fare clic su "Bianco e nero Imaging" (per acquisire l'intera diapositiva sotto la luce del campo luminoso e acquisire immagini in sequenza utilizzando un obiettivo 4x).
        Nota: Questo produce una panoramica in scala di grigi della diapositiva.
      4. Clicca su "Cerca esemplare". Selezionare l'area di tessuto da sottoporre a scansione a bassa risoluzione (4x): tenere premuto il tasto 'Ctrl' e fare clic su un campo utilizzando il cursore per selezionare o deselezionare i campi (Figura 2A).
      5. Fare clic su "LP Imaging" (4 x imaging) per acquisizione di immagine rosso blu verde fluorescente di ogni campo.
      6. Per la selezione del campo di HP, tenere premuto il tasto 'Ctrl' e fare clic su un campo utilizzando il cursore per selezionare o deselezionare i campi che corrispondono alla zona di tessuti da sottoporre a scansione ad alta risoluzione (20x). Selezionare 5 campi (Figura 2B).
      7. Fare clic su "HP Imaging" (20 x imaging) per un'acquisizione di immagini multispettrali di ogni campo (Figura 2).
      8. Fare clic su "Dati archiviazione" per memorizzare le immagini nella cartella che è stata selezionata all'inizio in Labella.
        Nota: Il processo è ricapitolato e illustrato nella Figura 2. Per ogni passaggio (rilevamento di tessuto, selezione del campo) un algoritmo può essere incrementato e addestrato dall'utente per un processo di digitalizzazione di tutto automatizzato.
  2. Analisi di immagine di fluorescenza e cella automatizzata contando con software di analisi accoppiata
    1. Compilare la libreria spettrale.
      1. Aprire il software di analisi di immagine.
      2. Sul pannello di sinistro, aprire "Costruire biblioteche". In 'carica immagine', clicca su "Sfoglia" e selezionare un'immagine di mono-macchiato (ad es., CD8/cianina 5).
      3. Selezionare il fluoroforo, (ad es., cianina 5). Fare clic su "Estrai". Fare clic su "Salva" per memorizzare nella libreria. Fare clic su "Salva".
      4. Ripetere lo stesso processo per PD-1, Tim-3 e vetrini colorati mono DAPI al fine di integrare lo spettro di ogni fluoroforo di interesse.
        Nota: Compilazione della libreria spettrale si integra lo spettro per ogni fluoroforo utilizzato per il tessuto specifico (qui, rene), ma possono essere utilizzate "sintetiche" librerie già esistenti. Come lo spettro di autofluorescenza è strettamente relativa del tessuto, è importante eseguire un auto-fluorescenza e libreria spettrale per ogni progetto.
    2. Creare un nuovo progetto.
      1. Dalla barra dei menu, fare clic su "File", "Nuovo progetto". Nella scheda "Funzionalità di ricerca", selezionare "segmentazione delle cellule". Nella scheda 'Phenotyping', selezionare "fenotipi". Clicca su "Crea".
      2. Integrare le immagini rappresentative nel progetto.
        1. Nella scheda 'File', fare clic su "Apri immagine". Scegliere 10 a 30 immagini rappresentative di tutta la serie. Aggiungere la diapositiva non macchiato per rimuovere autofluorescenza. Sul pannello di destra: origine selezionare libreria. Selezionare fluoroforo e scegliere quelli corrispondenti alla libreria spettrale precedentemente costruita.
      3. Per rimuovere il tessuto autofluorescenza, fare clic sul pulsante"AF" e quindi selezionare l'area di autofluorescenza sulla diapositiva vuota.
      4. Trattamento dell'immagine e la generazione di immagine composita.
        1. Fare clic su "Preparare tutti" per integrare la libreria di fluorescenza e gli spettri di autofluorescenza per generare l'immagine composita (Figura 3). Fare clic sull'icona 'occhio' per aprire il pannello 'editor visualizza' e selezionare i dati visualizzati: selezionare i marcatori CD8, PD-1, Tim-3 e DAPI. Rimuovere l'autofluorescenza. Seguire la procedura presentata dal software.
      5. Le cellule del segmento.
        1. Per segmentare le cellule, in 'Vano', scegli "Nuclei" e "Membrana". Nella scheda "Nuclei", è possibile impostare DAPI come il colorante di contrasto nucleare.
        2. Nella scheda 'Massimo e dimensioni minime (px)' immettere "40" e "176" come dimensioni minime e massime, rispettivamente. Per segnale 'Minimo', impostare "0,13". Nella scheda "Split", impostare "2.60". Nella scheda "Nuclei", impostare "0,81". Seleziona "utilizza il segnale di membrana per segmentazione di aiuto".
        3. Fare clic su "Cellule del segmento" nella parte inferiore dello schermo. Controllare la segmentazione dei nuclei e membrane delle cellule e riprovare con parametri diversi, se non corrisponde la fluorescenza DAPI e membrana delle cellule.
