Summary
रोधी यौगिकों और अर्क स्क्रीनिंग के लिए एक आसान और अनुकूलनीय शोरबा microdilution विधि ।
Abstract
फंगल संक्रमण पिछले दशकों में एक महत्वपूर्ण चिकित्सा शर्त बन गए हैं, लेकिन उपलब्ध रोधी दवाओं की संख्या सीमित है । इस परिदृश्य में, नई रोधी दवाओं के लिए खोज आवश्यक है । प्रोटोकॉल यहां रिपोर्ट विवरण एक विधि उनके रोधी संपत्तियों के लिए पेप्टाइड्स स्क्रीन करने के लिए । यह नैदानिक और प्रयोगशाला मानक संस्थान (CLSI) M27 से शोरबा microdilution संवेदनशीलता परीक्षण पर आधारित है, संशोधन के साथ A3 दिशानिर्देश के लिए संभावित नई रोधी के रूप में रोगाणुरोधी पेप्टाइड के अनुसंधान के अनुरूप है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक कार्यात्मक परख के लिए रोधी यौगिकों की गतिविधि का मूल्यांकन और आसानी से जांच के तहत अणुओं के किसी विशेष वर्ग के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है । के बाद से परख ९६ में प्रदर्शन कर रहे है अच्छी तरह से छोटी मात्रा का उपयोग कर प्लेटें, एक बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग समय की एक छोटी राशि में पूरा किया जा सकता है, खासकर यदि एक स्वचालन सेटिंग में बाहर ले । इस प्रक्रिया को दर्शाता है कि कैसे एक मानकीकृत और समायोज्य नैदानिक प्रोटोकॉल मदद कर सकता बेंच-नए अणुओं के काम की खोज कवक रोगों की चिकित्सा में सुधार करने के लिए ।
Introduction
फंगल संक्रमण हाल के दशकों में एक महत्वपूर्ण चिकित्सा चिंता का विषय बन गए हैं, काफी मुख्य रूप से प्रतिरक्षा व्यक्तियों की संख्या में वृद्धि के कारण ऐसे कैंसर के इलाज के दौर से गुजर उन लोगों के रूप में और एचआईवी के साथ रहने वाले लोगों/ प्रत्यारोपण अंगों1,2। हालांकि, उपलब्ध रोधी दवाओं की एक बहुत ही सीमित सरणी और कवक प्रतिरोध पर रिपोर्टों की बढ़ती संख्या के लिए उंहें प्रणालीगत mycoses के चिकित्सकीय के बारे में प्रमुख समस्याओं के लिए योगदान3।
नई रोधी यौगिकों के एक संभावित स्रोत रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (AMPs), छोटे cationic के लिए अपनी जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के भाग के रूप में कई जीवों द्वारा उत्पादित पेप्टाइड्स है4संक्रमण. फिर भी, जांच विधि कवक रोगजनकों के खिलाफ इन यौगिकों का परीक्षण करने के लिए मानकीकृत नहीं है । विभिन्न प्रक्रियाओं AMPs के रोधी गतिविधि का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, कभी-कभार एक ही मॉडल के लिए5,6,7. इन मतभेदों और कुछ प्रोटोकॉल में विस्तार की कमी यौगिकों और बाधा reproducibility के बीच तुलना जटिल ।
नैदानिक और प्रयोगशाला मानक संस्थान (CLSI) M27-A3 दिशानिर्देश जैसे नैदानिक सेटिंग में रोधी संवेदनशीलता को परिभाषित करने के लिए उपयोग किए गए दिशानिर्देशों का पालन करने के लिए नए दवा उंमीदवारों के परीक्षण का मानकीकरण करने का एक तरीका है । हालांकि, इन रोधी संवेदनशीलता परीक्षण भी प्रतिबंधात्मक हैं, और नहीं ले प्रजातियों के पार चयापचय में भिंनता को ध्यान में रखते हैं, के रूप में वे केवल कुछ चुनिंदा एजेंटों के लिए स्थापित किया गया । उदाहरण के लिए, वे खाते में गैर-किण्वित खमीर के चयापचय की जरूरत नहीं ले ।
इस प्रोटोकॉल भावी रोधी यौगिकों की गतिविधि के आकलन की अनुमति देता है, और यहां रोधी पेप्टाइड्स के लिए खोज के लिए लागू है । यह CLSI M27 से शोरबा microdilution संवेदनशीलता परीक्षण पर आधारित है कि संशोधनों के साथ A3 दिशानिर्देश है कि नए यौगिकों8,9की स्क्रीनिंग का अनुकूलन । इन परिवर्तनों यौगिक की छोटी मात्रा के उपयोग के लिए अनुमति देते हैं, तापमान या प्रारंभिक इनोक्युलम में बदलाव, और इष्टतम पूर्व परीक्षण के विकास के लिए अलग मीडिया, जबकि नियंत्रण के रूप में संदर्भ रोधी के उपयोग के साथ परिणामों का मानकीकरण । इस विधि, बहु के उपयोग के साथ अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटें, यह संभव बनाता है जल्दी और मज़बूती से यौगिकों की एक बड़ी संख्या स्क्रीन ।
अपने निहित लचीलेपन के कारण, इस प्रोटोकॉल यौगिकों के विभिन्न रासायनिक वर्गों और अन्य सूक्ष्मजीवों के खिलाफ के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, कुछ रूपांतरों के साथ.
