Summary
Her presenterer vi en protokoll for tredimensjonale kultur av pasient-avledede glioblastom celler i ortogonalt tunable biologisk materiale designet for å etterligne brain matrix. Denne tilnærmingen gir en i vitro, eksperimentelle plattform som opprettholder mange egenskaper i vivo glioblastom celler vanligvis mistet i kultur.
Abstract
Glioblastom (GBM) er den vanligste, men mest dødelige, sentralnervesystemet kreften. De siste årene, har mange studier fokusert på hvordan den ekstracellulære matrisen (EFM) av unike hjernen miljøet, for eksempel hyaluronic syre (HA), forenkler GBM progresjon og invasjon. Men inkluderer de fleste i vitro kultur modeller GBM celler utenfor rammen av en ECM. Murine xenografts GBM celler brukes ofte også. Men gjør i vivo modeller det vanskelig å isolere bidrag av enkeltfunksjonene i komplekse svulst microenvironment svulst virkemåten. Her beskriver vi en HA hydrogel-basert, tredimensjonale (3D) kultur plattform som tillater forskere å endre uavhengig HA konsentrasjon og stivhet. Høy molekylvekt HA og polyetylenglykol (PEG) utgjør hydrogels, som er krysskoblet via Michael-type tillegg i nærvær av lever celler. 3D hydrogel kulturer av pasient-avledede GBM celler utstillingen levedyktighet og spredning priser så godt som eller bedre enn når kultivert som standard gliomaspheres. Hydrogel systemet kan også innlemmelse av ECM-mimetic peptider å isolere effektene av bestemt celle-ECM interaksjoner. Hydrogels er optisk gjennomsiktig slik at levende celler kan avbildes i 3D kultur. Endelig er HA hydrogel kulturer kompatibel med standard teknikker for molekylær og cellulær analyser, inkludert PCR, vestlige blotting og og kryosnitt etterfulgt av immunofluorescence flekker.
Introduction
Tredimensjonale (3D) kultur systemer recapitulate interaksjoner mellom celler og deres omkringliggende ekstracellulær matrix (EFM) i eget vev bedre enn deres todimensjonal (2D) kolleger1,2. Fremskritt i vev engineering har gitt sofistikerte, 3D kultur plattformer som gjør kontrollerte undersøkelser i 1) hvordan kjemiske og fysiske komponenter av matrix microenvironment påvirker celle atferd og 2) effekt av nye terapeutiske strategier for en rekke sykdommer, inkludert kreft2. Mens i vitro modeller ikke gjenkjenner systemiske faktorer, for eksempel endokrine og immun-signaler, og dermed kan ikke helt erstatte i vivo modeller, gir de flere fordeler inkludert reproduserbarhet, eksperimentelle kontroll, rimelig og hastighet. Her beskriver vi bruk av hjernen-mimetic hydrogels i hvilken 3D kulturer pasient-avledede svulst cellene fange mange aspekter av svulst fysiologi, spesielt dynamikken for behandling motstand3. Sammenlignet med andre i vitro -metoder, representerer disse kulturene bedre i vivo svulst modeller og kliniske observasjoner3.
Glioblastom (GBM) er den mest hyppig og dødelig kreften opprinnelse i hjernen, med en gjennomsnittlig overlevelse av bare 1-2 år4,5. De siste årene, har mange studier fokusert på påvirkning av svulst matrix miljø i GBM6,7,8. Unik hjernen ECM har blitt rapportert å påvirke GBM celle migrasjon, spredning og terapeutiske motstand6,7,8,9,10,11 , 12. Hyaluronic syre (HA) er en rikelig glycosaminoglycan (GAG) i hjernen, hvor den kommuniserer med andre GAGs og proteoglycans å danne et hydrogel-lignende mesh13. Mange studier har rapportert HA overuttrykte i GBM svulster og dens påfølgende effekter på kreft progresjon8,9,13,14,15,16 ,17. Andre ECM komponenter også påvirke GBM tumor vekst og invasjonen6,7,15,18. For eksempel fibronectin og vitronectin, som er vanligvis overexpressed i GBM, indusere heterodimerization av cellen overflaten integrin reseptorer gjennom binding til "RGD" sekvensen og starte komplekse signalnettverk cascades som fremmer svulst overlevelse19 ,20,21. Foruten biokjemiske påvirkninger påvirke fysiske egenskaper av vev matrix også GBM progresjon22,23.