          Nota: Il software riconosce le cellule con il nucleare DAPI macchiatura e sulla base delle dimensioni della cella. Regolare i parametri di cella (dimensione, Spalato, pixel) secondo il progetto.
      6. Fenotipo delle cellule.
        1. Nella scheda 'Fenotipo', cliccare su "Aggiungi". Creare delle cellule fenotipo Categorie: CD8 (punto blu) / CD8-PD-1 (punto rosso) / CD8-PD-1-Tim-3 (punto verde) / altri (puntino nero) (Figura 4).
        2. Selezionare più di 5 esempi di celle di ogni categoria. Fare clic su "Classificatore in treno".
          Nota: Questo genera un algoritmo di classificazione statistica dal software.
        3. Fare clic su "Fenotipo tutti" per ottenere il fenotipo di ogni cella.
          Nota: Il software dà il fenotipo di una cellula con un intervallo di confidenza (CI) di precisione.
        4. Migliorare l'algoritmo di formazione il software fino a quando la differenza tra occhio e conteggio automatizzato è concorda (errore < 5%). Scegliere un IC che è accettabile per le celle di interesse.
          Nota: Abbiamo scelto di fare l'addestramento sulla base di 55% CI come accettabile.
      7. Salvare il progetto e l'algoritmo.
      8. Selezionare 'File' "progetto". Il nome e fare clic su "Salva".
    3. Eseguire analisi dei lotti della serie.
      1. Selezionare "Batch analysis". Selezionare il progetto. Aggiungere le immagini da analizzare. Selezionare una cartella di archiviazione per i dati. Fare clic su "Esegui". Controllare la qualità dell'immagine composita. Verificare la fenotipizzazione per tutte le immagini della serie.
        Nota: Il software di analisi di immagine accoppiato integra tutti i segnali di scomparti (membrana/citoplasma/nuclei) delle cellule. Il passo di fenotipizzazione è fondamentale anche se l'addestramento dell'algoritmo può essere un passo che richiede tempo. Tutti i dati di ogni immagine sono in un file con estensione txt. Tutti i dati di una cella (particolarmente relativo fenotipo dato con suo CI) sono in una sola riga. Per ogni diapositiva, l'acquisizione di immagini e conteggi successivi sono stati effettuati su 5 campi.
  3. Integrazione dei dati grezzi e generazione del conteggio delle cellule automatizzato
    1. Calcolare i dati con un programma statistico.
      1. Calcolare tutti i dati da 5 immagini corrispondenti ai 5 settori analizzati per 1 paziente. Utilizzare una piattaforma di statistica e avere un esperto statistico, data manager o scienziato dati eseguire l'analisi. Costruire uno script che automaticamente conta le celle a seconda del loro fenotipo, selezionando il CI > 55%.
      2. Mettere tutti i file. txt della serie nella stessa cartella.
    2. Estrarre i dati.
      1. Mettere tutti i file. txt in una cartella. Eseguire lo script automatico costruito al punto 3.3.1. Aprire il file CSV di output generato dallo script R. Salvare come formato di XL. L'output raccoglie il numero di celle per ogni fenotipo (cioè, CD8 da solo, CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) per ogni paziente.
      2. Calcolare il numero medio di cellule per ogni paziente per ogni campo: dividere il numero di cellule per il numero di campi (cioè, 5) per normalizzare il numero di celle per ogni paziente per ogni campo.
      3. Calcolare la percentuale delle cellule di PD-1+ tra CD8 totale+ T cellule e cellule di PD-1+ Tim-3+ tra CD8 totale+ T cellule. Vedere la Figura 5 per la sintesi di questo passaggio.
        Nota: Linguaggio R (o altri software di programmazione di scelta) è necessario creare e eseguire i comandi correttamente, e quindi un utente esperto o scienziato statistico/dati è essenziale. Il programma di R in grado di calcolare i dati dello stesso paziente, ma il nome dei 5 file. txt di un paziente dovrebbe avere un inizio identico, corrispondente a un identificatore univoco di paziente.
  4. Analisi statistica
    1. Utilizzare software statistico per l'analisi statistica dei risultati.
    2. Eseguire analisi statistiche appropriate con l'aiuto di uno statistico.
      1. Uso il Wilcoxon non parametrica firmato rank test per il confronto di PD-1 MFI tra due fenotipi cellulari (Figura 6). Correlare la covariata e le caratteristiche istologiche con test chi quadrato di Pearson, un.
      2. Utilizzare un metodo di Kaplan-Meier per stimare la sopravvivenza libera da progressione e modelli di regressione di Cox per stimare gli effetti di covariata sui risultati di tempo all'evento, come la sopravvivenza globale e sopravvivenza libera da malattia.
      3. Considera p-valori inferiori a 0.05 come significativi.

