Summary
Метод microdilution легко и адаптируемая бульон для скрининга противогрибковые соединения и экстрактов.
Abstract
Грибковые инфекции стали важной медицинской состояние в последние десятилетия, однако количество доступных противогрибковых препаратов ограничено. В этом случае необходим поиск новых противогрибковых препаратов. Протокол, сообщили здесь подробно метод для экрана пептиды для их противогрибковые свойства. Он основан на тест восприимчивости microdilution бульон из руководящих принципов клинической и лаборатории Института стандартов (CLSI) M27-A3 с изменениями с учетом исследование антимикробных пептидов как потенциальных новых противогрибковых препаратов. Этот протокол описывает функционального анализа оценить деятельность противогрибковые соединений и могут быть легко изменены в соответствии любого конкретного класса молекул под следствием. Так как анализы выполняются в 96-луночных пластины с помощью небольших объемов, крупномасштабные скрининга может быть завершена в короткий промежуток времени, особенно если осуществляется в обстановке автоматизации. Эта процедура показывает, как стандартизированный и регулируемые клинический протокол может помочь скамейке работа стремлении улучшить терапии грибковых заболеваний новых молекул.
Introduction
Грибковые инфекции стали важной медицинской проблемой в последние десятилетия, значительно увеличив обусловлено главным образом увеличением числа лиц с ослабленным иммунитетом как тех, кто проходит лечение рака и людей, живущих с ВИЧ/СПИДом или пересадки органов1,2. Однако весьма ограниченный спектр доступных противогрибковых препаратов и увеличение числа сообщений о грибковых сопротивление их вклад основных проблем относительно терапии системных микозов3.
Потенциальный источник новых соединений, противогрибковые, антимикробных пептидов (AMPs), малые катионных пептидов, производимые многих организмов как часть их врожденной иммунной реакции на инфекции4. Тем не менее метод скрининга, чтобы проверить эти соединения против грибковых патогенов не нормируется. Различные процедуры были использованы для оценки Противогрибковая активность AMPs, иногда для же модель микроорганизма5,6,7. Эти различия и отсутствие подробной информации в некоторые протоколы осложнить сравнений между соединений и препятствует воспроизводимость.
Одним из способов для стандартизации тестирования новых наркотиков кандидатов является придерживаться руководящих принципов, используемый для определения противогрибковые восприимчивость в клинических условиях, таких как клиническая и лаборатории Института стандартов (CLSI) M27-A3 руководящих принципов. Однако эти испытания противогрибковые чувствительность носят слишком ограничительный характер и не принимать во внимание изменения в метаболизме различных видов, как они были установлены только для нескольких агентов. Например они не принимают во внимание метаболические потребности не брожения дрожжей.
Этот протокол позволяет оценки деятельности перспективных соединений, противогрибковые и реализуется здесь для поиска противогрибковые пептиды. Он основан на тест восприимчивости microdilution бульон из руководящих принципов CLSI M27-A3 с изменениями, которые оптимизируют скрининга новых соединений8,9. Эти изменения позволяют использовать небольшое количество смеси, различия в температуре или первоначальный посевным материалом и различные средства массовой информации для оптимального роста перед тестированием, одновременно стандартизируя результаты с использованием справочных противогрибковые препараты, как элементы управления. Этот метод, с использованием нескольких хорошо культуры пластин, позволяет быстро и надежно экран большое количество соединений.
Из-за присущего гибкости этот протокол может использоваться с различными классами химических соединений и против других микроорганизмов, с несколько адаптаций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. решения и средства массовой информации
- Готовить 2 средних 1640 X Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI)-фосфатный буфер (PBS), бульон декстрозы Sabouraud и Sabouraud декстроза агар согласно таблице 1.
2. грибковые посевным материалом условия роста
- Храните все штаммов микромицетов как замороженные запасы в 35% глицерина при температуре-80 ° C, до тех пор, пока требуется.
- Выполните следующие шаги перед каждой эксперимент.
- Для штаммов Candida albicans :
- Оттепель запасов флакон и передачи 200 мкл до 10 мл бульона декстрозы Sabouraud в стерильных 50 мл трубки из полипропилена с крышкой и культуры на ночь на 30 ° C с агитации (200 об/мин). Не забудьте наклонить трубки и оставьте крышку слегка открытой для улучшения аэрации культуры.