Kontinuerlig oppkjøpet av motstand mot terapi er en av de viktigste driverne GBM dødelighet4. Narkotika viser lovende resultater i 2D eller gliomasphere modeller har sviktet i påfølgende dyrestudier og kliniske tilfeller3, som angir at effekten av microenvironmental faktorer bidratt betydelig til GBM tumor respons1. Mens dyremodeller kan gi en 3D, fysiologisk passende microenvironment xenografted pasienten celler og generere klinisk relevante resultater24,25, kompleksiteten av hjernen microenvironment i vivo gjør det utfordrende å finne ut hvilke funksjoner, inkludert celle-matrix interaksjoner, er nøkkelen til bestemte biologiske resultater. Identifikasjon av nye terapeutiske mål vil dra nytte av forenklet kultur der biokjemiske og Biofysiske egenskaper er definert.
I motsetning til tidligere rapporterte biomateriale modeller GBM svulst microenvironment26,27 som ikke har oppnådd ekte ortogonale kontroll over enkelte biokjemiske og fysiske funksjonene til ECM, biomateriale plattformen rapporterte her gjør frikopling av bidrag av flere uavhengige funksjoner GBM celle fenotypen. Her presenterer vi et HA-basert, ortogonalt tunable, hydrogel system for 3D kultur pasient-avledede GBM celler. Hydrogels er dannet av to polymerkomponenter: 1) biologisk aktive HA og 2) biologisk inert polyetylenglykol (PEG). PEG er en mye brukt biokompatible og hydrofile materiale med lav protein adsorpsjon og minimal immunogenisitet28. Her er ca 5% av glucuronic syre moieties på HA kjeder functionalized med thiol grupper å aktivere crosslinking til en kommersielt tilgjengelig 4-arm-pinne ble avsluttet med maleimides via Michael-type tillegg. I sin vanligste form i kroppen finnes HA i høy molekylvekt (HMW) kjeder. Her, bidrar en lav grad av endringen av HMW HA (500-750 kDa) til å bevare opprinnelige interaksjoner HA og dens celle reseptorer, inkludert CD4429. Ved å erstatte PEG-thiol for HA-thiol samtidig opprettholde konstant molar forholdet totalt thiols til maleimides, kan HA konsentrasjon være skilt fra mekaniske egenskaper av den resulterende hydrogels. Videre kan stoichiometric kontroller brukes å bøye cystein slutter peptider til en definert gjennomsnittlig antall maleimide-avsluttet armene på hver 4-arm-pinne. Innlemmelse av ECM-avledet, selvklebende peptider kan interaksjon med integrins på kulturperler celler, som biokjemiske og kjemiske signalene er transduced1. Maleimide-thiol tillegg skjer veldig fort under fysiologiske forhold, minimere tiden som kreves for cellen innkapsling og maksimere overlevelse av pasient-avledet celler. Videre hydrogel kulturer kan bli behandlet som vanlig vev prøven og er kompatible med standard karakteristikk teknikker inkludert vestlige blotting, flowcytometri og immunofluorescence flekker. Følgende protokollen beskriver prosedyrene for fabrikasjon hydrogels, etablere 3D kulturer av pasient-avledede GBM celler og teknikker for biokjemiske analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle menneskelig vev samling skritt ble utført under institusjonelt godkjent protokoller.
1. Thiolation hyaluronsyre
Merk: Molar prosenter er oppgitt med hensyn til antall carboxylate grupper med mindre annet er angitt.