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Protocol
1. समाधान और मीडिया
- 2x रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) १६४० मध्यम, फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब), Sabouraud डेक्सट्रोज शोरबा, और Sabouraud डेक्सट्रोज आगार तैयार तालिका 1के अनुसार ।
2. फंगल इनोक्युलम ग्रोथ की स्थिति
- ३५% ग्लिसरॉल में जमे हुए शेयरों के रूप में सभी कवक उपभेदों की दुकान-८० डिग्री सेल्सियस, जब तक जरूरत है ।
- प्रत्येक प्रयोग करने से पहले निंन चरणों का पालन करें ।
- Candida albicans उपभेदों के लिए:
- गल एक शेयर शीशी और हस्तांतरण २०० µ एल एक बाँझ ५० मिलीलीटर में एक टोपी और संस्कृति के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आंदोलन के साथ Sabouraud डेक्सट्रोज शोरबा में 10 मिलीलीटर (२०० rpm) । ट्यूब झुकाव और संस्कृति के बेहतर वातन के लिए थोड़ा खुला टोपी छोड़ने के लिए याद रखें ।
- Cryptococcus neoformans उपभेदों के लिए:
- एक शेयर शीशी के जमे हुए सतह परिमार्जन । प्लेट पर कोशिकाओं Sabouraud डेक्सट्रोज आगर प्लेटें और ४८ एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी । पृथक कालोनियों के दृश्य विकास के बाद, फ्रिज (4 डिग्री सेल्सियस) में 15 दिनों के लिए तेल फिल्म के साथ बंद प्लेटें रखें ।
- एक बाँझ दंर्तखोदनी या बाँझ inoculating पाश और inoculate एक बाँझ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में Sabouraud डेक्सट्रोज शोरबा के 10 मिलीलीटर का उपयोग कर प्लेट से एक मध्यम आकार के अलग कॉलोनी लीजिए । आंदोलन के तहत 30 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 24 घंटे के लिए मशीन (२०० rpm) ।
- 24 एच की मशीन से अधिक नहीं है । ट्यूब झुकाव और बेहतर वातन के लिए थोड़ा खुला टोपी छोड़ने के लिए याद रखें । यह हमेशा के लिए एक परीक्षण से पहले कोशिकाओं के विकास के स्तर को मानकीकृत करने के लिए अच्छा है, क्योंकि यह एक महत्वपूर्ण रोगाणुरोधी प्रतिरोध को प्रभावित कारक है.
नोट: दोनों कवक हमारे प्रयोगों में तेजी से प्रचार के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर बड़े हो गए थे, लेकिन तापमान अध्ययन के उद्देश्य को प्रतिबिंबित करने के लिए बदला जा सकता है, उदाहरण के लिए नैदानिक उपचार (३७ ° c). सबसे महत्वपूर्ण बात, इस प्रारंभिक मशीन समय प्रत्येक कवक को अलग और सभी परीक्षणों में बनाए रखा reproducibility सुनिश्चित करने के लिए पहले से स्थापित किया जाना चाहिए ।
- Candida albicans उपभेदों के लिए:
- कवक वृद्धि के बाद, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १,२०० x g पर शंकु ट्यूबों के केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा । supernatant को त्यागें और पंजाब के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
- कोशिकाओं reसस्पेंड और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १,२०० x g पर फिर से केंद्रापसारक ।
- दोहराएं पंजाबियों धोने और केंद्रापसारक दो बार और अधिक । तीसरे धोने के बाद, 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड (गोली आकार के अनुसार) 2x RPMI-१६४० मध्यम ।
- एक microcentrifuge ट्यूब में एक 1:100 या 1:1000 कमजोर पड़ने के 1 मिलीलीटर तैयार (सेल निलंबन के turbidity पर निर्भर करता है) ।
- इस कमजोर पड़ने के Aliquot 10 µ एल, यह एक hemocytometer चैंबर में जगह और माइक्रोस्कोप के तहत चार कोने चक्रों में कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना. सूत्र द्वारा एकाग्रता की गणना: (कुल सेल संख्या/4) एक्स कमजोर पड़ने कारक एक्स 104 (चैंबर कमजोर पड़ने लगातार) ।
- एक १००% व्यवहार्यता पर विचार अगर व्यवहार्यता गिना जाता है और विकास की स्थिति को व्यवस्थित अलग अध्ययन किया जा रहा के लिए संबद्ध किया गया है ।
नोट: व्यवहार्यता गिनती के मानकीकरण और गुणवत्ता नियंत्रण वापस-चढ़ाना के अनुसार रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण पर यूरोपीय समिति के द्वारा किया जा सकता है (EUCAST) रोधी न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) विधि के लिए जिये10 . - यदि विकास/व्यवहार्यता सहसंबंध के लिए स्थापित नहीं किया गया है के तहत अलग अध्ययन, एक hemocytometer में रहते कोशिकाओं की गिनती द्वारा कवक व्यवहार्यता उपाय है कि चुनिंदा रंग मृत कोशिकाओं, जैसे phloxine बी11, trypan ब्लू के रूप में रंगों की सहायता के साथ १२, या जानुस् ग्रीन१३. इस प्रोटोकॉल के लिए कवक कोशिकाओं का उपयोग केवल अगर इस बिंदु पर जनसंख्या की व्यवहार्यता ९०% या उससे ऊपर है ।