- Для Cryptococcus neoformans штаммы:
- Скрип замороженных поверхности штока флакона. Пластина клетки на Sabouraud декстроза агар пластин и инкубировать в течение 48 часов при температуре 30 ° C. После видимого роста отдельных колоний Держите пластины в холодильнике (4 ° C), запечатанный с парафином фильм на срок до 15 дней.
- Собирать среднего размера изолированной колонии от пластины с помощью стерильных зубочистку или стерильной пересевать цикла и прививать 10 мл бульона декстрозы Sabouraud в стерильных 50 мл Конические трубки. Инкубируйте около 24 ч при 30 ° C при агитации (200 об/мин).
- Не следует превышать 24 ч инкубации. Не забудьте наклонить трубки и оставьте крышку слегка открытой для улучшения аэрации. Это всегда хорошо, чтобы стандартизировать стадии роста клеток перед каждым тестом, поскольку это является одним из важных факторов, влияющих на устойчивость к противомикробным препаратам.
Примечание: Оба грибы росли на 30 ° C для быстрого распространения в наших экспериментах, но температура может быть изменен для отражения целей исследования, например клинического лечения (37 ° C). Самое главное этот первоначальный инкубации время следует заранее создан для каждого грибковых изолировать и поддерживать на протяжении всех тестов, чтобы гарантировать воспроизводимость.
- Для штаммов Candida albicans :
- После микоз собирают клетки центрифугированием конические трубы на 1200 x g 5 мин при комнатной температуре. Отменить супернатант и добавляют 10 мл PBS.
- Ресуспензируйте клетки и центрифуги снова на 1200 x g 5 мин при комнатной температуре.
- Повторите PBS мыть и центрифугирования вдвое больше. После третьей стирки Ресуспензируйте клетки в 5 мл (в зависимости от размера гранул) 2 X RPMI 1640 среды.
- Готовим 1 мл раствора 1: 100 или 1:1,000 разрежения в пробки microcentrifuge (в зависимости от мутности суспензию клеток).
- Аликвота 10 мкл этой разрежения, поместите его в камере Горяева и подсчитать общее число клеток в четырех угловых квадрантах под микроскопом. Рассчитать концентрацию по формуле: (всего ячейки номер/4) x разрежения фактор x 104 (камеры разрежения константа).
- Рассмотрим 100% жизнеспособность, если жизнеспособность графов и роста условия были систематически коррелирует для изолировать изучается.
Примечание: Стандартизации и контроля качества графов жизнеспособность может быть сделано путем обратно покрытие в соответствии с Европейским комитетом по тестирования антимикробной чувствительности (EUCAST) противогрибковые минимум ингибирующее концентрации (MIC) метод для дрожжей10 . - Если не было установлено корреляция роста/жизнеспособности для изоляции под исследования, измерения грибковых жизнеспособности путем подсчета живой клетки в Горяева с помощью красителей, которые выборочно цвета отмерших клеток, таких как phloxine B11, Трипановый синий 12, или Janus зеленый13. Используйте для этого протокола грибковых клеток, только если жизнеспособность населения на данный момент 90% или выше.
Примечание: Dead/жив красители могут не работать хорошо с грибом выбора. Пожалуйста, проверьте их перед использованием. К примеру Трипановый синий краситель не хорошо работать с C. neoformans.
- Рассмотрим 100% жизнеспособность, если жизнеспособность графов и роста условия были систематически коррелирует для изолировать изучается.
- После этого, подготовить клеточных суспензий в 2 X RPMI 1640 средних (2 X настроен посевным материалом в среде RPMI 1640). Для 96-луночных планшетов рассмотреть объем 5 мл для каждой пластины.
- Для всех штаммов C. albicans готовят суспензию акций клеток 4 x 103 клеток/мл. Эта концентрация составляет 2 X концентрации окончательного клеток в каждой скважины (2 x 103 клеток/мл).
- Для штаммов C. neoformans Подготовьте запасов культуры клетки 2 x 104 клеток/мл. Эта концентрация – дважды окончательный клетки концентрация в каждой скважине (1 х 104 клеток/мл).