- Oppløse 500 mg av natrium mengden (HA, 500-750 kDa) på 10 mg/mL i deionisert, destillert vann (di2O) i en autoklav sterilisert, 250 mL Erlenmeyer kolbe. Rør løsning (~ 200 rpm) i romtemperatur i 2 timer for å fullstendig løse opp HA. Bruk en røre bar og magnetic røre plate for å holde reaksjon røring under thiolation prosedyren.
- Bruke 0.1 M saltsyre (HCl), justere pH av løsningen HA 5.5. Veie ut 69,6 mg (0,25 x molar forholdet) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC).
Merk: Selv om fra ikke EDC kan legges direkte til HA løsning, er det vanligvis enklere å oppløse EDC først i 1 mL av di2O og deretter raskt legge støttet EDC-løsningen å HA løsningen. Før oppløsningen i 1 mL av di2O kan også gjøres med N-hydroxysuccinimide (NHS) og cystamine dihydrocholoride før du legger til reaksjonen i trinn 1.3 og 1.4. - Legge til 17,9 mg (0.125 x molar forholdet) NHS reaksjonen. Justere pH av løsningen reaksjon 5.5 bruker 0.1 M HCl og ruge reaksjonen ved romtemperatur i 45 minutter.
- Legg 70.0 mg (0,25 x molar forholdet) av cystamine dihydrochloride i reaksjon-løsning. Bruk 0.1 M natriumhydroksid (NaOH) å justere pH til 6.25. Inkuber reaksjonen i romtemperatur over natten under omrøring.
- På dagen bruk 1 M NaOH for å justere pH av løsningen reaksjon rundt 8. Legge til 192 mg (4 x molar forholdet) dithiothreitol (DTT) reaksjonen. Justere pH tilbake til 8 etter DTT og la omrøring for 1-2 timer ved romtemperatur.
- Bruk 1 M HCl for å justere pH 4. Overføre hele reaksjonsblandingen til pre-gjennomvåt dialyse membran (molekylvekt cut-off rundt 13 kDa) og dialyze mot di2O pre justert til pH 4.
Merk: Volumet av di2O for dialyse bør være minst 40 ganger volumet av reagert HA løsningen (f.eks 50 mL eksempel 2 l di2O, pH 4). - Erstatte dialyse løsningen (di2O, pH 4) to ganger daglig i 3 dager ved romtemperatur.
- Filtrere dialyzed løsningen gjennom en 0.22 µm membran, vakuum-drevet filter. Flash fryse løsning av thiolated HA i flytende nitrogen. Bruk en lyophilizer for å fryse tørr prøver over 2 dager. Thiolated HA i tørr skjemaet kan lagres i et vakuum-forseglet desiccator på 20 ° C i minst 6 måneder.
- For å avgjøre graden av thiolation, bruk Ellman's test og/eller proton NMR spektroskopi30,31.
2. forberedelse av Crosslinking materialer
- Oppløse thiolated HA på ønsket konsentrasjonen (i denne eksempel 13,3 mg/mL) i HEPES-bufret saltvann (20 mM HEPES i Hanks balansert salt saltvann (HBSS) buffer, tilpasset innenfor en pH på 8-9) i et gult hetteglass å minimere eksponering for omgivelseslys. Holde løsningen omrøring.
Merk: Dannelsen av disulfide obligasjoner mellom thiols likt å HA kan oppstå hvis pH over 8, løsning konsentrasjon er for høyt, eller løsningen er stirring på lenge før gelation. For å unngå dette problemet, bruker under 15 mg/mL av thiolated HA og oppløse thiolated HA innen 2 timer å danne hydrogels. - Oppløsning 4-arm-PEG-maleimide (PEG-Mal, 20 kDa) og 4-arm-PEG-thiol (PEG-thiol, 20 kDa) i fosfat bufret saltvann (PBS), pH 7.4, forberede 50 mg/mL PEG-Mal og PEG-thiol lager løsninger.
Merk: Det tar minst 1 time å oppløse fullt PEG reagenser. - Hvis legger til ECM-avledet peptider, løses cystein inneholder peptider i PBS å forberede en lagerløsning.
