Summary
Nous présentons ici un protocole pour la culture de cellules de glioblastome dérivé de patient dans les biomatériaux orthogonalement accordable conçu pour imiter la matrice de cerveau en trois dimensions. Cette approche fournit une in vitro, une plate-forme expérimentale qui conserve plusieurs caractéristiques de in vivo glioblastoma cellules généralement perdus dans la culture.
Abstract
Glioblastome (GBM) est le plus courant, encore plus meurtrière, le cancer du système nerveux central. Ces dernières années, de nombreuses études ont mis l’accent sur comment la matrice extracellulaire (MEC) de l’environnement de cerveau unique, comme l’acide hyaluronique (HA), facilite l’invasion et la progression de GBM. Toutefois, la plupart des modèles in vitro culture incluent les cellules GBM en dehors du contexte d’un ECM. Xénogreffes murins de cellules GBM sont utilisés couramment aussi bien. Cependant, in vivo modèles rendent difficile d’isoler les contributions des caractéristiques individuelles du microenvironnement tumoral complexe au comportement de la tumeur. Nous décrivons ici une plateforme de base d’hydrogel, en trois dimensions (3D) culture HA qui permet aux chercheurs de modifier indépendamment rigidité et concentration HA. Poids moléculaire élevé HA et polyéthylène glycol (PEG) comprennent des hydrogels, qui sont réticulés par addition de Michael-type en présence de cellules vivantes. Hydrogel 3D cultures dérivées de patient GBM cellules exposition viabilité et prolifération tarifs comme, ou mieux, lorsque cultivées en standard gliomaspheres. Le système hydrogel permet également l’incorporation des peptides ECM-mimétique d’isoler les effets des interactions cellule-ECM spécifique. Les hydrogels sont optiquement transparents afin que les cellules vivantes peuvent être photographiées sur la culture 3D. Enfin, HA hydrogel cultures sont compatibles avec les techniques habituelles pour les analyses moléculaires et cellulaires, y compris les PCR, Western Blot et cryosectioning suivie par immunofluorescence souillant.
Introduction
Systèmes en trois dimensions (3D) culture récapitulent les interactions entre les cellules et leur matrice extracellulaire environnante (ECM) dans les tissus natifs mieux que leurs deux dimensions (2D) homologues1,2. Avancées en génie tissulaire ont donné lieu à des plates-formes de culture sophistiquée, 3D qui permettent une enquête contrôlée 1) Comment chimiques et physiques des composants des comportements cellulaires de matrice microenvironnement affect et 2) l’efficacité de nouvelles thérapeutiques stratégies pour un certain nombre de maladies, y compris les cancers2. Alors que les modèles in vitro ne peuvent tenir compte des facteurs systémiques, telles que les signaux endocriniens et immunitaires et donc ne peut pas remplacer complètement les modèles in vivo , ils offrent plusieurs avantages dont la reproductibilité, contrôle expérimental, abordabilité et vitesse. Nous décrivons ici l’utilisation d’hydrogels cerveau-mimétiques dans lequel 3D des cultures de cellules de tumeur de cerveau dérivée de patient capturent beaucoup d’aspects de la physiologie de la tumeur, en particulier, la dynamique d’acquisition traitement résistance3. Par rapport aux autres méthodes in vitro , ces cultures mieux représentent in vivo les modèles de la tumeur et les observations cliniques3.
Glioblastome (GBM) est le cancer le plus fréquent et mortel originaires dans le cerveau, avec une médiane de survie de seulement 1 à 2 ans4,5. Ces dernières années, de nombreuses études ont porté sur l’influence de l’environnement matriciel tumeur dans GBM6,7,8. L’ECM de cerveau unique a été signalée à affecter la résistance thérapeutique6,7,8,9,10,11 , prolifération et la migration cellulaire GBM , 12. l’acide hyaluronique (HA) est un abondant glycosaminoglycanes (GAG) dans le cerveau, où elle interagit avec les autres GAGs et protéoglycanes pour former un hydrogel-comme maille13. De nombreuses études ont rapporté HA surexpression dans les tumeurs GBM et ses effets subséquents sur cancer progression8,9,13,14,15,16 ,,17. Autres composants ECM affectent également GBM tumeur croissance et invasion6,7,15,18. Par exemple, la fibronectine et la vitronectine, qui sont généralement surexprimés dans GBM, induisent hétérodimérisation des intégrines surface cellulaire en se liant à la séquence « RGD » et lancer des cascades de signalisation complexes qui favorisent la survie de tumeur19 ,20,21. En plus d’influences biochimiques, les propriétés physiques de la matrice de tissus affectent également GBM progression22,23.