- Для других грибов тест с известным противогрибковые, какая концентрация будет идеально подходит для конкретного исследования по отношению к время инкубации. Учитывать время метаболизм и дублирования гриба.
3. пептидов (неизвестный агент)
- Хранить лиофилизированный пептидов при-20 ° C и распустить их в деионизированной воде перед каждой эксперимент. Максимальный срок хранения раз растворяемый в воде будет зависеть от характера каждого пептида.
- Подготовьте аликвоты дважды высокая концентрация окончательные испытания в assay (2 X). В идеале Подготовьте небольшое количество аликвоты с достаточно пептидные для одного использования времени избежать циклов замораживания оттаивания.
Примечание: Выбор концентрации должны основываться на свойства пептида и литературе. Рекомендуется начать с около 100 мкм пептида, серийных разведений и затем уменьшить или увеличить этот диапазон концентраций в зависимости от полученных результатов.
4. Справка противогрибковые препараты (позитивные элементы управления)
- Для тех, кто разводят в воде: подготовить 2 X решение высокой концентрации анализа (см. раздел 5: противогрибковая пробирного для разрежения шагов).
- Для штаммов C. albicans приготовляют раствор 128 мкг/мл флуконазола или 128 мкг/мл caspofungin. Концентрация пластины для обоих будет 64 мкг/мл.
- Для штаммов C. neoformans приготовляют раствор 32 мкг/мл амфотерицин B (водорастворимые раствор). Концентрация плита будет 16 мкг/мл.
Примечание: Обычно амфотерицин B разбавляется в диметилсульфоксида (ДМСО), поскольку это противогрибковое, плохо растворим в воде. Однако есть водорастворимый амфотерицин B препараты коммерчески доступных.
- Для противогрибковые препараты, растворяется в органических растворителях: подготовить 100 X Стоковый раствор в ДМСО, а затем разбавляют до 10 X в воде для использования.
Примечание: Таким образом, в колодец, конечная концентрация ДМСО не будет превышать 1%. Ну, где гриб будет расти в средствах массовой информации, содержащей 1% ДМСО, как элемент управления необходим, учитывая, что некоторые грибки не переносят хорошо эта концентрация растворителя. Помните, что ДМСО фоточувствительных, так крышка с фольгой или поместить его в темной камере в течение инкубационного периода.
5. противогрибковые Assay
Примечание: В пробирке противогрибковые анализы выполняются основе теста восприимчивости microdilution бульон из руководящих принципов клинической и лаборатории Института стандартов (CLSI) M27-A3 с некоторыми изменениями.
- Подготовить два раза серийный разбавления каждого пептида и контроля противогрибковые в полистирола 96-луночных планшетов в окончательный объем 50 мкл.
- С помощью пипетки добавить 100 мкл противогрибковые/пептида в 2 X концентрации высоких желаемого конечная концентрация в столбцы в строки 1-3, а.
- С помощью многоканальных дозаторов, 50 мкл стерильной воды в других скважин, в строках B х.
- Удаление 50 мкл скважин с самой высокой концентрацией (ряд А), передать следующей и следующей концентрации (строка B) и гомогенизации.
- Повторите указанные выше шаги до колодца с низкой концентрацией и отменить 50 мкл этой скважины (строка H). Оставьте столбцы 11 и 12 (строки A, B, C) с только воду для пустой элемент управления или отрицательный/роста управления.
- 50 мкл 2 X скорректированного посевным материалом в RPMI 1640 среднего для каждой скважины (колонки 1-3 плюс колонка 11 (отрицательный/роста управления)); конечная концентрация для C. albicans будет 2 x 103 клеток/мл и конечная концентрация для штаммов C. neoformans будет 104 клеток/мл.
- Подготовить пустые элементы (50 мкл воды + 50 мкл 2 X RPMI 1640 среднего без клетки) и отрицательным/роста управления (50 мкл воды + 50 мкл скорректированы посевным материалом 2 X RPMI 1640 среднего без противогрибковый) и нагрузки на знаке хорошо как описано выше.
- Повторите процедуру для каждого соединения для проверки и элемент выбранной противогрибковые (колонки 4-10).