Merk: Bruk en lager konsentrasjon av 2-4 mM. - Suge silikongummi muggsopp i etanol minst 20 min å rydde dem og deretter autoklav dem for sterilisering.
3. Hydrogel Crosslinking og celle innkapsling
Merk: som et eksempel her innkapsling av fire individuelle, 80 µL hydrogels med 0,5% (w/v) HA og kompresjons modulus av 1 kPa er beskrevet3. Se tabell 1 for eksempel oppskrifter som gir hydrogels med varierende egenskaper: to hydrogels omfatter integrin bindende peptid RGD og to hydrogels omfatter cystein caps som en negativ kontroll peptid aktivitet. Såing konsentrasjon av pasient-avledede GBM celler er 500.000 celler/mL.
- Fortynne PEG-Mal lagerløsning (50 mg/mL, fra trinn 2.2) til 12,5 mg/mL ved å legge til 40 µL av lager løsningen 120 µL PBS. Delt utvannet løsningen i to 1,5 mL microcentrifuge rør slik at hver rør har 80 µL.
- Legge til 16 µL av lager RGD løsning (2,8 mM, fra trinn 2.3) en tube og 16 µL av lager cystein løsning (2,8 mM, fra trinn 2.3) til andre røret. Vortex å blande. Plass PEG-Mal-RGD eller PEG-Mal-CYS løsninger på is til bruk i trinn 3.9.
Merk: Prosedyren som beskrevet her gir hydrogels med ~ 140 µM av peptid. Dette tilsvarer ca 1 av hver 8 tilgjengelige PEG armene være opptatt med et peptid. Dette kan endres ved å endre molar forholdet mellom cystein slutter peptider tilgjengelig maleimide grupper. Generelt, oppnås en maksimal konsentrasjon av 280 µM av peptid samtidig som etterlot tilstrekkelig antall maleimide grupper tilgjengelig for hydrogel crosslinking. - Fortynne PEG-thiol lager løsningen (50 mg/mL, fra trinn 2.2) på 5 mg/mL ved å blande 4 µL av 50 mg/mL lagerløsning med 36 µL av PBS. Legge til 120 µL av oppløst, thiolated HA fra trinn 2.1 blandingen.
Merk: Av HMW HA er svært tyktflytende. Derfor anbefaler vi bruke wide-orifice brønnene tips overføre løsninger. Pipetter sakte å unngå løsning stikker til veggene av brønnene tips og forbedre nøyaktighet. - Plass ren og tørr formene (forberedt i trinn 2.4) i hver brønn av en vev kultur behandlet 12-vel plate. Bruker ren, sløv slutten av en pipette tips, trykk på gel mold og dobbeltsjekke tetting mellom muggsopp og bunnen av godt plate.
Merk: Se segl igjen rett før innkapsling å hindre lekkasje. - Passasje kulturperler GBM celler, oppheve tilknytningen til enkeltceller og bestemme cellen konsentrasjon som tidligere beskrevet3.
Merk: Noen GBM linjer kan ikke bli atskilt til enkeltceller. I dette tilfellet kan hele gliomaspheres være innkapslet. Men forberede dissosiert enkeltceller etter nøyaktig celle teller for å forbedre reproduserbarhet. Mange av disse er trolig kompatibel med hydrogel innkapsling protokoll for gliomasphere passaging varierer mellom ulike labs.- (Anbefales) Sentrifuger gliomaspheres på 500 x g for 5 min. fjerne nedbryting og Legg til 1 mL av cellen dissosiasjon enzym celle pellets. Deretter ruge i 5 min, trykke forsiktig røret for å røre.
- Legge til 4 mL fullstendig kultur medium (50 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, 25 µg/mL heparin, G21 supplement og 1% penicillin/streptomycin i DMEM/F12) i cellene.
- Sentrifuge igjen på 500 x g i 5 min og fjerne nedbryting. Endelig resuspend celle pellet i 1 mL av komplett mediet og suspendert celler passere en 70 µm celle sil. (Anbefales) vask silen med en ekstra 4 mL komplett medium å maksimere antall celler gjenopprettet.