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Representative Results

Mediante il protocollo generale descritto sopra, abbiamo mirato a quantificare intratumoral CD8+ T cellule cheesprimono recettori inibitori PD-1 e Tim-3 nei tessuti congelati da pazienti con RCC e di correlare i risultati con gli esiti clinici25.

Ottimizzazione della colorazione CD8/PD-1/Tim-3:

Diverse specie di anticorpi (topo, coniglio e capra, vedere Tabella di materiale) sono stati scelti al fine di evitare reazioni crociate tra gli anticorpi differenti. Il protocollo è stato validato su una tonsilla, che è un tessuto linfoide organizzato. Macchiatura PD-1 potrebbe essere trovata in centri germinali (Figura 1), considerando che CD8 e Tim-3 colorazione sono presenti che circondano i centri germinali. L'osservazione di questa tipica colorazione convalidato questo protocollo. La colorazione è stata convalidata anche sul tessuto di interesse (rene).

È stata confermata l'assenza di segnale dell'anticorpo primario incubato con loro non corrispondente anticorpo secondario (dati non mostrati). Per analizzare con precisione la fluorescenza di colorazione e di rendere specifiche librerie spettrali, singole diapositive singolarmente sono stati macchiati con ogni marcatore (CD8, PD-1, Tim-3 o DAPI) nel tessuto di interesse (rene). Una diapositiva non tinto nelle stesse condizioni è necessaria estrapolare l'autofluorescenza del tessuto. La colorazione è stata analizzata tramite il microscopio automatizzato, che ha integrato gli spettri dei fluorophores differenti; ogni marcatore è stato differenziato e nessuna sovrapposizione degli indicatori è stata osservata (Figura 3).

Caratteristiche quantitative e Qualitative del CD8 + Infiltrarsi in 87 pazienti RCC:

Risultati hanno mostrato che circa la metà dei CD8+ T cells express PD-1 (media 53,9%; SE: 30.49%) e circa un terzo erano doppio positivo PD-1+ Tim-3+ (media 38.16%; SE: 28.11%). Tim-3 espressione senza espressione PD-1 è stato rilevato in meno di 3% di CD8+ T cellule (dati non mostrati). I numeri medi di CD8+ cellula T sottopopolazioni erano: totale CD8+ T cellule 116,5 (SE: 216), PD-1+ CD8+T cellule 89,32 (SE: 191,8), PD-1+ + 66,9 Tim-3 (SE: 143) e PD-1+ CD8 Tim-3– + Le cellule T 22,38 (SE: 57,5) per ogni campo. Il numero totale di intratumoral CD8+ T cellule è stata correlata positivamente con la percentuale di PD-1 Tim-3+ + il CD8+ T cellule.