Примечание: Серийных разведений может осуществляться вертикально как эксперимент ниже, или горизонтально на пластине (т.е., если количество разведений данного соединения/экстракт, который нуждается в проверке восемь или более).- Если соединений, ссылка Фоточувствительные наркотиков, или любой из его компонентов, выполнить пробу в снижение света, накладки с фольгой или место в темной камере во время инкубаций.
- Рассмотрим следующие дополнительные рекомендации.
- Печать пластины с четкой накладка, которая позволяет обмен газа, как это помогает уменьшить испарение.
- Поместите пластины в камере влажного; Это также поможет уменьшить испарение.
- Инкубируйте пластины при 37 ° C для 24 h или 48 h для всех штаммов C. albicans и 48 ч с 200 rpm, пожимая для C. neoformans. Нижней Окончательный объем (100 мкл) гарантирует, что не побочное происходит.
Примечание: Было отмечено никакого существенного различия между MIC чтений на 24 ч и 48 h для штаммов C. albicans . Тем не менее чтений на 48 ч легче визуализировать. - Соблюдайте все скважины, при содействии инвертированным оптическим микроскопом, инкубационный период до и после проверки изменений в морфологии, а также проверить наличие признаков загрязнения.
Примечание: Чтений можно сделать визуально и сфотографировали в конце эксперимента. Перед каждой чтении, гомогенизировать слегка пластину. Читает также может выполняться путем измерения своих ОД на 600 Нм, если ячейка сгустки или филаментацию не наблюдалось. - Выполните эксперименты по крайней мере три раза на отдельные даты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MIC определяется как низкая концентрация антимикробной составные, который полностью подавляет видимый рост плесени в конце инкубационного периода. Поскольку цель настоящего Протокола заключается в том, иметь быстрый метод для экрана потенциальных противогрибковые препараты, любой колодец с ясно СМИ похож на пустой скважины считается положительный результат, тогда как любой колодец с мутность аналог отрицательный/роста управления скважин считается отрицательным. Однако если есть интерес к знать, является ли данный AMP фунгистатические или фунгицидное, СМИ от положительных скважин можно также покрытием на Sabouraud агар декстрозы или проверить другое испытание жизнеспособности.
Учитывая, что механизм действия романа составные неизвестна, поэтому важно проверить, если ссылка противогрибковые попадает в ожидаемый диапазон для грибковых изолировать (проверить официальные руководящие принципы, таблицы или данные в литературе) перед проверкой Протестированные MIC для соединения (в данном случае, AMP; На рисунке 1 и 2) для подтверждения, что условия являются идеальными. Если он не попадает в линейке уважаемых, будет необходимо повторно запустить эксперимент, так как это будет невозможно определить, если любые изменения обусловлены исключительно проверенные соединения. Не менее важно соблюдать все скважины под оптический микроскоп до и после инкубационного периода для проверки изменений в морфологии и загрязнения.
Рисунок 1. Оценка противогрибковой активности за три пептиды против Cryptococcus neoformansиспользуя assay microdilution бульон. Гриб концентрация составляет 1 х 104 клеток/мл. Были протестированы три пептидов (AMP1, колонки 1-3; AMP2, столбцы 5-7; AMP3, колонки 8-10) в концентрациях от 100 мкм (ряд А) до 0,78 мкм (строка H). Контроль роста и пустым находятся в колонках 11 и 12, соответственно. Снимок сделан с цифровой камерой после 48 ч инкубации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Оценка противогрибковой активности за три пептиды против Candida albicans , используя assay microdilution бульон. Гриб концентрация находится на 2 x 103 клеток/мл. Были протестированы три пептидов (AMP1, колонки 1-3; AMP2, столбцы 4-6; AMP3, колонки 7-9) в концентрациях от 100 мкм (ряд А) до 0,78 мкм (строка H). Контроль роста и пустым были включены в assay, но не появляются в фотографии. Снимок сделан с цифровой камерой после 48 ч инкубации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Как отмечено на рисунке 1 и на рисунке 2, 48 h является достаточно времени визуально отличать положительные и отрицательные скважин для C. neoformans и C. albicans. Стоит отметить, что результаты для C. neoformans были получены 24 часа раньше, чем под руководящими CSLI без изменений. Для каждого экземплярах, и положительные и отрицательные и, следовательно, микрофон для каждого соединения являются легко различимы. Это позволяет для быстрого определения MIC для нескольких соединений, а также для выбора которой молекулы заслуживают дальнейшего расследования. Тем временем на рисунке 3 приведен пример плохой результат, вероятно, от неправильное дозирование на шаге разведение. Это можно наблюдать в колонке 5, строка C, где разница в росте C. neoformans присутствует через реплицирует (колонки 5-7).