- Beregn konsentrasjonen av celler i suspensjon ved hjelp av en hemocytometer. Dele celle suspensjon i 2 sentrifuge rør, hvor hver rør inneholder ~ 80 000 celler. Sentrifuge på 500 x g i 5 min; vanligvis utgjør 80 000 celler 2 80 µL hydrogels.
- Fjern nedbryting og resuspend en pellet i 80 µL av PEG-MAL-RGD løsning og andre pellets i 80 µL av PEG-MAL-CYS løsning (forberedt i trinn 3.1).
- Bruker en 200 µL, wide-orifice brønnene tips, dispensere 40 µL av HA løsning (fra trinn 3.3 ovenfor) i hver gummi silikon mold (som forberedt i trinn 3.4).
- Bruker en 200 µL, wide-orifice brønnene tips, bland den 40 µL av PEG-MAL-CYS eller PEG-MAL-RGD cell løsningen med HA løsning i mold. Pipetter opp og ned raskt mer enn 10 ganger. Gjenta for hver gel kultur forberedes.
Merk: Dette trinnet tar praksis siden første gelation skjer raskt (innen 30 s). Pipetter opp og ned mens du flytter spissen til forskjellige steder i former slik selv blande. Alltid holde spissen under væskenivå å unngå luftbobler. Gjør ikke blanding løsningen for mange ganger som gel kan få dannet inne i brønnene tips. PEG-MAL-CYS og PEG-MAL-RGD kan kombineres på ulike prosenter å oppnå ønsket RGD peptid konsentrasjonen. - Plass godt-plate som inneholder gel-innkapslet celler i en 37 ° C celle kultur inkubator for 5-10 minutter å sikre ferdigstillelse av reaksjonen.
- Tilsett 2-2.5 mL kultur medium hver brønn med dannet gels. Bruk en steril, 2 µL pipette tips eller mikro-slikkepott, forsiktig skille mold og gel. Bruke pre-sterilisert tang for å fjerne mold fra godt plate. Plass godt platen tilbake til celle inkubator (37 ° C og 5% CO2) for kultur og senere eksperimenter.
Merk: Dra mold vertikalt oppover for å unngå skade gel kulturer. Generelt, bør medium i gel kulturer byttes hver 3-4 dager. Ta vare ikke å Sug opp hydrogels når du fjerner medium. Hvis dette er et problem, anbefales det at du bruker en plast overføring pipette. Hvis bioluminescens for å spore celle nummer er planlagt, må det være transduced GBM celler med lentivirus koding constitutively luciferase uttrykket før innkapsling, som beskrevet tidligere3. For bioluminescens avbildning, legge til 1 mM av D-luciferin kultur medium 1t før luminescence bildebehandling.
4. lysate forberedelse til vestlige Blotting
- Chill 1,5 mL microcentrifuge rør på is (1 per gel eksempler). Kul sentrifuge til 4 ° C.
- Fjerne mediet fra bra plater. Overføre gels i prechilled microcentrifuge rør.
- Legg 100 µL RIPA bufferen med 1 x protease/fosfatase hemmere.
- Bruker en 1 mL sprøyte med en 20 G nål, bryte opp gel ved å skyve hele blandingen gjennom nål minst 20 ganger.
- Flash spinn prøven benk toppen microcentrifuge og sted prøven tilbake på isen.
- Vortex eksempler kort hver 5 min totalt 20 min.
- Sentrifuger prøver 14000 x g i 15 min på 4 ° C.
- Overføre nedbryting til nye, pre kjølt microcentrifuge rør og lagre på 20 ° C (kortsiktige) eller og-80 ° C (lang sikt). Utføre gel geleelektroforese med standard prosedyrer, som beskrevet tidligere3.
5. utpakking enkeltceller fra Hydrogel kulturer for flowcytometri
- Fjerne medium og overføre gel kultur (fra trinn 3.11) i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Inkuber gel med 500 µL av cellen dissosiasjon enzym (f.eks TrypLE Express) ved 37 ° C i 5 min, noen ganger flicking røret for å røre.