नोट: मृत/जिंदा रंजक पसंद के कवक के साथ अच्छी तरह से काम नहीं कर सकते । उपयोग करने से पहले उन्हें परीक्षण करें । उदाहरण के लिए, trypan नीला डाई C. neoformansके साथ अच्छी तरह से काम नहीं करता है ।
- एक १००% व्यवहार्यता पर विचार अगर व्यवहार्यता गिना जाता है और विकास की स्थिति को व्यवस्थित अलग अध्ययन किया जा रहा के लिए संबद्ध किया गया है ।
- उसके बाद, 2x RPMI में सेल सस्पेंशन-१६४० मध्यम (RPMI-१६४० मध्यम में 2x समायोजित इनोक्युलम) तैयार करते हैं । ९६ के लिए-अच्छी तरह से प्लेटें प्रत्येक थाली के लिए 5 मिलीलीटर की एक मात्रा पर विचार करें ।
- सभी C. albicans उपभेदों के लिए, 4 x 103 कोशिकाओं के एक शेयर सेल निलंबन की तैयारी/ यह एकाग्रता एक अच्छी तरह से (2 x 103 कोशिकाओं/एमएल) में अंतिम कोशिका एकाग्रता के 2x है ।
- C. neoformans उपभेदों के लिए, कोशिकाओं की एक शेयर संस्कृति 2 x 104 कोशिकाओं/एमएल तैयार । इस एकाग्रता दो बार एक अच्छी तरह से (1 x 104 कोशिकाओं/एमएल) में अंतिम कोशिका एकाग्रता है ।
- अंय कवक के लिए, एक ज्ञात रोधी जो एकाग्रता के साथ परीक्षण के संबंध में विशेष अध्ययन के लिए आदर्श होगा मशीन समय । कवक के चयापचय और दोहराव समय को ध्यान में रखें ।
3. पेप्टाइड्स (अज्ञात एजेंट)
- -20 डिग्री सेल्सियस पर lyophilized पेप्टाइड्स स्टोर, और प्रत्येक प्रयोग से पहले उंहें जल में भंग । एक बार पानी में घुल अधिकतम भंडारण समय प्रत्येक पेप्टाइड की प्रकृति पर निर्भर करेगा ।
- दो बार उच्चतम अंतिम परख (2x) में परीक्षण एकाग्रता के aliquots तैयार करें । आदर्श रूप में, एक समय उपयोग के लिए पर्याप्त पेप्टाइड के साथ aliquots की एक छोटी संख्या को तैयार फ्रीज-गल चक्र से बचने के लिए ।
नोट: एकाग्रता का चुनाव साहित्य और पेप्टाइड के गुणों पर आधारित होना चाहिए । यह लगभग १०० µ मीटर पेप्टाइड के साथ धारावाहिक कमजोर पड़ने शुरू करने के लिए सिफारिश की है, और फिर कमी या प्राप्त परिणामों के आधार पर इस एकाग्रता सीमा में वृद्धि.
4. संदर्भ रोधी (सकारात्मक नियंत्रण)
- उन पानी में पतला के लिए: विश्लेषण के उच्चतम एकाग्रता का एक 2x समाधान तैयार (5 अनुभाग देखें: कमजोर पड़ने के लिए परख रोधी कदम) ।
- C. albicans उपभेदों के लिए, १२८ µ g/fluconazole या १२८ µ g/एमएल के caspofungin का समाधान तैयार करें । दोनों के लिए प्लेट एकाग्रता ६४ µ g/mL होगी ।
- C. neoformans उपभेदों के लिए, ३२ µ g/एमएल amphotericin बी (पानी घुलनशील समाधान) का समाधान तैयार करें । प्लेट एकाग्रता 16 µ g/mL होगी ।
नोट: आम तौर पर amphotericin बी dimethyl sulfoxide (DMSO) में पतला है, क्योंकि इस विरोधी कवक पानी में घुलनशील खराब है । हालांकि, वहां पानी में घुलनशील amphotericin बी तैयारी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ।
- एक कार्बनिक विलायक में पतला रोधी के लिए: DMSO में एक 100X स्टॉक समाधान तैयार है, तो उपयोग के लिए पानी में 10x के लिए यह पतला ।
नोट: इस प्रकार, अच्छी तरह से, DMSO के अंतिम एकाग्रता 1% से अधिक नहीं होगा । एक तरह से जहां कवक मीडिया में 1% DMSO युक्त नियंत्रण के रूप में विकसित होगा दिया है कि कुछ कवक अच्छी तरह से विलायक के इस एकाग्रता बर्दाश्त नहीं की आवश्यकता है । याद रखें कि DMSO सहज है, इसलिए पंनी के साथ थाली कवर या यह एक अंधेरे कक्ष में मशीन की अवधि की अवधि के लिए जगह है ।
5. रोधी परख
नोट: इन विट्रो रोधी परख नैदानिक और प्रयोगशाला मानक संस्थान (CLSI) M27-A3 कुछ संशोधनों के साथ दिशानिर्देश से शोरबा microdilution संवेदनशीलता परीक्षण के आधार पर प्रदर्शन कर रहे हैं ।
- ९६ में प्रत्येक पेप्टाइड और नियंत्रण रोधी के एक दो गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार-अच्छी तरह से polystyrene microplates ५० µ एल के एक अंतिम मात्रा करने के लिए
