Visualización de la actina y los microtúbulos citoesqueletos en la sinapsis inmune de células B mediante microscopía de emisión (STED) el agotamiento
Summary
Presentamos un protocolo para el uso de microscopia de STED simultáneamente las estructuras de actina imagen, microtúbulos y proteínas microtubule plus final en las células de B que se han diseminado en cubreobjetos recubierto con anticuerpos contra el receptor de células B, un modelo para la fase inicial de formación de la sinapsis inmune.
Abstract
Las células de B que se unen a los antígenos de membrana (p. ej., en la superficie de una célula presentadora de antígeno) forman una sinapsis inmune, una estructura celular especializada que optimiza la señalización de receptores (BCR) de células B y adquisición de antígeno mediada por BCR. La remodelación del citoesqueleto de la actinia y la reorientación de la red de microtúbulos hacia el sitio de contacto del antígeno son esenciales para la formación de la sinapsis inmune. Remodelación del citoesqueleto de actina en un anillo denso periférico de la F-actina se acompaña de polarización del centro organizador de microtúbulos hacia la sinapsis inmune. Proteínas de microtúbulos plus final, así como proteínas cortical final plus captura median interacciones físicas entre los citoesqueletos de actina y microtúbulos, que permitan reorganizar de manera coordinada. Elucidar los mecanismos que esta reorganización del citoesqueleto, así como entender cómo estas estructuras citoesqueléticas forma formación de sinapsis inmune BCR de señalización, de control pueden proporcionar nuevas visiones en la activación de la célula de B. Esto ha sido ayudado por el desarrollo de enfoques de microscopía de superresolución que revelan nuevos detalles de organización en red citoesquelética. Aquí describimos un método para el uso de microscopia de agotamiento (STED) emisión estimulada simultáneamente las estructuras de actina imagen, microtúbulos y transfected microtúbulos tagged GFP plus final proteínas en las células de B. Para modelar los acontecimientos tempranos en la formación de sinapsis inmune, permitimos que las células de B untar en cubreobjetos recubierto con anticuerpos de anti-inmunoglobulinas (anti-Ig), que inician BCR señalización y remodelación del citoesqueleto. Ofrecemos protocolos paso a paso para expresar proteínas de la fusión de GFP en células de linfoma B de A20, para la difusión de anti-Ig-inducida de la célula y para la fijación posterior de la célula, Immunostaining, adquisición de imágenes y pasos de deconvolución de imagen. Las imágenes de alta resolución obtenidas mediante estos procedimientos permiten visualizar simultáneamente estructuras de actina, microtúbulos y las microtúbulos plus final proteínas que pueden vincular estas dos redes citoesqueléticas.
Introduction
Cuando las células B se unen a polarizado matrices de antígenos (por ejemplo, aparece en la superficie del antígeno que presenta las células (APCs)), el resultante receptor de células B (BCR) la formación de una estructura de la sinapsis inmune clásico, que era el primer descrita en las unidades de señalización T las células1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Inicialmente, micromasas de forma de BCR antígeno-limita en la periferia del sitio contacto B celular: APC. Estas micromasas luego moverse hacia el centro del sitio contacto antígeno, donde ellos se fusionan en un grupo central de activación supramolecular (cSMAC) que forma la base de la sinapsis inmune. Formación de sinapsis inmune optimiza el BCR señalización y facilita la extracción de antígeno mediada por BCR de membrana APC14. Esta adquisición de antígeno, que es seguida por internalización mediada por BCR antígeno y el antígeno subsecuente procesamiento, permite a las células B presentan péptido: MHC complejos II a las células T y obtener ayuda de la célula de T14. Porque promueve la formación de sinapsis inmune activación de células B, elucidar los mecanismos que establecen que este patrón funcional de la organización del receptor puede proporcionar nuevas penetraciones en la respuesta inmune humoral cómo se inició y regulados.
Reorganización de la actina y los microtúbulos citoesqueletos es esencial para la formación de la sinapsis inmune. BCR localizado señalización estimulada por una variedad espacial polarizado de antígenos induce la rápida y espectacular remodelación del citoesqueleto actina1,15. La formación de estructuras dendríticas de la actina en la periferia de la célula de B ejerce fuerzas de empuje en la membrana plasmática y promueve la difusión de la célula de B. Esto permite a la célula de B explorar un área mayor de la superficie de cojinete de antígeno y aumenta el número de BCR que se unen antígeno y activar vías de señalización del BCR. Al mismo tiempo, la COMT y la red de microtúbulos son reorientados hacia el sitio de contacto del antígeno. Como el MTOC aproxima el sitio de contacto del antígeno, los microtúbulos que emanan de la COMT se extienden a lo largo de la cara interna de la membrana plasmática en la interfase entre la célula de B y la superficie de cojinete de antígeno16,17. Estos microtúbulos juxtamembrane pueden entonces actuar como vías para el movimiento centrípeto de antígeno-limita BCR micromasas18, conduciendo a la formación de un cSMAC mediado por dineína.