Caratterizzazione funzionale del CD8 + T cellule a seconda del loro fenotipo PD-1 e Tim-3:

Livello di espressione di PD-1 è noto per essere correlato con l'esaurimento delle cellule T così abbiamo successiva mirato a misurare l'espressione di PD-1 il CD8+ T celle secondo lo stato di espressione di Tim-3. Come l'intensità media di fluorescenza dei fluorocromi diversi è segnalato a livello cellulare, una piccola serie di pazienti sono stati analizzati manualmente per i dati cellulari: risultati hanno mostrato una correlazione del PD-1 membrana IFM con il sottotipo di cella. Intensità di fluorescenza del PD-1 è stato misurato (Figura 6) a livello cellulare su PD-1+ + Tim-3 contro PD-1+ CD8 Tim-3– + T cellule (un pannello) e a livello individuale della paziente dopo l'integrazione di questi vari segnali di cella su una sezione di tessuto. In una serie di 9 pazienti, un confronto con test di Wilcoxon accoppiato trovato che MFI PD-1 è più elevato quando Tim-3 è co-espressi, rafforzando la rilevanza funzionale di Tim-3 espressione (pannello B).

Espressione di ligandi PD-1 e Tim-3 sulla superficie delle cellule del tumore da più co-colorazione:

Come esaurimento delle cellule T è mediata attraverso l'interazione del recettore/ligando, abbiamo valutato l'espressione di ligandi PD-1 e Tim-3 (PD-L1 e galectina-9 (Gal-9), rispettivamente) il tumore renale cellule identificate macchiando di pan-cheratina. La positività è definita come un taglio del 10% delle cellule del tumore che esprime l'indicatore: (i) 58 su 87 pazienti (66%) erano positive per il PD-L1; (ii) tutti i 15 tumori analizzati erano positivi per Gal-9 (figura 7A, B).

Impatto clinico del co-espressione di Tim-3 + PD-1 + il CD8 + Cellule di T:

Tumore nodo metastasi (TNM) segnando, grado di Fuhrman, dimensioni del tumore e il Punteggio UISS è le caratteristiche istologiche (combinate con punteggio clinico per UISS) utilizzate per definire il valore di prognosi di RCC primario. È stata osservata una correlazione positiva tra il numero e/o la percentuale di tumore-infiltrazione CD8+ T cellule che esprimono PD-1 e Tim-3 (ma non esprimono solo PD-1 senza Tim-3) con tutti questi parametri (tabella 1). In linea con questo fenotipo più peggiorativo, pazienti RCC con CD8+ T cellule co-espressione PD-1 e Tim-3 sopra la percentuale mediana (34,7) avevano più probabilità di ricaduta (p = 0,046; HR 2,9; IC 95%: 1,02-8,21). Questa correlazione non è stata osservata con la percentuale di PD-1 il CD8+ T cellule indipendentemente dallo stato di Tim-3 (tabella 2). Una correlazione è stata dimostrata anche fra la percentuale di CD8+ T cellule co-espressione PD-1, Tim-3 e il tasso di sopravvivenza globale di 36 mesi (dati non mostrati). Abbiamo validato anche triple immunostaining sui tessuti di paraffina tonsilla (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: immunostaining CD8-PD-1-Tim-3 su un tessuto paraffina-incastonato tonsilla. Paraffina incorporato tessuto sezioni invece crioconservati sezioni sono stati selezionati per l'immunocolorazione triple. Dopo deparaffinazione e reidratazione, è stato applicato lo stesso protocollo di macchiatura precedentemente sviluppati per sezioni crioconservati. CD8+ T cellule si trovano fuori dal centro germinativo e non-CD8+ cellule di T che esprimono PD-1 sono raggruppate nel centro germinale. È l'ingrandimento del microscopio 20x e la barra della scala rappresenta 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: analisi di campioni di tessuto di carcinoma renale delle cellule automatizzata. Dopo il riconoscimento del tessuto nell'immagine del campo luminoso (A, scala bar/1 mm), 4 x ingrandimento del microscopio bassa risoluzione l'imaging in RGB (rossa blu verde fluorescenza convenzionale) è utilizzato per selezionare i campi (B, scala bar 500 µm. Il quadrato rosso pieno rappresenta un campo. Un'immagine ad alta risoluzione (immagine di fluorescenza multispettrale cubo specifico di questa tecnologia) con ingrandimento 20x eseguita dal microscopio multispettrale è illustrata (C, scala bar 100 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: analisi accoppiata di microscopia multispettrale e software per la generazione di un'immagine composita di un carcinoma renale delle cellule (20 x ingrandimento del microscopio). L'immagine raw ad alta risoluzione (A) è un'immagine fluorescente del campo dopo la scansione multispettrale da cubi di filtro di fluorescenza. Segnale blu è AF488, il rosso è cianina 5 e verde è Cyanin3. L'Unione Mostra colori differenti, per esempio, il gialla è un'Unione di tre fluorophores. Questa immagine è incorporata nel software di analisi di immagine. L'integrazione libreria spettrale consente una separazione di spettro accurata di ogni fluoroforo e autofluorescenza portando ad un'immagine composita fluorescente (B). Rappresentante colori sono stati scelti dall'operatore: blu illustra cianina 5 (CD8), Red cianina 3 (PD-1), verde AF488 (Tim-3). L'Unione di mix di colori come il viola è utilizzato per CD8-PD-1 doppio positivo. La barra della scala rappresenta 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: PD-1 e Tim-3 espressione sul tumore-infiltrazione CD8+ T cellule su un esemplare di carcinoma renale delle cellule cellule chiare analizzato da tecnologia di imaging multispettrale fluorescenza (20 x ingrandimento del microscopio). (A) CD8 (blu), PD-1 (rosso) e Tim-3 (verde) sono stati macchiati su sezioni di tessuto congelato derivate da pazienti RCC. Colocalizzazione di questi tre indicatori può essere rilevato unendo le immagini mono-macchiatura. Isotype controlli sono stati effettuati in ogni esperimento. La barra della scala rappresenta 20 µm. giallo scatole identificano cellule co-macchiate: una cella di Tim-3– PD-1+ CD8 e una cella di Tim-3+ PD-1+ CD8. (B) Tripla co-macchiatura per CD8, PD-1 e Tim-3 (fuse) è mostrato sulla sinistra con la casella che indica quel verde è CD8+ T cellule co-espressione PD-1 e/o Tim-3. Per il conteggio automatizzato con il software di analisi di immagine, l'identificazione delle cellule si basa sulla presenza di una colorazione nucleare (DAPI); la segmentazione delle cellule si basa anche su caratteristiche morfometriche rappresentate come contorni rossi (pannello centrale). Un algoritmo addestrato dall'utente finché non concordanza con visual totali viene eseguita (a destra) e dopo che phenotyping automatizzato, identifica i punti verdi come CD8+ T cellule cheesprimono PD-1 e Tim-3, red dots come CD8+ T cellule che esprimono PD-1 senza Tim-3 e blu puntini come CD8+ T cellule che non esprimono PD-1 o Tim-3. La barra della scala rappresenta 20 µm. giallo casella Mostra PD-1 e/o Tim-3 che esprimono CD8+ T cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: calcolo i dati grezzi di analisi multispettrale. Dati del conteggio di ogni categoria di cellule presente in ogni campo (cioè, 5 campi/paziente, cioè, 5. txt file) vengono raccolti dopo l'analisi di immagine. Uno script R combina i dati di 5 campi, considerando solo le cellule fenotipizzate con un intervallo di confidenza > 55%. È l'ingrandimento del microscopio 20x e la barra della scala rappresenta 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: PD-1+ + CD8 Tim-3+ T cellule esprimono livelli più elevati di PD-1 rispetto al PD-1+ CD8 Tim-3– + T cellule nel carcinoma renale delle cellule. L'intensità del PD-1 viene rilevata a livello cellulare (pannello sinistro) dall'analisi di immunofluorescenza in situ sul PD-1+ + Tim-3 e PD-1+ CD8 Tim-3– + T cellule. A livello individuale (pannello centrale): risultati sono indicati per l'intero CD8+ T cell sottoinsiemi PD-1+ + Tim-3 contro PD-1+ Tim-3– presente su una sezione di tessuto (cioè, un paziente; Test di Mann Whitney). Analisi comparativa di intensità media PD-1 è stata misurata in una serie di 9 pazienti (pannello di destra) (test di Wilcoxon, p-valori inferiori a 0,05 sono stati considerati come significativi). È l'ingrandimento del microscopio 20x e la barra della scala rappresenta 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: PD-L1 e Gal-9 cioè PD-1 e Tim-3 ligandi che macchia il carcinoma renale delle cellule. (A) tumore le cellule sono identificate macchiando di pan-cheratina. Co-macchiatura del PD-L1 e pan-cheratina (un pannello) identifica l'espressione del PD-L1 sulle cellule del tumore in 58 pazienti fuori 87 analizzati. (B) galectina-9 è stato espresso in tutti i 15 tumori da pazienti RCC analizzati. La positività è stata considerata se almeno il 10% delle cellule sono state macchiate per il marcatore analizzato. Isotype controlli erano inclusi per ogni colorazione. Scatole gialle rappresentano tumore positivo (pan-cheratina +) cellule per PD-L1 (pannello A) o galectina-9 (pannello B). È l'ingrandimento del microscopio 20x e la barra della scala rappresenta 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Cellule di T di %/CD8+ PD-1+ PD1+ + Tim-3 PD-1+ Tim-3–
TNM 0,04 0,003 0.22
Furhman 0,01 0,004 0,74
Dimensioni del tumore 0.08 0,01 0,37
UISS 0,01 0,01 0,63

