Зеленый флуоресцирующий белок Сплит система для визуализации эффекторов доставлены из бактерий во время инфекции
Summary
Флуоресцентный белок подходы к контролировать эффекторы, выделяемая бактериями в клетки хозяина сложной. Это из-за несовместимости между флуоресцентных белков и секреторной системой типа III. Здесь оптимизированный Сплит системы superfolder GFP используется для визуализации эффекторы, выделяемая бактериями в принимающей растительной клетки.
Abstract
Бактерии, один из самых важных возбудителей различных заболеваний растений, выделяют набор эффекторных белков в принимающей растительной клетки для подрыва иммунной системы растений. Во время инфекции цитоплазматических эффекторы, доставляются в цитозоле хоста через тип III секреторной системы (T3SS). После доставки в растительной клетке effector(s) цели конкретных отделении(ях) чтобы модулировать принимающей клеточных процессов для выживания и репликации возбудителя. Хотя там были некоторые исследования на субклеточном локализации эффекторных белков в клетки хозяина, чтобы понять их функции в патогенности с помощью флуоресцентных белков, исследование динамики эффекторы, непосредственно впрыскивается от бактерий была сложной из-за несовместимости между T3SS и флуоресцентных белков.
Здесь мы описываем наши последние метод оптимизированный Сплит системы Зеленый флуоресцирующий белок superfolder (sfGFPОПТ) для визуализации локализации эффекторы, доставлено через бактериальный T3SS в клетки-хозяина. SfGFP11 (11й β-стренги sfGFP)-тегами эффекторных выделяется через T3SS может быть собран с определенных органелл целевых sfGFP1-10ОПТ (1-10й β-стренги sfGFP) ведущий флуоресценции выбросов на сайте. Этот протокол предусматривает процедуру для визуализации сигнала флуоресценции восстановленный sfGFP с эффекторных белков от псевдомонас в частности органелл в растениях Arabidopsis и Nicotiana benthamiana .
Introduction
Растения являются сессильных организмов, которые сталкиваются многочисленные вторжения патогенных организмов, включая бактерии, грибки, вирусы, насекомых и нематод на протяжении всего их жизненного цикла. Среди фитопатогенов, грамотрицательных бактериальных патогенов, таких как Pseudomonas spp. и Ralstonia spp., заразить их растений-хозяев, введя через раны или естественных отверстий, например устьиц и Гидатоды1. Успешно колонизировать растений-хозяев, бактериальных патогенов эволюционировали, чтобы разработать целый ряд факторов вирулентности2. Когда бактерии вторгнуться растения-хозяина, они впрыскивают ряда белков вирулентности — известный как эффекторов — непосредственно в клетки растений для содействия их патогенности. Эти эффекторы подавить или модулировать врожденного иммунитета растений и манипулировать принимающей клеточных процессов приведет к бактериальной выживания3.
Патогенных бактерий в основном используют T3SS для доставки эффекторные белки прямо в принимающей ячейки4. T3SS напоминает молекулярной шприц с иглы канал, соединяющий из структуры белка лески через внутренний и наружный бактериальной мембраны для укола принимающей ячейки5. Этот механизм секрецию эффекторные опосредовано T3SS (T3E) хорошо сохраняется в различных грамотрицательных бактериальных патогенов завода, а также человека. Один представитель завода патогенов, P. syringae pv. Помидор DC3000 ККПЧ мутант, который обычно имеет дефектных T3SS, ограничил рост растений, вероятно, из-за неспособности Этот мутант полностью подавить завод иммунитета (путем инъекций эффекторные белки)6. После транслокации в клетки хозяина эффекторов цели различных принимающих белков, которые имеют важное значение для ячейки системы, включая завод обороны ответы, транскрипции гена, смерть клетки, протеасомы, везикул людьми и гормон пути7 , 8 , 9 , 10. Таким образом, отслеживание клеточной локализации эффекторных белков в клетках хост является привлекательной мишенью для понимания их функций в отношении модуляции иммунитета растений.
Большинство исследований локализации T3Es использовали Agrobacterium –опосредованной гиперэкспрессия с большой флуоресценции белков в принимающей завод9. Однако чтобы быть неправильно локализованных или иногда нефункциональных в11,12,13было показано метод гетерологичных выражение генов, которые внедряются в других видов. Кроме того несколько исследований показали, что бактериальных эффекторов пройти модификация для правильной ориентации в принимающей клетки14,,1516,17. Таким образом временно выразил эффекторов в цитозоль клетки не могут быть количественно или функционально идентичен эффекторы, которые поставляются T3SS на возбудителя инфекции18завода. Кроме того слияние больших флуоресцентные метки эффекторные белки могут нарушить надлежащее эффекторных доставки и визуализация18,19. Таким образом эти подходы к assay T3E функция не может в полной мере отражает родной локализация T3SS-выделяется эффекторов.
Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) состоит из 11-мель β-ствол, включающего центральной стренге, которая включает хромофора20. Вальдо и др. сообщил Роман Сплит GFP система, которая состоит из небольшого компонента (GFP β нити 11; GFP11) и большой дополнительный фрагмент (GFP β прядь 1-10; GFP1-10)21. Фрагменты не флуоресцировать сами по себе, но флуоресцировать после их самостоятельной ассоциацией, когда обоих фрагментов находятся в непосредственной близости друг с другом. Для оптимизации эффективности складные белок надежные Складные варианты GFP, т.е., sfGFP и sfGFPОПТ, впоследствии были разработаны для Сплит GFP системы20,21,22. Недавно один аминокислотный мутировал варианты sfGFP1-10ОПТ– sfYFP1-10ОПТ и sfCFP1-10ОПТ– который можно восстановить с sfGFP11 фрагмент и показать желтый и голубой флуоресценцией, соответственно, были созданные23 . Кроме того, sfCherry, производное mCherry, могут быть разделены на фрагменты sfCherry1-10 и sfCherry11 так же, как sfGFP23.
Эта система была адаптирована для метки и отслеживания эффекторов T3SS в клетки HeLa во время инфекции, используя эффекторов сальмонеллы24. Однако он был ранее не оптимизирован для системы завод бактериальных патогенов. Недавно мы оптимизировали GFP Сплит системы, основанные на улучшение sfGFP1-10ОПТ для мониторинга субцеллюлярные локализации T3Es, доставленных из P. syringae в клетки растений25. Для облегчения локализации исследования T3Es в различных внутриклеточных отсеков в клетках растений, набор трансгенных Arabidopsis thaliana растения были созданы выразить sfGFP1-10ОПТ в различных отсеках внутриклеточных 25. Кроме того, плазмиды, перевозящих различные органеллы ориентированных sfGFP1-10ОПТ за Agrobacterium-опосредованной переходных гиперэкспрессия и sfGFP11-тегами векторов для доставки на основе T3SS эффектор были также созданы. Семена различных трансгенных линий Arabidopsis и плазмид выразить T3Es интерес может быть получены из источников, упомянутых в Таблице материалов26,27.
В следующий протокол мы описываем оптимизированные системы для мониторинга динамики эффекторы, поставляемые бактерий в клетки хозяина, с помощью Сплит системы sfGFP. Заражение растений, выражаяОПТ sfGFP1-10 с трансгенных Pseudomonas , перевозящих sfGFP11 рекомбинантных плазмид приводит поставка sfGFP11-тегами эффекторных от Pseudomonas в клетки-хозяина. Следовательно эти белки являются восстановленный и перемещать отделении(ях) целевых конкретных эффекторные. Псевдомонас сиреневый pv. помидор Штамм CUCPB5500, в котором удаляются 18 эффекторы, был использован потому что этот штамм показал низкий или не смерть клетки в s A. thaliana и н. benthamiana28. Однако все материалы и шаги, описанные здесь можно заменить или изменить адаптировать Сплит системы sfGFP для расследования других биологических вопросов или оптимизации в условиях данной лаборатории.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанные здесь используется для мониторинга точной локализации эффекторных белков, вводят бактериальный T3SS в принимающей растительной клетки после инфекции. Ранее, Сплит системы GFP был использован как инструмент для изучения субцеллюлярные локализация млекопитающих белк?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано основные программы исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования (СР 2018R1A2A1A05019892) к DC и гранта от центр молекулярной селекции растений ( ВКПМ) следующего поколения Biogreen 21 программы сельского развития администрации (PJ013201) EP. Мы благодарим изображений центр национального центра инструментария для управления природопользованием для предоставления Конфокальный микроскоп для съемок.
Materials
| Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
| ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
| CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
| sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| Bacterial strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
| Media components | |||
| Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
| Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
| Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
| King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
| Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
| Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
| Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
| Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
| L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
| Confocal microscope equipments/materials | |||
| 710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
| Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP | |
Referenzen
- Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
- Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).
- Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).
- Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
- Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
- Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
- Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).
- Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).
- Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).
- Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137 (2), 283-294 (2009).
- Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8 (3), e1002563 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, &. #. 1. 9. 3. ;. Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59 (2008).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).
- Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854 (2013).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046 (2016).
- Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).
- Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).
- . Addgene Available from: https://www.addgene.org (2018)
- . Arabidopsis Biological Resource Center Available from: https://abrc.osu.edu (2018)
- Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4), e1000388 (2009).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006 (7), (2006).
- Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).
- Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101 (4), 353-363 (2000).
- Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
- Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).
- Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).