- एक पिपेट का उपयोग कर १०० µ एल रोधी/के 2x एकाग्रता में सबसे अधिक वांछित अंतिम एकाग्रता के कॉलम 1-3 में, एक पंक्ति में जोड़ें ।
- एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, अंय कुओं में बाँझ पानी की ५० µ एल जोड़ें, पंक्तियों में बी ज के लिए ।
- कुओं के ५० µ l को उच्चतम एकाग्रता (row A) के साथ निकालें, अगली एकाग्रता (row B) और homogenize के अगले वेल में स्थानांतरित करें ।
- सबसे कम एकाग्रता के साथ अच्छी तरह से ऊपर कदम दोहराएं और इस तरह (पंक्ति एच) के ५० µ एल त्यागें । कॉलम 11 और 12 छोड़ दो (पंक्तियां A, B, C) या तो रिक्त नियंत्रण या नकारात्मक/
- जोड़ें ५० µ में 2x समायोजित इनोक्युलम के एल RPMI-१६४० माध्यम से एक अच्छी तरह से (कॉलम 1-3 प्लस कॉलम 11 (नकारात्मक/ c. albicans के लिए अंतिम एकाग्रता 2 x 103 कोशिकाओं/एमएल होगा, और सी. neoformans उपभेदों के लिए अंतिम एकाग्रता 104 कोशिकाओं/एमएल होगा ।
- रिक्त नियंत्रण तैयार करें (५० µ l पानी + ५० µ l 2x RPMI-१६४० मध्यम कोशिकाओं के बिना) और नकारात्मक/विकास नियंत्रण (५० µ l पानी + ५० µ l समायोजित इनोक्युलम 2x RPMI-१६४० मध्यम रोधी के बिना), और अच्छी तरह से प्लेट में लोड के रूप में ऊपर वर्णित है ।
- प्रत्येक यौगिक परीक्षण किया जा करने के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ और चुना रोधी नियंत्रण (स्तंभ 4-10).
नोट: सीरियल कमजोर पड़ने के नीचे प्रयोग के रूप में खड़ी किया जा सकता है, या क्षैतिज प्लेट में (यानी, यदि दिए गए यौगिक के कमजोर पड़ने की संख्या/जांच की जरूरत है कि आठ या अधिक है) ।- यदि यौगिकों, संदर्भ दवाओं, या उसके घटकों के किसी भी सहज हैं, कम प्रकाश में परख प्रदर्शन, पंनी के साथ प्लेटों को कवर, या एक अंधेरे कक्ष में जगह के दौरान मशीन ।
- निंन वैकल्पिक अनुशंसाओं पर विचार करें ।
- प्लेट एक स्पष्ट कवर प्लेट कि गैस एक्सचेंज परमिट के साथ सील, के रूप में इस वाष्पीकरण को कम करने में मदद करता है ।
- एक आर्द्र कक्ष में थाली प्लेस; यह भी वाष्पीकरण को कम करने में मदद मिलेगी ।
- सभी ग. albicans उपभेदों के लिए 24 ज या ४८ एच के लिए ३७ ° c पर प्लेट्स मशीन, और २०० के लिए सी. neoformansके लिए मिलाते rpm के साथ ४८ एच के लिए । निचले अंतिम खंड (१०० µ l) सुनिश्चित करता है कि कोई spillover होती है ।
नोट: कोई महत्वपूर्ण अंतर 24 ज और ४८ एच में सी. albicans उपभेदों के लिए MIC रीडिंग के बीच मनाया गया । बहरहाल, ४८ ज में रीडिंग आसान कल्पना कर रहे हैं । - सभी कुओं का निरीक्षण, एक औंधा ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप की सहायता के साथ, गर्मी की अवधि से पहले और के बाद आकृति विज्ञान में परिवर्तन की पुष्टि के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में संदूषण के लक्षण के लिए जांच करने के लिए ।
नोट: रीडिंग नेत्रहीन किया जा सकता है और प्रयोग के अंत में फोटो खिंचवाने. प्रत्येक पढ़ने से पहले, थाली थोड़ा homogenize । पढ़ता भी ६०० एनएम पर अपने आयुध डिपो को मापने के द्वारा किया जा सकता है, अगर कोशिका के झुरमुट या रेशा नहीं मनाया जाता है । - प्रयोगों को कम-से-अलग तिथियों पर तीन बार करें ।
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Representative Results
MIC सबसे कम रोगाणुरोधी यौगिक एकाग्रता है कि पूरी तरह से मशीन की अवधि के अंत में दिखाई फंगल विकास को रोकता है के रूप में परिभाषित किया गया है. चूंकि इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य के लिए एक तेजी से विधि के लिए संभावित रोधी स्क्रीन है, स्पष्ट खाली कुओं के समान मीडिया के साथ किसी भी अच्छी तरह से एक सकारात्मक परिणाम माना जाता है, जबकि turbidity के साथ किसी भी अच्छी तरह से नकारात्मक/ नकारात्मक माना जाता है । हालांकि, अगर वहां एक दिया AMP fungistatic या कवकनाशी है कि क्या जानने में रुचि है, सकारात्मक कुओं से मीडिया भी Sabouraud डेक्सट्रोज आगार पर चढ़ाया जा सकता है या एक और व्यवहार्यता परीक्षण द्वारा जांच की ।