Tabella 1: Correlazione tra l'espressione di PD-1 da solo o combinato con Tim-3 il CD8+ T cellule e parametri prognostici clinici dei pazienti RCC: p-valori. La percentuale di PD-1+, PD-1+ + Tim-3 o PD-1+ Tim-3– il CD8+ T celle selezionate come una variabile continua misurata dall'immunofluorescenza in situ nella coorte di 87 pazienti è stata correlata con vari parametri clinici definiti come un file binario (TNM, grado di Fuhrman, Punteggio UISS) o una variabile continua (dimensioni del tumore). TNM è stata divisa in due gruppi: localizzato (pT1 e pT2) e la malattia avanzata (pT3, pT4, N+, o M+). Grado di Fuhrman è stata definita come basso (grado I o II) e alta (grado III o IV) e il Punteggio di UISS era divisa in 3 classi (0, 1 e 2). P-valori che indicano una correlazione significativa sono indicati in grassetto.

CD8+ T cell sottoinsieme/CD8 PD-1+ Tim-3+ PD-1+ Tim-3–
Mediana (%) 34,7 8.6
Correlazione con PFS P = 0,046 P = 0,8

Tabella 2: Correlazione tra PD-1 e Tim-3 co-espressione il CD8+ T cellule e progressione sopravvivenza libera. Due gruppi di pazienti RCC (n = 87) a seconda della percentuale di PD-1 senza Tim-3 (a destra), siano state individuate PD-1 e Tim-3 (a sinistra) relativa alla mediana. La correlazione con la PFS è stata effettuata con la mediana selezionata come un cut-off. P-valori che indicano una correlazione significativa sono indicati in grassetto.

Supplementare tabella 1: composizione di TBS e TBST del Buffer. TBS è utilizzato per miscele di anticorpo e diluizioni. Per lavaggi, tutti i passaggi vengono eseguiti con TBS fatta eccezione per i lavaggi dopo gli anticorpi primari, dove TBST è raccomandato. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Supplementare tabella 2: mescolano gli anticorpi dettagliati composizione per colorazione di immunofluorescenza di CD8-PD-1-Tim-3. Ogni anticorpo primario, secondario e terziario mescola, la diluizione per eseguire il corrispondente volume di TBS è stato dato per un volume totale di 1 mL. Per una diapositiva, il volume di reazione totale necessaria è di 100 µ l per una zona di tessuto di 2 cm2. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Le modifiche e la risoluzione dei problemi:

La qualità del tessuto è un parametro importante; può essere facilmente controllato tramite colorazione ematossilina ed eosina.