Рисунок 3. Пример ошибки в техническом реплицирует в assay серийный разрежения. Изображение показывает последовательного растворения AMPs, начиная от 100 мкм (ряд А) до 0,78 мкм (строка H). Различия в росте C. neoformans присутствуют между реплицирует в столбцах строки C, 5-7, скорее всего из-за дозирования ошибки во время подготовки разрежения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Что касается толкования пластины на рисунке 1 является противогрибковым assay для трех различных усилителей против C. neoformans, расположенный на колонки 1-3 для AMP1, колонки 5-7 для AMP2 и столбцы 8-10 для AMP3 с концентрациями от 100 мкг M (ряд А) до 0,78 мкм (строка H). Негатив/роста управления был помещен в колонке 11, строки A до C, в то время как пустой элемент управления был помещен в колонке 12, строки A до C. AMP1 (колонки 1-3, ряды A-C) и AMP2 (колонки 5-7, ряды A-D) Обратите внимание, что в более высокой концентрации средств массовой информации полупрозрачные и там является не видимого роста. Напротив, при более низких концентрациях скважин являются непрозрачными (колонки 1-3, строки D-H и столбцы строки 5-7, E-H). Таким образом строка C считается содержать MIC для AMP1, в то время как микрофон для AMP2 находится в строке D, то есть, 25 мкм и 12,5 мкм, соответственно. AMP3 придется провести переоценку, как гриб вырос в всех протестированных концентраций. Повторную экспертизу для AMP3 необходимо определить причину, которая может быть что Испытательная среда конфликтует с Противогрибковая активность соединения, микробного загрязнения, или сопротивление выше гриба к агенту испытания. Последняя возможность будет необходимо увеличить диапазон концентраций испытания. Как заметил, без торможение и контроля скважин являются однородными, поэтому они также могут оцениваться путем измерения ОД на 600 Нм.
Что касается Рисунок 2три различных пептидов были проверены против C. albicans. Микрофоны для AMP1 (колонки 1-3), AMP2 (колонки 4-6) и AMP3 (колонки 7-9) были 50 мкм, 6 мкм и 25 мкм, соответственно. C. albicans, из-за филаментацию в температуры инкубации, можно наблюдать в сгустки в без торможение и контроля скважин, что делает его трудно использовать ОД измерения для чтения.
Иногда не рост наблюдается в скважинах. Это может быть из-за загрязнения токсин в СМИ (в этом случае контроль роста также показывают никакого роста) или более высокая подверженность агента (в этом случае, контроль роста показывают рост). Соответственно в последнем случае, снижение концентрации диапазона могут быть необходимы.
| Средний | Подготовка | |
| 2 средних 1640 X Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI) – 500 мл | 10.4 g RPMI 1640 (дополнено с L-глютамина и фенола Красного; без бикарбонат) | |
| 330 мм 3-(N- Морфолино) пропан перфтороктановой сульфоновой кислоты (швабры) | ||
| Настройка до pH 7.0 с NaOH | ||
| Стерилизуют фильтрацией (0.22 мкм фильтром) | ||
| -Фосфатный буфер (PBS) | 137 мм NaCl | |
| 2,7 мм KCl | ||
| 10 мм Na2HPO4 | ||
| 2 мм х2PO4 | ||
| Автоклаве при температуре 121° C на 15 минут. | ||
| Sabouraud декстрозы бульон | 15 г порошка в 500 мл дистиллированной воды. | |
| Приспособиться к рН 7.0 с NaOH | ||
| Автоклаве при температуре 121° C на 15 минут. | ||
| Sabouraud декстроза агар | 32.5 g порошка в 500 мл дистиллированной воды. | |
| Приспособиться к рН 7.0 с NaOH | ||
| Автоклаве при температуре 121° C на 15 минут. | ||
Таблица 1. Подготовка средств массовой информации и реагентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microdilution тесты могут анализировать потенциальные Противогрибковая активность целевого объекта соединения, с помощью небольших количествах соединения и в то же время протестировать его в диапазоне концентраций. Соответственно этот протокол рекомендуется в качестве первого шага в скрининга для потенциальных новых противогрибковых соединений. Здесь представлены протокол основан на протоколе M27-A3, первоначально предназначенных для помощи в выборе противогрибковой терапии в клиниках и может быть адаптирована к различным новых противогрибковых соединений. В целом этот протокол может сосредоточиться на физико-химических особенностей экстракта или соединения. Например потенциальным кандидатом в assay ложно может показаться неэффективным, потому что соединение в СМИ может блокировать его взаимодействие с грибковых клеток, например эффект RPMI на Histatin 514. В этом случае альтернативный среде для когда RPMI мешает, является дрожжи азота базы (YNB) буфер с рН 7 швабры15.