यह देखते हुए कि एक उपंयास यौगिक की कार्रवाई का तंत्र अज्ञात है, इसलिए यह सत्यापित करने के लिए आवश्यक है कि अगर संदर्भ रोधी कवक को अलग करने के लिए अपेक्षित सीमा के भीतर गिर जाता है (जांच सरकारी दिशा निर्देशों, तालिकाओं, या साहित्य में डेटा) की जांच करने से पहले यौगिक के लिए MIC परीक्षण (इस मामले में, एक AMP; चित्रा 1 और चित्रा 2) की पुष्टि करने के लिए कि स्थितियों आदर्श होते हैं । यदि यह सम्मान सीमा में गिर नहीं है, यह प्रयोग फिर से दौड़ना करने के लिए आवश्यक हो जाएगा क्योंकि यह निर्धारित करने के लिए यदि कोई परिवर्तन स्वीकार्य केवल परीक्षण यौगिक के लिए कारण हैं असंभव हो जाएगा. यह समान रूप से पहले और के बाद एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत सभी कुओं का निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है आकृति विज्ञान और संदूषण में परिवर्तन के लिए जांच करने के लिए ।
चित्र 1. Cryptococcus neoformansके खिलाफ तीन पेप्टाइड्स के लिए रोधी गतिविधि का मूल्यांकन शोरबा microdilution परख का उपयोग कर । कवक एकाग्रता 1 x 104 कोशिकाओं/ तीन पेप्टाइड्स का परीक्षण किया गया (AMP1, स्तंभ 1 से 3; AMP2, कॉलम 5 से 7; AMP3, कॉलम 8 से 10) १०० µ एम (पंक्ति A) से लेकर ०.७८ µ मीटर (row H) तक सांद्रता के साथ । वृद्धि नियंत्रण और रिक्त स्तंभ 11 और 12, क्रमशः में हैं । छवि एक डिजिटल कैमरे के साथ ४८ मशीन के एच के बाद अधिग्रहीत किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2. Candida albicans के खिलाफ तीन पेप्टाइड्स के लिए रोधी गतिविधि का मूल्यांकन शोरबा microdilution परख का उपयोग कर । कवक एकाग्रता 2 x 103 कोशिकाओं/ तीन पेप्टाइड्स का परीक्षण किया गया (AMP1, स्तंभ 1 से 3; AMP2, कॉलम 4 से 6; AMP3, कॉलम 7 से 9) १०० µ एम (पंक्ति A) से लेकर ०.७८ µ मीटर (row H) तक सांद्रता के साथ । विकास नियंत्रण और कोरा परख में शामिल थे, लेकिन तस्वीर में दिखाई नहीं देते । छवि एक डिजिटल कैमरे के साथ ४८ मशीन के एच के बाद अधिग्रहीत किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
के रूप में चित्रा 1 और चित्रा 2में कहा गया, ४८ ज पर्याप्त समय के लिए दोनों सी. neoformans और सी. albicansके लिए नेत्रहीन सकारात्मक और नकारात्मक कुओं भेद है । उल्लेखनीय है कि सी. neoformans के लिए परिणाम २४ एच को संशोधनों के बिना CSLI दिशानिर्देशों के तहत पहले प्राप्त किए गए थे. प्रत्येक तपसिल के लिए, सकारात्मक और नकारात्मक अच्छी तरह से, और इसलिए प्रत्येक यौगिक के लिए MIC, आसानी से प्रत्यक्ष कर रहे हैं. यह कई यौगिकों के लिए तेजी से MIC दृढ़ संकल्प के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जो अणुओं आगे जांच योग्यता चुनने के लिए अनुमति देता है । इस बीच, चित्रा 3 एक उदाहरण एक गरीब परिणाम है, कमजोर पड़ने के दौरान अनुचित pipetting से होने की संभावना कदम । यह स्तंभ 5, पंक्ति c, में देखा जा सकता है जहां C. neoformans वृद्धि में अंतर प्रतिकृति (स्तंभ 5-7) में मौजूद है ।
चित्र 3. तकनीकी में एक त्रुटि का उदाहरण एक धारावाहिक कमजोर पड़ने परख में प्रतिकृति । छवि १०० µ एम (पंक्ति a) से ०.७८ µ m (पंक्ति एच) को लेकर AMPs के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने से पता चलता है. अंतर C. neoformans वृद्धि में प्रतिकृतियां के बीच मौजूद है स्तंभ 5-7, पंक्ति C, सबसे अधिक संभावना कमजोर पड़ने की तैयारी के दौरान pipetting त्रुटि के कारण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
प्लेटों की व्याख्या के लिए के रूप में, चित्रा 1 में सी. neoformansके खिलाफ तीन अलग AMPs, AMP1 के लिए कॉलम 1-3 पर स्थित के लिए एक रोधी परख है, AMP2 के लिए कॉलम 5-7, और स्तंभों 8-10 सांद्रता के साथ AMP3 के लिए १०० µ से अलग एम (पंक्ति A) से ०.७८ µ मी (row H). ऋणात्मक/वृद्धि नियंत्रण स्तंभ 11, पंक्तियां a से c में रखा गया था, जबकि रिक्त नियंत्रण स्तंभ 12, पंक्ति a से c में रखा गया था । AMP1 के लिए (स्तंभ 1-3, पंक्तियाँ a-C) और AMP2 (स्तंभ 5-7, पंक्तियाँ a-D), ध्यान दें कि एक उच्च एकाग्रता पर मीडिया पारदर्शी है और कोई दृश्यमान वृद्धि है । इसके विपरीत, कम सांद्रता कुओं पर अपारदर्शी (कॉलम 1-3, पंक्तियों डी एच और कॉलम 5-7, पंक्तियों ई एच) हैं । इसलिए, पंक्ति C AMP1 के लिए mic शामिल करने के लिए माना जाता है, जबकि AMP2 के लिए mic पंक्ति डी में है, कि कहने के लिए है, 25 µ एम और १२.