Acquisition continuelle de la résistance aux traitements est l’un des principaux moteurs du GBM létalité4. Médicaments, montrant des résultats prometteurs dans des modèles 2D ou gliomasphere n’ont pas réussi dans les études animales et cas cliniques3, indiquant que les effets des facteurs micro-environnementales ont contribué significativement à GBM tumeur réponse1. Alors que les modèles animaux peuvent fournir un 3D, physiologiquement approprié microenvironnement aux cellules de patients initialement et générer des résultats cliniquement pertinents24,25, la complexité du cerveau microenvironnement en vivo rend difficile de déterminer quelles fonctionnalités, y compris les interactions cellule-matrice, sont des résultats biologiques clés spécifiques. Identification de nouvelles cibles thérapeutiques bénéficieront de l’utilisation des plateformes de culture simplifiée dans laquelle sont définies des propriétés biochimiques et biophysiques.
Contrairement aux modèles de biomatériau rapportées antérieurement des GBM tumeur microenvironnement26,27 qui n’ont pas atteint de vrai contrôle orthogonaux sur spécificités biochimiques et physiques de l’ECM, la plate-forme de biomatériau signalés ici permet le découplage des contributions de plusieurs fonctions indépendantes pour phénotype cellulaire GBM. Nous présentons ici un système axée sur les HA, orthogonalement accordable, hydrogel pour 3D culture de cellules dérivées de patient GBM. Hydrogels sont formés à partir de deux composants de polymère : HA 1) biologiquement actif et 2) biologiquement inerte de polyéthylèneglycol (PEG). PEG est un matériau biocompatible et hydrophile utilisé avec adsorption hypoprotidique et immunogénicité minimes28. Ici, environ 5 % des portions acide glucuronique sur les chaînes de HA sont fonctionnalisés avec des groupements thiol pour permettre la réticulation à une 4-bras-cheville commercialement disponible dernière mise à jour maleimides par l’addition de Michael-type. Dans sa forme la plus commune dans le corps, HA existe dans les chaînes de masse moléculaire élevée (HMW). Ici, un faible degré de modification de HMW HA (500-750 kDa) contribue à préserver des interactions natives de HA et ses récepteurs cellulaires, y compris CD4429. En substituant PEG-thiol pour HA-thiol tout en conservant une constante molaire des thiols totales à maléimides, HA concentration peut être dissociée de propriétés mécaniques de l’hydrogel qui en résulte. En outre, stoechiométriques contrôles peuvent être utilisés pour conjuguer la cystéine se terminant par des peptides à un nombre défini de moyens de bras se terminant par maléimide sur chaque 4-bras-cheville. Incorporation des peptides dérivés de ECM, adhésifs permet des interactions avec les intégrines sur des cellules cultivées, à travers lequel des signaux biochimiques et chimiques sont transduits1. Très vite, l’addition de la maléimide-thiol se produit dans des conditions physiologiques, en réduisant au minimum le temps requis pour l’encapsulation de cellules et de maximiser la survie des cellules dérivées de patient. Par ailleurs, cultures hydrogel peuvent être traitées comme spécimen de tissu typique et sont compatibles avec les techniques de caractérisation standard y compris Western Blot, cytométrie en flux et immunofluorescence souillant. Le protocole suivant décrit les procédures de fabrication des hydrogels, établir les cultures de cellules GBM DERIVEES du patient et de techniques d’analyse biochimique 3D.
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Protocol
Tous les tissus humains collection étapes ont été effectuées en vertu de protocoles approuvés sur le plan institutionnel.
1. Thiolation d’acide hyaluronique
Remarque : Rapports molaires sont précisées en ce qui concerne le nombre total de groupes carboxylate, sauf indication contraire.
- À 10 mg/mL dans de l’eau déionisée, distillée (DiH2O) en autoclave stérilisé, erlenmeyer de 250 mL, dissoudre 500 mg de hyaluronate de sodium (HA, 500-750 kDa). Agiter la solution (~ 200 tr/min) à température ambiante pendant 2 heures dissoudre entièrement HA. Utiliser une barre de remuer et plaque d’agitation magnétique pour maintenir la réaction en remuant au cours de la procédure thiolation.
- À l’aide de 0,1 M d’acide chlorhydrique (HCl), ajuster le pH de la solution HA à 5,5. Peser avec 69,6 mg (0,25 x rapport molaire) de 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC).
Remarque : Bien qu’EDC non dissous peut être ajouté directement à la solution HA, il est généralement plus facile à dissoudre EDC tout d’abord dans 1 mL de DiH2O et puis ajouter rapidement la solution d’EDC à la solution HA. Avant dissolution dans 1 mL de DiH2O peut également être fait avec N-hydroxysuccinimide (NHS) et cystamine dihydrocholoride avant d’ajouter à la réaction aux étapes 1.3 et 1.4. - Ajouter 17,9 mg (0,125 x rapport molaire) de NHS pour la réaction. Ajuster le pH de la solution de réaction à 5,5 avec 0,1 M HCl et incuber la réaction à la température ambiante pendant 45 minutes.