Uno dei vantaggi della tecnica è la possibilità di stainings multiplex, ma per evitare fluoroforo spillover, consiglia di scegliere lunghezze d'onda di emissione con delta di minimo 10 nm. Qui, perché abbiamo avuto 4 stainings compreso DAPI, abbiamo scelto stendere le lunghezze d'onda (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, cianina 3:570 nm, cianina 5:670 nm). Utilizzando il software per calcolare lo spettro puro di un fluoroforo da un segnale di emissione mista, combinato con un'analisi di immagine automatizzato è evitare il rischio di sovrapposizione di segnali provenienti da vari fluorofori. I vetrini colorati mono anche confermano l'assenza di sovrapposizioni tra fluorofori e agire come una compensazione grazie alla libreria spettrale.

A volte la positività per un marcatore in una cella può essere difficile determinare se la colorazione/fluorescenza è debole. Il controllo negativo incluso in ogni esperimento è un buon modo per determinare una soglia di positività.

Nel accoppiato software utilizzato per analizzare le immagini, un passo di punteggio per determinare la positività della cella esiste ma solo può analizzare simultaneamente due marcatori. Perché possiamo avere tripla colorazione sulla stessa cellula (CD8, PD-1 e Tim-3), abbiamo scelto il passo phenotyping.

Il passo di fenotipizzazione può essere faticoso, soprattutto se il tipo di colorazione e sfondo è variabile da un campione a altro.

Limiti della tecnica:

Anche se il numero di co-stainings è un vantaggio rispetto alla fluorescenza convenzionale, non è possibile analizzare molti colori come in citometria a flusso. Soprattutto quando la colocalizzazione di più marcatori è studiato, essere consapevoli per sensibilità inferiore confrontata con la microscopia confocale (per un 20 x ingrandimento del microscopio, circa 0,5 µm contro 0,1 µm per pixel per confocale, a seconda della marca) e Verifica per fluoroforo spillover (Vedi critica passi entro il protocollo, sotto).

Una grande limitazione della tecnica è il formato di dati grezzi. I dati grezzi sono file. txt che potrebbero essere difficili da utilizzare. Come il software dà un file. txt per immagine con CI per il fenotipo, il trattamento manuale di ciascuno dei 5 file per paziente di una serie enorme è molto laborioso. Uno specialista di bioinformatica è necessaria per calcolare tutti i dati in un software statistico.

Significato per quanto riguarda i metodi esistenti:

Analisi "multiplex" colorazione sono facilmente possibile. Rispetto al flusso cytometry, che analizza campioni freschi, questa tecnica permette un rapido conteggio in un metodo riproducibile dei sottoinsiemi differenti delle cellule presenti nel microambiente tumorale, in larghe coorti di campioni congelati con una procedura automatizzata26 ,27. Abbiamo potuto contare automaticamente infiltrazione CD8+ T cellule esprimenti PD-1 e co-espressione di Tim-3 o non nella cornice del RCC. Il conteggio automatico evita diversi pregiudizi come affaticamento della vista e conteggio non riproducibili e non è molto tempo.

Come il grande gruppo studiato era il campione congelato, avevamo i dati retrospettivi così potessimo collegare il numero assoluto o percentuale del CD8+ T cell sottoinsiemi con parametri biologici e risultato clinico. Come c'è un'importante eterogeneità dell'infiltrazione immune da un paziente a un altro28, questo rappresenta un vantaggio rispetto a fluorocytometry che segnala solo MFI e percentuale ma non il grado di infiltrazione.

L'intensità di fluorescenza è quantitativamente segnalato per ogni cella e nei compartimenti cellulari differenti (membrana/citoplasma/nuclei), abbiamo potuto valutare il livello di PD-1 macchiatura di MFI alla membrana. Questo rappresenta un altro strumento interessante che è simile al flusso cytometry. Abbiamo trovato che il PD-1+ CD8+ T cellule esprimenti Tim-3 hanno avuti più alta espressione del PD-1 e sono state associate con una prognosi difficile (impatto sulla sopravvivenza libera da progressione). A nostra conoscenza, è il primo studio che usando questo metodo che mostra un significato clinico di un sottoinsieme specifico delle cellule.