५ µ एम, क्रमशः. AMP3 का पुनः मूल्यांकन करना होगा, क्योंकि कवक का परीक्षण सभी सांद्रता में हुआ । AMP3 के लिए पुनर्परीक्षा के कारण निर्धारित करने के लिए आवश्यक है, जो हो सकता है कि परीक्षण मध्यम यौगिक की रोधी गतिविधि के साथ हस्तक्षेप कर रहा है, माइक्रोबियल संक्रमण, या एजेंट परीक्षण करने के लिए कवक के एक उच्च प्रतिरोध. अंतिम संभावना के लिए, यह एकाग्रता रेंज का परीक्षण बढ़ाने के लिए आवश्यक हो जाएगा । के रूप में मनाया, नहीं, संकोच और नियंत्रण कुओं सजातीय हैं, तो वे भी ६०० एनएम पर आयुध डिपो माप द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है ।
चित्रा 2के लिए के रूप में, तीन अलग पेप्टाइड्स सी. albicansके खिलाफ परीक्षण किया गया. AMP1 (कॉलम 1-3), AMP2 (कॉलम 4-6), और AMP3 (कॉलम 7-9) के लिए MICs ५० µ एम, 6 µ एम, और 25 µ एम, क्रमशः थे । C. albicans, मशीन तापमान में रेशा के कारण, नहीं-संकोच और नियंत्रण कुओं में झुरमुट में मनाया जा सकता है, यह मुश्किल पढ़ने के लिए ओडी माप का उपयोग करने के लिए बना ।
कभी, कुओं में कोई वृद्धि नहीं मनाया जाता है । यह मीडिया में एक विष संदूषण के कारण हो सकता है (जिस स्थिति में वृद्धि नियंत्रण भी नहीं विकास दिखा) या एजेंट के लिए एक उच्च संवेदनशीलता (जिस स्थिति में, वृद्धि नियंत्रण वृद्धि दिखा) । तदनुसार, बाद के मामले के लिए, एकाग्रता रेंज में कमी आवश्यक हो सकता है ।
| मध्यम | तैयारी | |
| 2x रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) १६४० मध्यम – ५०० मिलीलीटर | १०.४ g RPMI-१६४० (L के साथ पूरक-glutamine और phenol लाल; बिना बिकारबोनिट) | |
| ३३० मिमी 3-(N-morpholino) प्रोपेन sulfonic अम्ल (MOPS) | ||
| समायोजित करने के लिए पीएच ७.० के साथ naoh | ||
| निस्पंदन द्वारा बंध्याकरण (०.२२ µ एम फ़िल्टर) | ||
| फास्फेट खारा (पंजाब) | १३७ मिमी NaCl | |
| २.७ मिमी KCl | ||
| 10 मिमी ना2HPO4 | ||
| 2 मिमी KH2पीओ4 | ||
| 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव । | ||
| Sabouraud डेक्सट्रोज शोरबा | ५०० मिलीलीटर में आसुत जल का चूर्ण 15 ग्राम । | |
| NaOH के साथ पीएच ७.० को समायोजित करें | ||
| 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव । | ||
| Sabouraud डेक्सट्रोज आगार | आसुत जल के ५०० मिलीलीटर में पाउडर के ३२.५ ग्राम । | |
| NaOH के साथ पीएच ७.० को समायोजित करें | ||
| 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव । | ||
तालिका 1. मीडिया और एजेंट की तैयारी ।
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Discussion
Microdilution परीक्षण यौगिक की छोटी मात्रा का उपयोग कर एक लक्ष्य यौगिक की संभावित रोधी गतिविधि का विश्लेषण कर सकते हैं, और एक ही समय में यह सांद्रता की एक श्रेणी में परीक्षण. तदनुसार, इस प्रोटोकॉल संभावित नए रोधी यौगिकों के लिए स्क्रीनिंग में एक पहला कदम के रूप में सिफारिश की है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल M27-A3 प्रोटोकॉल पर आधारित है, शुरू में क्लीनिक में रोधी चिकित्सा के चयन में सहायता के लिए डिज़ाइन किया गया है, और नए रोधी यौगिकों की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल को निकालने या यौगिक की भौतिक सुविधाओं पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, परख में एक संभावित उंमीदवार झूठा प्रकट हो सकता है अप्रभावी क्योंकि मीडिया में एक यौगिक कवक सेल के साथ अपनी बातचीत ब्लॉक कर सकते हैं, जैसे Histatin पर RPMI के प्रभाव के रूप में 514। इस मामले में, जब RPMI हस्तक्षेप के लिए एक वैकल्पिक माध्यम है, खमीर नाइट्रोजन आधार (YNB) बफर के साथ MOPS पीएच 715।
प्रोटोकॉल भी पूर्व में संशोधनों की अनुमति देता है विकास की स्थिति, इनोक्युलम एकाग्रता, मशीन तापमान, और प्रकाश के प्रति संवेदनशील घटकों के लिए, के रूप में लंबे समय के रूप में संदर्भ रोधी परिणाम दिशानिर्देश रेंज के भीतर हैं । संदर्भ रोधी परीक्षण कवक प्रजातियों के लिए वर्तमान चिकित्सा पर आधारित होना चाहिए । इसके अतिरिक्त, अगर वहाँ एक संदर्भ यौगिक है कि प्रकृति में संभावित दवा के लिए समान है- उदा., परीक्षण किया फंगल मॉडल के खिलाफ रोधी गतिविधि के साथ एक ज्ञात रोगाणुरोधी पेप्टाइड-यह एक अधिक संदर्भ नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