- Overføre blandingen i en 50 mL sentrifuge rør med 5 mL av komplett medium. Sett røret på is.
- Knytte en 20G nål på en 10 mL sprøyte. Trekk forsiktig celle suspensjon opp og ned gjennom nålen 8 ganger.
- Flyt blandingen gjennom 70 µm celle sil i en ny 50 mL sentrifuge tube. Bruke en ekstra 5 mL av komplett medium gjennom silen å samle alle gjenværende celler.
- Sentrifuge prøven på 400 x g for 5 min. fjerne nedbryting og resuspend pellet i ønsket buffer for flowcytometri (med standardprotokoller3).
6. kryonisk bevaring av Hydrogels snitting
- Fjerne mediet fra gel kulturer (fra trinn 3.11).
- Inkuber gel kulturer med 2 mL 4% paraformaldehyde (PFA) på 4 ° C over natten.
FORSIKTIG: PFA er giftig og må behandles forsiktig. - På den neste dagen, fjerne PFA. Legge til 2 mL 5% sukrose i PBS gels og ruge 1t ved romtemperatur.
- Erstatt 5% sucrose løsning med 2 mL 20% sukrose i PBS og ruge i 30 min.
- Erstatt sucrose løsning med 2 mL frisk 20% sukrose i PBS og ruge for en ytterligere 30 min.
- For tredje gang, erstatte sucrose løsning med 2 mL frisk 20% sukrose i PBS. Ruge på 4 ° C over natten.
- Forberede 20% sukrose i Optimal kutte temperatur (OCT) sammensatte.
Merk: På grunn av viskositeten av OCT, oppløsningen av sukrose kan ta litt tid (opptil over natten). Vi anbefaler å sette blandingen på en shaker under oppløsningen å opprettholde agitasjon. - Neste dag, fjerne den 20% sukrose løsningen og forsiktig helle 20% sukrose i OCT løsning over gel. Sørg for å dekke hele gel. Ruge på 4 ° C 3 h.
- Overføre gel i midten av en innebygging mold ved hjelp av en stor, flat slikkepott; Dette må gjøres nøye for å unngå skade gel.
- Kul 2-methylbutane inne en kryokammeret med et overskudd av tørris.
- Fyll innebygging mold med ren OCT (ingen sukrose). Fylle til like under øvre kant av mold.
- Fryse hydrogel prøven ved nedsenkning i avkjølt 2-methylbutane og går videre til snitting.
- Delen prøven ved hjelp av en kryostaten; snittykkelse på 10-18 µm og snittemperatur rundt-26 ° c anbefales.
- Utføre standard immunostai-prosedyrer på appa gel kultur, som beskrevet tidligere3.
Merk: PFA kalles irriterende og kreftfremkallende. Kan håndtere og kast PFA lokalt gjeldende standarder og forskriftene.
7. totalt RNA utvinning fra prøvene i Hydrogel
Merk: Her beskriver vi en protokoll som en kommersiell kit (se tabell for materiale) for å pakke ut totalt RNA fra hydrogel kultivert celler. Bufferne og alt materiale er tilgjengelig innenfor settet brukes.
- Fjerne kultur medium. Bruk en P1000 overføring pipette med bred-fødte tips overføre hydrogel kulturen til 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Legge til 350 µL bufferen RLT hydrogel kulturen.
- Bruker en 20 G nål knyttet til en 1 mL sprøyte, makulere gel ved å skyve hele blandingen gjennom nål minst 20 ganger.
- Overføre hele blandingen i en homogenizer kolonne i en 2 mL samling rør. Sentrifuge 13.000 x g i 2 minutter.
- Overføre nedbryting til en ren 1,5 mL microcentrifuge tube. Pass på at du ikke forstyrrer gel utløse nederst.
- Bland lysate prøven med 350 µL av 100% etanol. Overføre alle prøven til en spinn kolonne (fra kit) plass i en 2 mL samling rør. Sentrifuge for 1 min 13 000 x g.