Протокол также позволяет изменения в условия предварительного роста, посевным материалом концентрации, температуры инкубации и свет чувствительных компонентов, поскольку ссылка противогрибковые результаты находятся в пределах руководящих принципов. Противогрибковые ссылки должны основываться на текущих терапии для протестированных грибковых видов. Кроме того если есть ссылка соединение, которое является по своему характеру аналогичны потенциальных наркотиков – например, известный антимикробного пептида с противогрибковой активностью в отношении протестированных грибковых модели – он должен использоваться как элемент Дополнительные ссылки.
Условия предварительного роста могут быть изменены с учетом грибов и исследовательских потребностей. Как и в протоколе, C. neoformans и C. albicans росли на 30 ° C для лучшего распространения. Тем не менее, эта температура может быть изменен в зависимости от метаболизма грибов: например, Paracoccidioides brasiliensis требует роста при 37 ° C поддерживать свою форму дрожжей и из-за его медленной дублирования курса, необходимо выращивать на 5-7 дней. Таким образом важно, чтобы понять характеристики гриб для тестирования потенциальных новых наркотиков. Кроме того возраста и стадии роста клетки должны быть определены согласно цели каждого исследования и, самое главное, время первоначальный инкубации следует создать заранее и поддерживали на протяжении всех тестов, чтобы гарантировать воспроизводимость .
Аналогичным образом если соединение/экстракт, ссылка противогрибковые или разбавителя чувствительны к свету, следует добавить шаги для предотвращения ее деградации, таких как работа с ограниченной света, охватывающих пластины с фольгой или размещения пластины в темной камере во время Время инкубации.
Кроме того краевого эффекта и испарение может быть уменьшен с добавлением воды в колодцах пустой, не используя внешний скважин и заполнения их с водой, или путем размещения пластины в камере влажный.
Одним из основных ограничений при использовании этого метода является его ориентация на ингибиторная активность испытания комплекса, в отличие от различия между фунгицидное или фунгистатические эффекты. Тем не менее, поскольку целью является быстрый скрининг потенциальных новых противогрибковые первоначальной оценки визуального микрофон с четкий положительный («очистить/не мутность» скважин) и отрицательной («мутность» скважин) результат, помогает определить соединений, представляющих интерес для изучения Кроме того и поэтому сокращение общих расходов скрининга новых соединений.
Поскольку механизм действия этих новых соединений неизвестна, этот протокол может использоваться для определения комплекса способность ингибировать или убить грибковых клеток, добавив несколько дополнительных шагов, например покрытие позитивные скважин или с использованием жить/мертвые красители. Другие незначительные изменения могут быть добавлены для использования протокола для assay титрования шахматной доски для выявления любых синергических эффектов соединения с другими препаратами.
Хотя чтение пробирного обычно выполняется путем визуального анализа грибковые роста в различных условиях, по сравнению с ростом в колодец с противогрибковый агент (отрицательный/роста управления), также это можно сделать путем измерения своих ОД на 600 Нм. Однако хотя измерение ОД является точной для однородных решений, некоторые грибы растут в кусты, таким образом нарушая точность метода – например, Candida spp. в результате филаментацию во время инкубационного периода.