पूर्व विकास की स्थिति कवक और अनुसंधान की जरूरत के अनुरूप बदला जा सकता है । प्रोटोकॉल में के रूप में, c. neoformans और c. albicans बेहतर प्रचार के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर उगाया गया । फिर भी, इस तापमान कवक चयापचय के आधार पर बदला जा सकता है: उदाहरण के लिए, Paracoccidioides brasiliensis अपने खमीर रूप बनाए रखने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर वृद्धि की आवश्यकता है, और इसकी धीमी दोहराव दर के कारण, के लिए 5-7 दिनों के लिए उगाया जा करने की आवश्यकता है । इसलिए, यह एक संभावित नई दवा के परीक्षण के लिए कवक विशेषताओं को समझने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, उंर और इस्तेमाल की कोशिकाओं के विकास के चरण प्रत्येक अध्ययन के उद्देश्य के अनुसार परिभाषित किया जाना चाहिए और सबसे महत्वपूर्ण बात, प्रारंभिक मशीन समय पहले से स्थापित किया जाना चाहिए और सभी परीक्षणों में बनाए रखा reproducibility सुनिश्चित करने के लिए .
समान रूप से, यदि यौगिक/निकालने, संदर्भ रोधी, या मंदक प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, कदम इस तरह कम प्रकाश के साथ काम करने के रूप में अपनी गिरावट को रोकने के लिए जोड़ा जाना चाहिए, पंनी के साथ प्लेटों को कवर, या एक अंधेरे चैंबर में प्लेटें रखने के दौरान गर्मी बार ।
इसके अलावा, किनारे प्रभाव और वाष्पीकरण खाली कुओं में पानी की अतिरिक्त के साथ कम किया जा सकता है, बाहरी कुओं का उपयोग नहीं करके और उन्हें पानी के साथ भरने, या एक आर्द्र कक्ष में थाली रखकर.
मुख्य सीमाओं में से एक जब इस विधि का उपयोग कर एक परीक्षण यौगिक के निरोधात्मक गतिविधि पर ध्यान केंद्रित है, के रूप में कवकनाशी या fungistatic प्रभाव के बीच भेद करने का विरोध किया । फिर भी, के रूप में उद्देश्य संभावित नए रोधी के एक तेजी से स्क्रीनिंग है, एक स्पष्ट सकारात्मक (' स्पष्ट/गैर ' turbidity कुओं) और एक नकारात्मक (' turbidity वेल्स) परिणाम के साथ प्रारंभिक दृश्य आकलन MIC, मदद करता है अध्ययन करने के लिए ब्याज की यौगिकों की पहचान इसके अलावा, और इसलिए नए यौगिकों के लिए स्क्रीनिंग की कुल लागत को कम करने ।
इन नए यौगिकों की कार्रवाई के तंत्र के बाद से अज्ञात है, इस एक ही प्रोटोकॉल यौगिक की क्षमता को बाधित करने के लिए या कुछ अतिरिक्त कदम जोड़कर कवक कोशिकाओं को मारने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस तरह के सकारात्मक कुओं चढ़ाना या लाइव/मृत रंगों का उपयोग कर के रूप में. अंय मामूली संशोधनों के लिए एक चेकरबोर्ड अनुमापन परख के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए अंय दवाओं के साथ यौगिक के किसी भी synergistic प्रभाव की पहचान जोड़ा जा सकता है ।
हालांकि परख पढ़ने आमतौर पर विभिंन स्थितियों के तहत कवक विकास के दृश्य विश्लेषण द्वारा किया जाता है अच्छी तरह से कोई रोधी एजेंट (नकारात्मक/विकास नियंत्रण) के साथ में वृद्धि की तुलना में, यह भी ६०० एनएम पर अपने आयुध डिपो को मापने के द्वारा किया जा सकता है । हालांकि, हालांकि आयुध डिपो माप समरूप समाधान के लिए सही है, कुछ कवक इस प्रकार विधि की शुद्धता को तोड़ने के झुरमुट में बढ़ने- उदा, Candida एसपीपी. के रूप में मशीनीकरण अवधि के दौरान रेशा के परिणामस्वरूप ।
दूसरी ओर, CLSI M27-A3 दिशानिर्देशों की तुलना में यहां वर्णित प्रोटोकॉल के प्रमुख लाभों में से एक, यह है कि यह गैर-किण्वित कवक के लिए मीडिया के वातन खाते में लेता है, जैसे C. neoformans. इसके अलावा, CLSI दिशानिर्देश केवल एक छोटे से प्रारंभिक इनोक्युलम का उपयोग करता है, इस प्रकार कवक विकास और MIC परिभाषा के लिए मशीन की विस्तारित अवधि की आवश्यकता होती है । कुछ अध्ययनों से प्रदर्शन किया है कि उच्च प्रथमाक्षर inoculums और गर्मी के दौरान थाली मिलाते हुए MIC निर्धारण16,17पर महत्वपूर्ण प्रभाव के बिना रोधी संवेदनशीलता परीक्षणों में सुधार. हमारे प्रोटोकॉल ठीक एक छोटा मशीन अवधि में, ४८ एच के भीतर, ७२ एच की तुलना में CLSI दिशा निर्देशों द्वारा सुझाए गए नए यौगिकों के लिए सी. neoformans के खिलाफ MIC निर्धारित कर सकते हैं.