La reorientación y la polarización de la COMT hacia la sinapsis inmune requiere actina intacto y citoesqueletos de microtúbulos y a menudo depende de las interacciones entre la actina cortical red y microtúbulos16,17, 19,20. Proteínas de unión a actina corticales, como IQGAP1, pueden capturar microtúbulos interactúan con complejos proteínicos que decoran los microtúbulos más extremos21. Estos dinámicos complejos de proteínas final plus incluyen EB1 y CLIP-170, que se refieren colectivamente como microtúbulos plus-final seguimiento de proteínas (+ consejos)21,22. + Puntas en los extremos de los microtúbulos pueden atar a las proteínas que están asociadas con la membrana plasmática o con el citoesqueleto de actina cortical. Esto permite mecanismos de generación de fuerza (p. ej., al final menos dirigió movimiento de dineína cortical anclados a lo largo de los microtúbulos) ejercen fuerzas de tracción en microtúbulos, y así reposicionar el MTOC. CLIP-170 puede unir a la proteína de andamiaje de actina asociados IQGAP123, y hemos demostrado que ambas de estas proteínas son necesarios para la polarización inducida por el BCR MTOC hacia la sinapsis inmune17. Esta interacción IQGAP1-CLIP-170 puede jugar un papel clave en la coordinación de la remodelación del citoesqueleto de actina con la reposición de la red de microtúbulos en la sinapsis inmune de células B.
Microscopía de fluorescencia convencional ha puesto de manifiesto la dramática reorganización de los citoesqueletos de actina y microtúbulos en células B sinapsis inmune formación2. Sin embargo, este enfoque no puede resolver estructuras celulares pequeños detalles debido al límite de difracción de la luz, que, conforme a la ley de Abbe, depende de la longitud de onda de la luz utilizada para iluminar la muestra y la abertura del objetivo24. Este límite de difracción limita la resolución de los microscopios de luz convencionales a 200-300 nm en la dirección lateral y 500-700 nm en la dirección axial25. Por lo tanto, pequeñas estructuras subcelulares, así como los detalles de los citoesqueletos de actina y microtúbulos, sólo se pudieran observar mediante microscopía electrónica. Proyección de imagen de microscopia electrónica del citoesqueleto es lento, requiere protocolos de fijación y preparación muestra áspero que pueden alterar las estructuras biológicas y se limita a la detección de anticuerpo-mediada. La habilidad de immunostain y simultáneamente imagen múltiples proteínas o estructuras celulares es una ventaja sustancial de microscopía de fluorescencia. Además, la expresión de proteínas fluorescentes de fusión en las células permite la proyección de imagen en tiempo real y es útil cuando no hay anticuerpos efectivos para la inmunotinción de la proteína de interés.
Recientes avances tecnológicos en microscopía de superresolución superar los límites de la difracción de la luz y permite la visualización de las estructuras celulares de nanoescala24. Una tal técnica de microscopía de resolución súper se llama estimulante de la emisión (STED) agotamiento de la microscopia. STED utiliza dos rayos láser, donde un láser excita el fluoróforo y un segundo láser con un patrón en forma de dona suprime selectivamente la emisión de fluorescencia en el fluoróforo. Esto reduce la función de punto de extensión (área aparente) de una sola partícula fluorescente y proporciona una secundario-difracción límite imagen fluorescente25,26. Microscopía-estado de agotamiento también emplea técnicas basadas en fluorescencia para adquirir imágenes de súper resolución. Sin embargo, los tiempos de adquisición y reconstrucción de imágenes largos, hay sólo un número limitado de fluoróforos que pueden utilizarse y la proyección de imagen alta resolución simultánea de múltiples componentes citoesqueléticos técnicamente es difícil porque mantener estructuras de actina y microtúbulos requiere fijación diferentes procedimientos. Por lo tanto, STED tiene múltiples ventajas sobre la microscopía electrónica y otra microscopía de superresolución enfoques que ofrece la adquisición de imágenes rápido, tiene requisitos mínimos del post-processing y emplea el mismo fluoróforos y técnicas de tinción se utilizan para microscopía de fluorescencia convencional de muestras fijadas26.