Future applicazioni:

Il campo di applicazione è immenso. Abbiamo anche evidenziato nel microambiente del tumore del polmone cancro un altro sottoinsieme specifico delle cellule: cellule T di memoria residente di tessuto chiamato TRM (CD103+ CD49a+), e sono correlati con una migliore complessiva sopravvivenza21,29 ,30. In un'altra opera utilizzando questa tecnica, il nostro team ha scoperto PD-L1 overexpressed in cellule del tumore in un sottotipo di cancro ai polmoni con un riarrangiamento di linfoma anaplastic della chinasi (ALK), che questa espressione è stata correlata con CD8+ T infiltrarsi10. Questa tecnica è adatta per la valutazione dei parametri biologici critici in contesti diversi e può rappresentare un valido strumento per la scoperta del biomarcatore. Poiché le coordinate xy sono dato, è uno dei primi strumenti per studiare la topografia e la cellula/cellula interazioni con facilità31.

Fasi critiche all'interno del protocollo:

Una delle fasi critiche è l'ottimizzazione della co-colorazione, che può richiedere molto tempo. La scelta di un buon anticorpo è fondamentale, per esempio più cloni sono stati testati per Tim-3 nel caso di specie. Inoltre, fluorofori diversi per lo stesso marcatore possono dare risultati diversi, quindi è importante provare diverse combinazioni. È consigliabile esaminare la specificità che macchia con gli anticorpi che non dovrebbe reagire insieme. Nonostante la possibilità di analizzare diversi fluorofori allo stesso tempo, si consiglia di controllare per ricaduta con i vetrini colorati mono. Un altro punto cruciale è il passo di fenotipizzazione che si basa sulla formazione manuale per eseguire con attenzione.

In totale, l'utilizzo di questa tecnica multiplex da un operatore esperto rappresenta un elegante strumento per analizzare più sottoinsiemi di cellule dell'infiltrato immune locale, che è di importanza in quanto l'analisi del sangue periferico non può essere rappresentante del tumore locale ambiente.

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Disclosures

Tutti gli autori non hanno alcun conflitto di interessi per dichiarare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Labex Immuno-Oncologia (ET), CARPEM SIRIC (CG, ET), Institut National du Cancer (INCA) (ET), Ligue contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Parigi Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET). EdG è stato finanziato da una borsa di studio della Fondation ARC. EV e CD sono stati finanziati da un sodalizio di APHP (bourse année recherche). ChB è finanziato da una borsa di studio dell'Université Sorbonne Parigi Cité (contrat doctoral). Gli autori ringraziano la Bristol Myers Squibb per il loro finanziamento in questo progetto. Gli autori ringraziano il reparto di patologia dell'Hôpital Européen Georges Pompidou e Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel e Gisèle Legall). Gli autori ringraziano la piattaforma di istologia del PARCC, Hôpital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging  Perkin Elmer CLS142338
inForm cell analysis 2.1. Perkin Elmer CLS135781
R software https://www.r-project.org
Dakopen delimiting pen Dako S2002
Tris Buffer Salin TBS Tablets Takara, Bio Inc. TAKT9141Z pH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) Takara, Bio Inc. TAKT9142Z pH 7.6 100 tablets
Biotin blocking system Dako X0590 Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serum Jackson Immunoresearch 017-000-001 5% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPI Sigma-aldrich F6057 1.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslip Knittel Gläser, 100039 24x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V novus NBP1-79055 use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NAT abcam ab52587 use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3 R&D AF2365 use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 Roche 7309457001 use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 Cell Signalling 4528 use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9 R&D AF2045 use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-175-152 use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 715-066-150 use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG abcam ab150133 use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidin Amersham PA43001 use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1 Dako X0931 use at 2 µg/mL
IgG from goat serum Sigma-aldrich I5256 use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serum Sigma-aldrich I5006 use at 4µg/mL

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References

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Multiplexed immunofluorescenza analisi e quantificazione di Intratumoral PD-1<sup>+</sup> <sup>+</sup> Tim-3 CD8<sup>+</sup> T cellule
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