- Ajouter 70,0 mg (0,25 x rapport molaire) de dichlorhydrate de cystamine dans la solution de la réaction. 0,1 M d’hydroxyde de sodium (NaOH) permet d’ajuster le pH à 6,25. Incubez la réaction à la température de la pièce pendant la nuit tout en remuant.
- Le jour suivant, utilisez 1 NaOH M pour ajuster le pH de la solution de réaction d’environ 8. Ajouter 192 mg (4 x rapport molaire) de dithiothréitol (DTT) à la réaction. Ajuster le pH à 8 après addition de la TNT et laisser remuer pendant 1 à 2 heures à température ambiante.
- 1 M HCl permet d’ajuster le pH à 4. Transférer le mélange réactionnel ensemble dans la membrane de dialyse préalablement trempées (seuil de poids moléculaire autour de 13 kDa) et de dialyser contre DiH2O préalablement ajusté à pH 4.
Remarque : Le volume du DiH2O pour la dialyse doit être au moins 40 fois le volume de la solution HA réagie (p. ex., 50 mL d’échantillon dans 2 L de DiH2O, pH 4). - Remplacer la solution de dialyse (DiH2O, pH 4) deux fois par jour pendant 3 jours à température ambiante.
- Filtrer la solution dialysée à travers une membrane de 0,22 µm, filtre pilotée par le vide. Flash gel solution de THIOLÉS HA dans l’azote liquide. Utilisez un lyophilisateur pour congeler les échantillons secs sur 2 jours. THIOLÉS HA sous forme sèche peut être conservée dans un dessicateur sous vide à-20 ° C pendant au moins 6 mois.
- Pour déterminer le degré de thiolation, utiliser le test de Ellman et/ou proton NMR spectroscopy30,31.
2. préparation des matériaux de réticulation
- Dissoudre THIOLÉS HA à la concentration désirée (dans cet exemple, 13,3 mg/mL) dans une solution saline tamponnée HEPES (HEPES de 20 mM dans un tampon salin sel équilibrée (HBSS) de Hank ajusté entrent dans un pH de 8-9) dans un flacon ambré pour minimiser l’exposition à la lumière ambiante. Conserver la solution en remuant constamment.
NOTE : Formation des ponts disulfures entre les thiols conjugués à HA peut se produire si le pH est supérieur à 8, concentration de la solution est trop élevée, ou la solution est laissée en brassant pendant trop longtemps avant de gélification. Pour éviter ce problème, utilisez inférieures à 15 mg/mL de THIOLÉS HA et dissoudre THIOLÉS HA dans les 2 heures de formation d’hydrogels. - Dissoudre 4-bras-cheville-maléimide (PEG-Mal, 20 kDa) et 4-bras-cheville-thiol (PEG-thiol, 20 kDa) en tampon phosphate salin (PBS), pH 7.4, à préparer les 50 mg/mL de solutions PEG-Mal et PEG-thiol.
Remarque : Il faut au moins 1 heure pour dissoudre entièrement réactifs PEG. - Si vous ajoutez des peptides dérivés ECM, dissoudre les peptides contenant de cystéine dans du PBS à préparer une solution.
Remarque : Utilisez une concentration stock de 2 à 4 mM. - Caoutchouc de silicone de trempage moule dans de l’éthanol au moins 20 min pour les nettoyer, puis autoclave pour la stérilisation.
3. Hydrogel réticulation et l’Encapsulation de cellules
Remarque : à titre d’exemple, l’encapsulation de quatre personne, 80 µL hydrogels avec 0,5 % (p/v) HA et le module de compression de 1 kPa Voici décrit3. Se reporter au tableau 1 pour les recettes d’exemple qui donnent des hydrogels avec différentes propriétés : deux hydrogels incorporant l’intégrine-liaison peptide RGD et deux hydrogels incorporant des casquettes de cystéine comme témoin négatif pour l’activité de peptide. Concentration de cellules GBM patient issues de semis sont de 500 000 cellules/mL.
- Diluer la solution stock PEG-Mal (50 mg/mL, de l’étape 2.2) à 12,5 mg/mL en ajoutant 40 µL de la solution mère à 120 µL PBS. Diviser la solution diluée en deux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL pour que chaque tube a 80 µL.
- Ajouter 16 µL de solution RGD (2,8 mM, à l’étape 2.3) à un tube de stock et 16 µL de solution stock de cystéine (2,8 mM, à l’étape 2.3) dans le deuxième tube. Vortex pour mélanger. Placer les solutions PEG-Mal-RGD ou PEG-Mal-CYS sur la glace jusqu'à l’utilisation à l’étape 3.9.