С другой стороны, одним из основных преимуществ протокола, описанные здесь, по сравнению с руководящими принципами CLSI M27-A3, является, что он принимает во внимание аэрации СМИ-бродильные грибки, как C. neoformans. Кроме того в руководящих принципах CLSI использует только небольшой первоначальный посевным материалом, таким образом, требует длительного периода инкубации для роста плесневых грибов и MIC определения. Некоторые исследования показали, что выше Инокулянты инициалы и покачивая пластину во время инкубации улучшить противогрибковые восприимчивость тестов без значительного воздействия на MIC решимость16,17. Наш протокол можно точно определить микрофон для новых соединений против C. neoformans в укороченной инкубационный период, в течение 48 часов, по сравнению с 72 h, предложенные руководящие принципы CLSI.
Еще одним преимуществом является, что наш протокол использует конечный объем 100 мкл вместо 200 мкл, рекомендованный CLSI руководящие принципы, тем самым уменьшая количество испытания нового комплекса необходимых для противогрибковые assay. Однако испарение внешних скважин может быть проблемой, но решения, уже описанные в этом разделе для уменьшения испарения могут быть использованы без ущерба для результатов анализа.
Кроме того путем выполнения разведений непосредственно на пластину и таким образом в обход CLSI разрежения руководящие принципы для использования microcentrifuge трубы, может использоваться многоканальные пипетки. Этот протокол Ассамблея менее сложна, чем в CLSI руководящих принципах, а также использует меньше материалов.
Важным шагом, связанным с подготовкой грибковых клеток является использование клеток, которые являются как свежие, как это возможно. Важно также выполнить все анализы с клетки на том же этапе роста, поскольку есть несколько докладов в литературе о различиях в противогрибковым восприимчивости, когда культура возрастов18,19. Важно также тщательный отбор эталонных штаммов. Очень чувствительной или редко изолированных видов может не дать четкую картину того, противогрибковые потенциал. Точно так же это полезно для избежания югу культивирования шаги о том, не добавить много переменных в assay. Например, для штаммов Candida (которые растут быстрее) мы предпочитаем, чтобы обойти агар пластины шаг, сделав посевным материалом непосредственно в жидких средах.
Помните, что важно учитывать физико-химических особенностей экстракта или составные испытанию. Например если экстракт или соединения нужно быть распущен в растворителях, кроме воды, необходимо убедиться иметь соответствующие микоз управления, включает такой же концентрации растворителя с грибом одиночку. Это гарантирует, что любое замедление роста наблюдается не объясняется растворителя вместо испытания комплекса или извлечь. В этом случае, было бы лучше следовать рекомендациям для ДМСО разбавляют Препараты фунгицидные, например растворения препарата в концентрации по крайней мере в 100 раз выше, чем самая высокая концентрация протестированных сократить процент растворителя в CLSI-M27A3 пластины.
Что касается стабильности рекомендуется держать небольших аликвоты анализируемого экстрактов или соединений. Путем сохранения объема необходимых для одного анализа при соответствующей температуре, чрезмерной манипуляции Алиготе и, если выдержки или соединений хранятся замороженные, можно избежать циклов замораживания оттаивания.
Наконец один из самых основополагающих шагов является точность Гонав серийный разрежения, учитывая, что Погрешность дозирования будет распространяться вдоль подряд разведениях. Отныне Пипетка точность и правильные методы дозирования имеют первостепенное значение для обеспечения воспроизводимости. Таким образом крайне важно использовать калиброванные пипетки и всегда корректна проверить если объем добавляется и удаляется из каждой скважины. Убедитесь, что остатки или след от наркотиков не оставаться в наконечник пипетки. Если соединение имеет тенденцию прилипать к кончику, было бы лучше для переключения советы между разведениях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим накидки-Бразилия, CNPq-Бразилия, FAP/DF для финансовой поддержки. Мы благодарны д-р Уго Коста Паес для пересмотра рукопись.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
- Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
- Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).
- Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
- Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
- CLSI. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2008).
- Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844 (2016).
- The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts, version, 7.3.1 2017. , Available from: http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf (2017).
- Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
- Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
- Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
- Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
- Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
- Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
- Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
- Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
- Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Jr Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).