एक और लाभ यह है कि हमारे प्रोटोकॉल के बजाय २०० µ एल के एक १०० µ एल अंतिम मात्रा का उपयोग करता है CLSI दिशा निर्देशों द्वारा सिफारिश की, इस प्रकार परीक्षण नई रोधी परख के लिए आवश्यक यौगिक की राशि को कम करने । हालांकि, बाहरी कुओं के वाष्पीकरण एक चिंता का विषय हो सकता है, लेकिन पहले से ही इस खंड में वर्णित समाधान वाष्पीकरण को कम करने के लिए परख परिणामों से समझौता किए बिना इस्तेमाल किया जा सकता है ।
इसके अतिरिक्त, सीधे प्लेट में कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करके, और इस तरह CLSI कमजोर पड़ने के दिशा निर्देशों को दरकिनार microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग करने के लिए, मल्टीचैनल पिपेट इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल असेंबली CLSI दिशा निर्देशों में से एक से कम जटिल है, और भी कम सामग्री का उपयोग करता है ।
फंगल सेल की तैयारी से संबंधित एक महत्वपूर्ण कदम है कि कोशिकाओं के रूप में संभव के रूप में ताजा कर रहे हैं का उपयोग है । यह भी एक ही विकास के चरण में कोशिकाओं के साथ सभी परख प्रदर्शन महत्वपूर्ण है, के बाद से वहां रोधी संवेदनशीलता में अंतर के बारे में साहित्य में कई रिपोर्टों जब संस्कृति उंर18,19है । संदर्भ उपभेदों के एक सावधान चयन भी आवश्यक है । एक बहुत ही संवेदनशील या शायद ही कभी अलग प्रजातियों रोधी क्षमता का एक स्पष्ट चित्र का उत्पादन नहीं हो सकता है । एक ही टोकन के द्वारा, यह उप-संवर्धन चरणों से बचने के लिए के रूप में परख के लिए कई चर जोड़ने के लिए उपयोगी है । उदाहरण के लिए, Candida उपभेदों के लिए (जो तेजी से बढ़ने), हम इनोक्युलम सीधे तरल मीडिया में बनाने के द्वारा आगर प्लेट कदम बाईपास पसंद करते हैं ।
याद रखें कि परीक्षण किया जा करने के लिए निकालने या यौगिक की भौतिक सुविधाओं पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. उदाहरण के लिए, यदि निकालने या यौगिक पानी के अलावा अंय सॉल्वैंट्स में भंग करने की जरूरत है, एक उपयुक्त कवक विकास नियंत्रण है कि अकेले कवक के साथ ही विलायक एकाग्रता भी शामिल है सुनिश्चित करना चाहिए । यह गारंटी है कि किसी भी विकास निषेध मनाया के बजाय परीक्षण यौगिक या निकालने के विलायक के कारण नहीं है । इस मामले में, यह CLSI-M27A3 सिफारिशों का पालन करने के लिए बेहतर हो सकता है DMSO पतला रोधी दवाओं, इस तरह के एक एकाग्रता में दवा भंग करने के रूप में सबसे अधिक परीक्षण एकाग्रता से अधिक से अधिक १०० बार में विलायक के प्रतिशत को कम करने के लिए प्लेट.
स्थिरता के बारे में, यह विश्लेषित अर्क या यौगिकों के छोटे aliquots रखने के लिए सिफारिश की है । उचित तापमान पर एक एकल परख के लिए आवश्यक मात्रा भंडारण करके, aliquot के अत्यधिक हेरफेर और, यदि अर्क या यौगिकों जमे हुए संग्रहीत कर रहे हैं, फ्रीज-गल चक्र से बचा जा सकता है ।
अंत में, सबसे बुनियादी कदमों में से एक microplate धारावाहिक कमजोर पड़ने की सटीकता है, यह देखते हुए कि किसी भी pipetting त्रुटि लगातार कमजोर पड़ने के साथ प्रचारित किया जाएगा । इसके बाद, पिपेट सटीक और उचित pipetting तकनीक reproducibility सुनिश्चित करने के लिए सर्वोपरि हैं । इसलिए, यह नपे पिपेट का उपयोग करने के लिए आवश्यक है और हमेशा अगर मात्रा जोड़ा और एक अच्छी तरह से हटाया सही है की जाँच करें । सुनिश्चित करें कि दवा से अवशेष या vestige पिपेट टिप में नहीं रहता है । यदि यौगिक टिप करने के लिए छड़ी करने के लिए जाता है, यह कमजोर पड़ने के बीच सुझावों स्विच करने के लिए बेहतर हो सकता है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम CAPES का शुक्र है-ब्राजील, CNPq-ब्राजील, FAP/ हम पांडुलिपि के पुनरीक्षण के लिए डॉ ह्यूगो कोस्टा पेस के आभारी हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
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