Remarque : La procédure décrite ici hydrogels de rendements avec ~ 140 µM de peptide. Cela équivaut à environ 1 sur chaque 8 bras de PEG disponibles sont occupés avec un peptide. Cela peut varier en modifiant le rapport molaire de cystéine se terminant par des peptides aux groupes maléimide disponible. En général, une concentration maximale de 280 µM du peptide est possible tout en laissant un nombre suffisant de groupes maléimide disponibles par réticulation de l’hydrogel. - Diluer la solution mère de PEG-thiol (50 mg/mL, de l’étape 2.2) à 5 mg/mL en mélangeant 4 µL de 50 mg/mL de solution mère à 36 µL de PBS. Ajouter 120 µL de THIOLÉS dissous, HA à l’étape 2.1 au mélange.
Remarque : Les Solutions de HMW HA sont très visqueuses. Ainsi, nous recommandons l’utilisation de pointe de l’échelle-orifice micropipette pour transférer des solutions. Pipette lentement pour éviter la solution de coller aux parois de la pointe d’une micropipette et d’améliorer la précision des mesures. - Placer les moules propres et secs (préparés à l’étape 2.4) dans chaque puits d’une plaque de 12 puits traitée sans culture tissulaire. En utilisant la fin propre et émoussée d’un embout de la pipette, appuyez sur le gel de moule et la double vérification étanchéité entre les moules et le bas de la plaque bien.
Remarque : Vérifiez le joint à nouveau juste avant l’encapsulation pour éviter les fuites. - Passage des cellules cultivées de GBM, se dissocient de cellules individuelles et déterminer la concentration cellulaire comme décrit plus haut3.
Remarque : Certaines lignes GBM ne peuvent être dissociés de cellules individuelles. Dans ce cas, gliomaspheres entier peut être encapsulé. Cependant, préparer monocellules dissociées après comptage de cellules précises pour améliorer la reproductibilité. Le protocole de gliomasphere passage varie selon les différents laboratoires et beaucoup d'entre eux sont probablement compatible avec encapsulation d’hydrogel.- (Recommandé) Centrifugeuse gliomaspheres à 500 g pendant 5 min. Retirez le surnageant et ajouter 1 mL d’enzyme de dissociation cellulaire dans le culot. Puis, incuber pendant 5 min, en tapotant doucement le tube pour agiter.
- Ajouter 4 mL de milieu de culture complet (50 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, 25 µg/mL héparine, G21 supplément et le 1 % pénicilline/streptomycine en DMEM/F12) aux cellules.
- Centrifuger à nouveau à 500 g pendant 5 min et retirer le surnageant. Enfin, resuspendre le culot dans 1 mL de milieu complet et passer la suspension de cellules à travers un tamis de cellule de 70 µm. Lavage (recommandé) la passoire avec une autre 4 mL du milieu complet afin de maximiser le nombre de cellules récupérées.
- Estimation de la concentration des cellules dans la suspension à l’aide d’un hémocytomètre. Diviser la suspension cellulaire en 2 tubes à centrifuger, où chaque tube contient ~ 80 000 cellules. Centrifuger à 500 g pendant 5 min ; en règle générale, 80 000 cellules composeront 2 80 µL hydrogels.
- Retirez le surnageant et remettre en suspension une boulette dans 80 µL de solution de PEG-MAL-RGD et une deuxième boulette dans 80 µL de solution de PEG-MAL-CYS (préparée à l’étape 3.1).
- Utilisant un 200 µL, pointe large-orifice micropipette, administrer 40 µL de solution HA (à partir de l’étape 3.3 ci-dessus) dans chaque moule de silicone de caoutchouc (tel qu’établi à l’étape 3.4).
- En utilisant un 200 µL, pointe large-orifice micropipette, mélanger les 40 µL de PEG-MAL-CYS ou solution cellulaire PEG-MAL-RGD avec la solution HA dans le moule. Pipetter monte et descend rapidement, pas plus de 10 fois. Répétez pour chaque culture de gel en cours d’élaboration.
Remarque : Cette étape prend pratique, étant donné que la gélification initiale se produit rapidement (moins de 30 s). Pipetter en haut et en bas tout en déplaçant la pointe à différents endroits dans des moules pour assurer un mélange même. Gardez toujours la pointe sous le niveau de liquid pour éviter la formation de bulles d’air. Ne mélangez pas la solution trop autant de fois que le gel peut obtenir formé à l’intérieur de la micropipette tip. PEG-MAL-CYS et PEG-MAL-RGD peuvent être combinés à des proportions variables pour obtenir la concentration désirée du peptide RGD. - Placer la plaque du puits contenant les cellules encapsulées gel dans un incubateur de culture cellulaire de 37 ° C pendant 5-10 minutes assurer l’achèvement de la réaction.
- Ajouter 2 à 2,5 mL de milieu de culture dans chaque puits avec des gels formés. Utilisez une solution stérile, pointe de pipette 2 µL ou micro-spatule, séparer délicatement le moule et le gel. Pré-stérilisés forceps permet de retirer le moule de la plaque bien. Placer la plaque bien retour à incubateur de cellules (37 ° C et 5 % CO2) pour la culture et les expériences futures.