Microscopia de la estupendo-resolución ya ha sido utilizada para visualizar estructuras de actina en la sinapsis inmune en células de naturales del asesinas (NK) y26,de las células de T27,de29,de28,30, 31. sin embargo, la proyección de imagen de súper-resolución del citoesqueleto de microtúbulos, así como la reorganización coordinada de los citoesqueletos de actina y microtúbulos durante la formación de la sinapsis inmune, sólo recientemente ha sido reportado17. Se utilizó la microscopia de STED a imagen B células que habían sido autorizadas a difundir en cubreobjetos recubierto con anticuerpos de anti-inmunoglobulinas (anti-Ig), que estimulan el BCR señalización e inician la reorganización del citoesqueleto. Cuando plateado en anticuerpos anti-Ig inmovilizados, las células de B se someten a dramático dependiente de actina que se separa, que recapitula los acontecimientos iniciales durante la formación de la sinapsis inmune. Lo importante, microscopia de STED reveló los detalles del anillo dendrítico de la F-actina que forma en la periferia de la inmune sinapsis y demostró que la COMT, como los microtúbulos Unidos a él, se habían movido cerca el contacto antígeno del17. Estos microtúbulos se extendieron hacia fuera hacia el anillo periférico de la F-actina. Por otra parte, la proyección de imagen de STED multicolor de varias combinaciones de F-actina, tubulina, IQGAP1 y GFP-tagged CLIP-170 + consejos demostraron que microtúbulos plus-extremos marcados por CLIP-170-GFP eran estrechamente relacionados con la red de actina periférica y IQGAP1, un captura de cortical proteína17.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para la proyección de imagen los citoesqueletos de actina y microtúbulos en la sinapsis inmune usando microscopia de STED. Estos métodos han sido optimizados utilizando la línea A20 de células B murinas, que ha sido ampliamente empleada para el estudio de BCR señalización y formación de sinapsis inmune17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. porque anticuerpos comerciales para CLIP-170 no funcionó bien para la inmunotinción en experimentos anteriores, describimos en detalle la expresión de GFP-tagged CLIP-170 en celdas A20, junto con protocolos para visualizar simultáneamente hasta la coloración tres componentes citoesqueléticos o proteínas citoesqueleto asociadas. Métodos para el uso de microscopia de STED a actina imagen en sinapsis inmunes de la célula NK han sido descritos40. Aquí, nosotros extendemos esta adquisición de imágenes de múltiples colores súper resolución de citoesqueletos la actina y los microtúbulos en las células de B.
Una consideración crítica para microscopía de superresolución está utilizando los procedimientos de fijación adecuado para mantener las estructuras celulares y prevenir el daño a las proteínas fluorescentes. La fijación y tinción métodos presentados en este documento han sido optimizados para retener la fluorescencia de GFP y proporcionar imágenes de alta resolución de las redes de actina y microtúbulos. Cuando la expresión de proteínas fluorescentes, debe señalarse que las células B son generalmente difíciles de transfectar. Mediante este protocolo, 20-50% de A20 células típicamente expresan la proteína de la fusión de GFP transfected, y entre esta población los niveles de expresión de la proteína son variables. Sin embargo, la proyección de imagen de súper-resolución de actina y microtúbulos mediante los procedimientos que describimos es bastante robusta y fácilmente se obtienen imágenes de alta calidad. A pesar de su pequeño tamaño en relación con las células de la A20, nos muestran que estos procedimientos también pueden utilizarse para la red de microtúbulos en las células B primarias que han sido activados brevemente con lipopolisacárido (LPS) de la imagen. Hemos demostrado que las células primarias de LPS activa B pueden ser transfectadas con siRNAs con relativamente alta eficiencia (es decir, tal que agotamiento de proteínas se puede detectar por immunoblotting), haciendo que una buena alternativa a la utilización de líneas de células B para algunos estudios 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Imágenes detalladas de estructuras citoesqueléticas pueden obtenerse usando microscopia de STED súper resolución, que teóricamente puede alcanzar una resolución de 50 nm, en comparación con microscopia confocal convencional, para que la resolución de la difracción limitada es de ~ 200 nm 24. la capacidad para resolver las estructuras más finas es aún mayor utilizando software de deconvolución para calcular la posición más probable de la fuente de luz original de la señal observada f…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a las instalaciones de proyección de imagen del Instituto de Ciencias de la vida de UBC (LSI) para apoyar y mantener el microscopio STED. Este trabajo fue financiado por beca #68865 de los institutos canadienses de investigación en salud (a M.R.G.). Agradecemos al Dr. Kozo Kaibuchi (Universidad de Nagoya, Nagoya, Japón) el plásmido CLIP-170-GFP.
Materials
| Cell culture | |||
| A20 mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamine | Millipore Sigma | G5763 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P5280 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid, 10,000 units |
| Additional materials for primary B cells | |||
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| Magnetic bead-based B cell isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep Mouse B cell Isolation kit |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS from E. coli 0111:B4 |
| B cell-activating factor (BAFF) | R&D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid encoding CLIP-170-GFP | Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
| Recommended transfection reagents and equipment | |||
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Falcon 6-well plates, TC treated, sterile | Corning | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating coverslips | |||
| 18-mm diameter round #1.5 cover glasses | Thomas Scientific | 1217N81 | Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580 |
| Forceps | Fisher Scientific | 1381242 | Dissecting extra fine splinter forceps |
| Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate | Corning | 353043 | |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | For A20 cells |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | For primary mouse B cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Paraformaldehyde (16% stock solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute with PBS to working concentration |
| Glutaraldehyde (50% stock solution) | Millipore Sigma | 340855 | Dilute with PBS to working concentration |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| Bovine serum albumin (BSA), Fraction V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| Rabbit anti-tubulin antibody | Abcam | ab52866 | 1:250 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 1:100 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1:100 dilution recommneded but should be optimized |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Without DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica | ||
| Huygens deconvolution software | Scientific Voume Imaging | See https://svi.nl/HuygensProducts |
Referenzen
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