- For etterfølgende trinnene for RNA rensing for PCR, følger du de generelle protokollen fra utstyr produsenten.
Merk: Når RNA er pakket ut, standardprotokoller for PCR brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For hvert sett med thiolated HA, bør graden av thiolation kontrolleres1H -NMR eller en Ellman test. HA modifisering benytter fremgangsmåten beskrevet her konsekvent genererer ~ 5% thiolation (definert som molar forholdet mellom thiols å HA disaccharides) (figur 1).
Sette opp denne nye kultur-plattformen vil kreve hvert laboratorium utføre streng testing for å sikre god kultur levedyktighet før gjennomfører store eksperimenter. Våre 80 µL hydrogels med en seeding tetthet 500.000 celler/mL (40 000 celler/gel) føre konsekvent spredning priser sammenlignes eller bedre enn gliomasphere kulturer (figur 2A2 C). Som HA/KNAGG kan hydrogels er optisk gjennomsiktige, celle atferd observeres i live, 3D kulturer ved hjelp av fase kontrast eller fluorescens mikroskopi. Figur 3A viser at 4 dager etter innkapsling, GBM celler i RGD inneholder hydrogels viser en invasiv fenotype, mens celler kultivert i hydrogel bruker PEG-MAL-CYS kontroller har en sfærisk morfologi.
Som er typisk med xenograft modeller der forskere må vente dager til måneder til implantert svulster kommer progressiv vekst24,32, ta pasient-avledet celler også tid en ny kultur-miljø. Derfor anbefaler vi dyrking 4-8 dager før eksperimenter, som behandling, slik de fleste cellene har angitt eksponentiell vekstfase. Utover medikamentelle behandlinger, kan reagenser som løselig cyclo-RGD, som konkurransedyktig forstyrrer celle interaksjon med RGD i hydrogels, legges til kultur medium (figur 3A).
Hydrogel systemet er kompatibel med mange vanlige metoder for å undersøke glioma cellebiologi. Med bioluminescens imaging, som vanligvis brukes til å overvåke gnager xenograft svulster, kan Relativtall levedyktig celler observeres i hydrogel kulturer i løpet av behandling. Figur 3B gir et eksempel på denne metoden, hvor effekten av erlotinib behandling på hydrogel-kulturperler GBM celler ble vurdert over 6 dager. Generelt kan hydrogel kulturer bli behandlet som vevsprøver når forbereder lysates Western blot eller PCR. Western blot analyse av kløyvde poly ADP polymerase angir at relative grad av apoptose i behandlet CD44 knockdown celler er høyere enn wildtype GBM celler kultivert i 0,5% HA hydrogels ()Figur 3 c). Tilsvarende kan enkeltcelle suspensjoner tilberedes fra hydrogel kulturer for analyse via flowcytometri ved hjelp av standardprotokoller for befriende enkeltceller fra intakt vev (figur 2). I tillegg til celle funksjoner Bevare cryosections av hydrogel-basert, 3D kulturer ECM avsatt av kultivert celler. For eksempel deponering mønstre av type IV kollagen skifte på erlotinib behandling av hydrogel kulturer (figur 3D).