Remarque : Tirer le moule verticalement vers le haut pour éviter de nuire à des cultures de gel. En général, moyenne dans les cultures de gel doit être remplacé tous les 3-4 jours. Prendre soin de ne pas pour aspirer les hydrogels lors du retrait moyen. S’il s’agit d’un problème, nous recommandons d’utiliser une pipette en plastique. Si la bioluminescence imaging pour suivre le nombre de cellules est planifiée, cellules GBM doivent être transduites avec lentivirus encodage constitutivement expression luciférase avant encapsulation, comme précédemment décrit3. Pour l’imagerie de la bioluminescence, ajouter 1 mM de D-luciférine de milieu de culture 1 h avant l’imagerie luminescence.
4. lysate préparation pour éponger occidental
- Faites refroidir tubes de microcentrifuge de 1,5 mL sur la glace (1 par échantillons de gel). Cool centrifuger à 4 ° C.
- Retirer les plaques bien moyen. Transfert de gels dans des tubes de microcentrifuge prérefroidies.
- Ajouter 100 µL de tampon RIPA avec des inhibiteurs de protéase/phosphatase 1 x.
- À l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de 20 G, briser le gel en poussant le mélange entier par l’intermédiaire de l’aiguille au moins 20 fois.
- Flash de spin à l’aide de microcentrifuge haut banc et replacez l’échantillon sur la glace.
- Vortex échantillons brièvement toutes les 5 min pour un total de 20 min.
- Centrifuger les échantillons à 14000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
- Transférer le surnageant à tubes de microcentrifuge de nouveau, préalablement réfrigérées et conserver à-20 ° C (courte durée) ou et -80 ° C (long terme). Effectuer l’électrophorèse sur gel à l’aide de procédures standards, comme décrit précédemment3.
5. extraction des cellules individuelles de Cultures d’Hydrogel pour cytométrie en flux
- Supprimer la culture gel médium et transfert (de l’étape 3.11) dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
- Incuber le gel avec 500 µL d’enzyme dissociation cellulaire (p. ex., TrypLE Express) à 37 ° C pendant 5 min, parfois effleurant le tube à agiter.
- Transférer le mélange dans un tube à centrifuger 50 mL à 5 mL de milieu complet. Placer le tube sur la glace.
- Attacher une aiguille de 20G sur une seringue de 10 mL. Tirez doucement la suspension de cellules verticalement à travers l’aiguille 8 fois.
- Traversent le mélange 70 µm crépine de cellule dans un nouveau tube de centrifuger de 50 mL. Appliquer 5 mL de milieu complet supplémentaire à travers la passoire pour recueillir les cellules restantes.
- Centrifuger l’échantillon à 400 g pour 5 min. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans un tampon souhaité pour la cytométrie en flux (à l’aide de protocoles standard3).
6. la cryoconservation des Hydrogels pour le sectionnement
- Retirez moyen du gel des cultures (de l’étape 3.11).
- Incuber les cultures de gel avec 2 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) à 4 ° C durant la nuit.
ATTENTION : PFA est toxique et doit être manipulé avec soin. - Le lendemain, retirer la PFA. Ajouter 2 mL de 5 % de sucrose dans du PBS aux gels et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
- Remplacez 5 % solution sucrée avec 2 mL de 20 % de sucrose dans du PBS et incuber pendant 30 minutes.
- Remplacer une solution de saccharose avec 2 mL de frais 20 % de sucrose dans du PBS et incuber pendant un 30 min supplémentaire.
- Pour la troisième fois, remplacer la solution de saccharose avec 2 mL de frais 20 % de sucrose dans du PBS. Incuber une nuit à 4 ° C.
- Préparer 20 % de sucrose dans composé de température de coupe optimale (OCT).
Remarque : En raison de la viscosité de l’OCT, dissolution du saccharose peut prendre un certain temps (jusqu'à pendant la nuit). Nous vous recommandons de mettre le mélange dans un shaker, verser au cours de la dissolution de maintenir l’agitation. - Le lendemain, enlever la solution de sucrose à 20 % et verser doucement le 20 % de saccharose en solution OCT sur le gel. Assurez-vous de recouvrir le gel entier. Incuber à 4 ° C pendant 3 h.
- Transférer le gel dans le centre d’un enrobage moule à l’aide d’une spatule large et plate ; Cela doit être fait soigneusement pour éviter d’endommager le gel.
- 2-Méthylbutane cool à l’intérieur d’une enceinte avec un excès de glace sèche.
- Remplissez le moule d’encastrement avec OCT pur (sans saccharose). Remplir juste sous le bord supérieur du moule.
- Congeler l’échantillon hydrogel par immersion dans refroidi 2-Méthylbutane et puis passez à la section.
- Section de l’échantillon à l’aide d’un cryostat ; épaisseur de coupe de 10-18 µm et sectionnement de température de-26 ° C est recommandée.
- Exécuter immunostaining standard procédures sur la culture de gel sectionné, comme précédemment décrit3.
NOTE : PFA est connu irritant et cancérigène. Veuillez manipuler et l’éliminer PFA selon les règlements et les normes locales en vigueur.
7. Extraction de l’ARN total des échantillons en Hydrogel
Remarque : Ici, nous décrivons un protocole à l’aide d’un film publicitaire nécessaire (voir la Table des matières) pour extraire l’ARN total d’hydrogel mis en culture des cellules. Les tampons et tous les documents sont disponibles dans le kit utilisé.
- Enlever le milieu de culture. Utiliser une pipette de transfert P1000 avec le bout de l’échelle-alésage pour transférer la culture hydrogel dans tube microtubes de 1,5 mL.
- Ajouter 350 µL de tampon RLT à la culture de l’hydrogel.
- À l’aide d’une aiguille de 20 G, attachée à une seringue de 1 mL, râpez le gel en poussant le mélange entier par l’intermédiaire de l’aiguille au moins 20 fois.
- Transférer le mélange dans une colonne homogénéisateur placée dans un tube de prélèvement de 2 mL. Centrifuger à 13 000 x g pendant 2 min.
- Transvaser le surnageant dans un tube de microcentrifuge propre de 1,5 mL. Veillez à ne pas déranger le précipité de gel au fond.
- Mélanger l’échantillon lysat avec 350 µL d’éthanol à 100 %. Transférer tout l’échantillon dans un endroit de colonne (à partir de la trousse) de spin dans un tube de prélèvement de 2 mL. Centrifuger pendant 1 min à 13 000 x g.
- Pour les étapes suivantes pour la purification de RNA pour PCR, suivre le protocole général fourni par le fabricant du kit.
Remarque : Une fois que l’ARN est extrait, les protocoles normalisés pour l’ACP peuvent être utilisés.
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Representative Results
Pour chaque lot de THIOLÉS HA, le degré de thiolation doit être vérifié à l’aide de la RMN du1H ou test d’un Ellman. HA modification selon la procédure décrite ici constamment génère environ 5 % thiolation (définie comme le rapport molaire des thiols de disaccharides HA) (Figure 1).
Mise en place de cette nouvelle plateforme culture exigera de chaque laboratoire pour effectuer des tests rigoureux afin d’assurer la viabilité de la bonne culture avant la mise en œuvre des expériences à grande échelle. Nos 80 hydrogels µL avec un semis densité 500 000 cellules/mL (40 000 cellules/gel) entraîner constamment des taux de prolifération qui sont comparables, ou mieux, gliomasphere cultures (Figure 2 a-2 C). Comme HA/PEG hydrogels sont optiquement transparents, comportements cellulaires peuvent être observées directement dans les cultures vivantes, 3D à l’aide de la microscopie de fluorescence ou de contraste de phase. Figure 3 a montre que, 4 jours après l’encapsulation, les cellules GBM en hydrogels contenant RGD présentent un phénotype invasif, tandis que les cellules cultivées en hydrogel utilisant PEG-MAL-CYS contrôles ont une morphologie sphérique.
Comme il est typique avec des modèles de xénogreffes où les chercheurs doivent attendre les jours au mois jusqu'à ce que les tumeurs implantés atteint une croissance progressive24,32, cellules dérivées de patient profite de temps pour s’adapter à un nouvel environnement de culture. Ainsi, nous vous recommandons de culture 4-8 jours avant le début des expériences, comme traitement de la toxicomanie, afin d’assurer la plupart des cellules ont entrée dans la phase de croissance exponentielle. Au-delà des traitements médicamenteux, réactifs comme soluble cyclo-RGD, qui competitivement perturbent les interactions cellulaires avec RGD en hydrogels, peuvent être ajoutés au milieu de culture (Figure 3 a).
Notre système d’hydrogel est compatible avec plusieurs méthodes communes pour étudier la biologie de cellules de gliome. À l’aide de l’imagerie bioluminescence, qui est couramment utilisé pour surveiller les tumeurs xénogreffe rongeurs, nombre relatif de cellules viables peut être observé dans les cultures de l’hydrogel au cours du traitement. Figure 3 b donne un exemple de cette méthode, où on a évalué les effets du traitement de l’erlotinib sur cellules GBM hydrogel-cultivées pendant 6 jours. En général, hydrogel cultures peuvent être traitées comme des échantillons de tissus lors de la préparation des lysats de Western blot ou PCR. Analyse par Western blot de la polymérase de clivées poly ADP indique que degré relatif de l’apoptose dans les cellules CD44 knockdown traitées est plus élevé que le type sauvage GBM cellules cultivées dans 0,5 % HA hydrogelsFigure 3) (). De même, des suspensions de cellules du même peuvent être préparées de cultures d’hydrogel pour analyse par cytométrie de flux à l’aide de protocoles standard pour libérer les cellules individuelles de tissus intacts (Figure 2). Outre les fonctions de la cellule, cryosections des cultures de base d’hydrogel, 3D préserver ECM déposé par les cellules cultivées. Par exemple, patrons des dépôts de type changement de collagène IV par erlotinib traitement des cultures hydrogel (Figure 3D).
Figure 1 : Représentant H 1 Spectre de RMN du - de l’acide hyaluronique THIOLÉS. Pics intégrées indiquent qu’environ 5 % des groupes acides glucuronique de HA ont été modifiés avec un thiol. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : La prolifération des cellules encapsulées hydrogel. A) images d’exemple de gels µL 80 fabriqués en plaques de 12 puits. Après réticulation, hydrogels étaient enflés dans un milieu de culture cellulaire. B) résultats représentatifs de la vitesse de prolifération mesurée par cytométrie en flux. Cellules GBM (HK301) ont été incubées avec 1 µM EdU (5-éthynyl-2′-déoxyuridine) pendant 2,5 heures le quatrième jour après l’encapsulation ou de passage. Une clic-réaction a été utilisée pour conjuguer colorant fluorescent à EdU incorporé, comme détaillé dans Xiao et al. 2017.3 témoins négatifs, où aucun EdU a été ajouté aux cultures, ont été inclus. C) représentant des images de microscopie confocale de vivent (vert) et les cellules de morts (rouge) 24 heures après que l’hydrogel de cultures de cellules GBM (HK157) ont été établies. Barreaux de l’échelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Caractérisation. A) images contraste de phase représentatif de 0,5 % (p/v) HA cultivées en hydrogel cellules sous différentes conditions pour 8 jours après l’encapsulation. Les flèches indiquent les cellules avec une morphologie envahissante. B) les images représentatives du signal de bioluminescence mesurée après 15 jours de traitement avec 1 µM erlotinib ou véhicule (DMSO). 1 mM D-luciférine a été ajouté au milieu de culture cellulaire 1 h avant l’imagerie. Les cellules étaient transduites avec lentivirus codant pour l’expression constitutive de la luciférase firefly avant encapsulation. C) représentant immunitaire-blot images analyse clivé poly ADP polymérase (cl-PARP) expression en cellules GBM (HK301) cultivée dans les hydrogels avec 0,5 % (p/v) HA et 1 module de compression kPa. Recadrée toutes les images présentées proviennent de la même tache. D) représentant coloration de collagène IV (vert) et Hoechst 33342 (bleu) dans les cellules cultivées en hydrogel de HK301 12 jours après le traitement avec 1 µm erlotinib ou véhicule (DMSO). Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Type gel | Partie A (40 µL chaque) | Partie B (40 µL de chaque) | ||||
| 4Arm-PEG-MAL (50mg/mL) | Cystéine ou RGD (2,81 mM) | PBS (pH 7,4) | 4Arm-PEG-thiol (50mg/mL) | PBS (pH 7,4) | HA-S (13,3 mg/mL) | |
| 0,5 % (p/v) HA 1kPa | 10 ΜL | 4,00 ΜL | 26 ΜL | 1,00 ΜL | 9,00 ΜL | 30,0 ΜL |
| 0,5 % (p/v) HA 2kPa | 20,0 ΜL | 4,00 ΜL | 16,0 ΜL | 8,00 ΜL | 2,00 ΜL | 30,0 ΜL |
| 1kPa HA de 0,1 % (p/v) | 10 ΜL | 4,00 ΜL | 26 ΜL | 8,00 ΜL | 26,0 ΜL | 6,00 ΜL |
Le tableau 1. Ce qui donne un contrôle indépendant de la concentration de HA et les propriétés mécaniques des formulations hydrogel.
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Discussion
Génération de données reproductibles à l’aide de ce système de culture 3D nécessite : 1) conforme au lot thiolation de HA, 2) pratique pour atteindre efficace de mélange de précurseurs de l’hydrogel et de manipulation d’hydrogel pour éviter d’endommager les cultures et 3) optimisé ensemencement densité pour chaque lignée cellulaire utilisée.
Lorsqu’un pourcentage d’un poids particulier de HA est souhaitable dans l’hydrogel, le degré de thiolation d’HA détermine la densité de réticulation. Nous recommandons d’utiliser un montant régulier de HA pour chaque réaction thiolation pour réduire au minimum la variation de lot. Nous suggérons qu’au moins 300 mg de HA être utilisée pour chaque réaction thiolation afin que le même lot de THIOLÉS HA peut être utilisé pour plusieurs répétitions expérimentales. Le rapport molaire des thiols maléimide groupes sur 4 bras PEG devrait être toujours être 1.1:1 pour assurer une efficacité maximale de réticulation. Ainsi, si le degré de thiolation est modifié, alors le montant de PEG-Mal ajouté doit être ajusté en conséquence. Lorsque les peptides sont conjugués au maléimides avant la formation du gel, le nombre estimé de PEG bras avec des peptides attachés doit être soustraite au nombre total de maleimides disponible pour ce calcul. En outre, nous vous recommandons de garder le degré de HA thiolation inférieure à 10-15 % pour éviter la formation de la liaison disulfure qui empêche la dissolution et la gélification cohérente.
La réaction d’addition de Michael-type entre groupes thiol et maléimide assure que cette gélification se produit dans moins d’une minute. Alors que cette gélification rapide réduit la quantité de temps suspendus en hydrogel précurseurs des cellules sont sans milieu complet, ce qui pourrait compromettre leur viabilité, le processus d’encapsulation nécessite une certaine expérience avec tous de pipetage et de mélange pour réaliser résultats reproductibles. En règle générale, nous avons nouveaux stagiaires pratiquent plusieurs séries de gélification sans cellules avant de procéder à des expériences de « vrai » encapsulation.
Deux facteurs peuvent être tordus pour moduler la vitesse de gélification : pH température et précurseur de réaction. Abaissement de la température de réaction en plaçant la plaque bien sur la glace tout en mélangeant ralentit la réaction et prévoit davantage de temps pour mélanger précurseur de solutions. Toutefois, cela doit être fait dans des conditions stériles à l’aide de techniques aseptiques appropriées. De même, le pH de solutions de précurseurs peut être modifié pour augmenter ou diminuer le temps de réaction à des pH supérieur ou inférieur, respectivement. Puisque THIOLÉS HA est dialysé contre eau acide pour empêcher la formation de la liaison disulfure, reconstitué THIOLÉS HA produira des pH plus bas que prévu dans le cas contraire. En général, reconstitution en 20 mM HEPES dans un tampon HBSS ajusté à pH 9, permettra d’obtenir un pH près quand 7 15 mg/mL de THIOLÉS HA (~ 5 % THIOLÉS) est dissoute. Nous vous recommandons d’utiliser pH 6,8-7 THIOLÉS HA solution pour permettre le même mélange de solution de gel tout en maximisant la cellule santé.
L’ensemencement de densité au cours de l’encapsulation est critique pour la viabilité cellulaire et de la reproductibilité expérimentale. Nous vous recommandons l’ensemencement de l’ordre de 100 000 à 2 000 000 cellules/mL. Nous avons trouvé que cette plage est optimale pour la viabilité de la plupart des types de cellules tout en empêchant les over-confluence dans un laps de temps expérimental d’au moins 3 semaines. La densité de semis initiale qui optimise la viabilité doit être déterminée expérimentalement pour chaque type de cellule.
Extrême il faut lorsque vous changez le milieu cellulaire afin d’éviter d’endommager hydrogel cultures. En particulier, prendre soin de ne pas pour aspirer hydrogel dans la pipette. Donc, ne pas utiliser l’aspiration intra-utérine et plutôt utiliser une pipette stérile pour aspirer manuellement. Changer seulement la moitié du milieu dans une culture bien à la fois peut également aider.
En général, cette technique nécessite pratique pour atteindre la dextérité nécessaire et la cohérence. Une fois établi un protocole de laboratoire spécifique, le système de culture 3D permet au chercheur d’utiliser plusieurs méthodes de caractérisation qui est typique pour culture de cellules et de tissus explantés. Ici, nous avons décrit plusieurs techniques d’analyse, y compris l’immunofluorescence, cytométrie en flux, éponger occidental et l’imagerie de la bioluminescence des cultures vivantes, 3D (Figure 2-3). Pour les protocoles plus détaillées des méthodes de caractérisation, s’il vous plaît voir Xiao et al 20173. Enfin, comme HA/PEG hydrogels sont optiquement transparents, des techniques de microscopie optique standard, y compris l’imagerie confocale, peuvent servir à surveiller les cultures vivantes, 3D.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu financée par les NIH (R21NS093199) et prix de l’ARC de l’UCLA 3R. Nos remerciements vont au laboratoire du Dr Harley Kornblum pour la fourniture des lignées de cellules HK301 et HK157. Nous remercions également UCLA tissu pathologie Core laboratoire (TPCL) cryosectioning, laboratoire central de Advanced Light microscopie/spectroscopie (ALMS) dans California Nanosystems Institute (CNSI) à UCLA pour une utilisation de la microscopie confocale, UCLA Crump Institute for Imagerie moléculaire pour l’utilisation de système d’imagerie IVIS, UCLA moléculaire Instrumentation Center (MIC) pour prévoyant la fourniture d’instrumentation pour l’écoulement de spectroscopie par résonance magnétique et écoulement Cytometry Core dans Jonsson complets Cancer Center (CMCD) à l’UCLA cytométrie en flux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
References
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