Figur 1 : Representant H 1 -NMR spekter av thiolated hyaluronsyre. Integrert topper indikerer at ca 5% av HA glucuronic syre grupper er endret med en thiol. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Spredning av hydrogel-innkapslet celler. A) eksempel bilder av fabrikkerte 80 µL gels i 12-vel plater. Etter crosslinking, var hydrogels hovne i celle kultur medium. B) representant resultatene av spredning rente målt ved hjelp av flowcytometri. GBM celler (HK301) ble inkubert med 1 µM EdU (5-ethynyl-2 '-deoxyuridine) for 2,5 t på den fjerde dagen etter innkapsling eller passaging. En klikk-reaksjon ble brukt til å bøy fluorescerende fargestoff til innarbeidet EdU, som beskrevet i Xiao et al. 2017.3 negative kontroller, der ingen EdU ble lagt til kulturer, ble inkludert. C) representant AC confocal mikroskopi bilder av live (grønn) og døde (rød) celler 24 timer etter at hydrogel kulturer av GBM celler (HK157) ble etablert. Skalere barer = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Karakterisering. A) representant fase kontrast bilder med 0,5% (w/v) HA hydrogel-kulturperler celler under varierende forhold i 8 dager etter innkapsling. Pilene angir celler med en invasiv morfologi. B) representant bilder bioluminescens signal målt etter 15 dager behandling med 1 µM erlotinib eller kjøretøy (DMSO). 1 mM D-luciferin ble lagt til celle kultur medium 1t før bildebehandling. Cellene ble transduced med lentivirus koding for grunnleggende uttrykk for firefly luciferase før innkapsling. C) representant immun-blot bilder analysere kløyvde poly ADP utvalg (cl-PARP) uttrykk i GBM celler (HK301) kultivert i hydrogels med 0,5% (w/v) HA og 1 kPa kompresjons modulus. Alle beskjærte bilder vist var fra samme blot. D) representant farging av kollagen IV (grønn) og Hoechst 33342 (blå) i hydrogel-kulturperler HK301 celler 12 dager etter behandling med 1 µm erlotinib eller kjøretøy (DMSO). Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Gel Type | Del en (40 µL hver) | Del B (40 µL hver) | ||||
| 4Arm-PEG-MAL (50mg/mL) | Cystein eller RGD (2,81 mM) | PBS (pH 7.4) | 4Arm-PEG-thiol (50mg/mL) | PBS (pH 7.4) | HA-S (13,3 mg/mL) | |
| 0,5% (w/v) HA 1kPa | 10 ΜL | 4.00 ΜL | 26 ΜL | 1.00 ΜL | 9.00 ΜL | 30.0 ΜL |
| 0,5% (w/v) HA 2kPa | 20.0 ΜL | 4.00 ΜL | 16,0 ΜL | 8.00 ΜL | 2.00 ΜL | 30.0 ΜL |
| 0,1% (w/v) HA 1kPa | 10 ΜL | 4.00 ΜL | 26 ΜL | 8.00 ΜL | 26.0 ΜL | 6.00 ΜL |
Tabell 1. Hydrogel formuleringer gir uavhengig kontroll HA konsentrasjon og mekaniske egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generering av reproduserbar data ved hjelp av denne 3D kultur-systemet krever: 1) konsekvent parti til parti thiolation av HA, 2) praksis for å oppnå effektiv blanding av hydrogel prekursorer og håndtering av hydrogel kulturer for å unngå skade og 3) optimalisert såing tetthet for hver celle linje brukes.
Når en bestemt vekt andelen HA er ønsket i hydrogel, bestemmer graden av thiolation av HA krysskobling tetthet. Vi anbefaler å bruke en konsekvent mengde HA for hver thiolation reaksjonen for å minimere parti til parti variasjon. Vi foreslår at minst 300 mg av HA brukes for hver thiolation reaksjonen slik at den samme gruppen av thiolated HA kan brukes for flere eksperimentelle gjentakelser. Thiols maleimide grupper på 4-arm PEG molar forholdet skal alltid være 1.1:1 å sikre maksimal crosslinking effektivitet. Dermed, hvis graden av thiolation er variert, deretter mengden av PEG-Mal lagt må justeres tilsvarende. Når peptider er konjugert til maleimides før gel formasjon, må beregnet antall PEG arms med bundet peptider trekkes fra det totale antallet tilgjengelige maleimides for denne beregningen. I tillegg anbefaler vi å holde graden av HA thiolation under 10-15% å unngå disulfide obligasjon formasjon som vil hindre oppløsning og konsekvent gelation.
Michael-type tillegg reaksjonen mellom thiol og maleimide sikrer at gelation oppstår i under et minutt. Mens denne rask gelation reduserer tiden celler suspendert i hydrogel prekursorer er uten fullstendig medium, som kan skade deres levedyktighet, krever innkapsling prosessen erfaring med alle pipettering og miksing skritt for å oppnå reproduserbar resultater. Vi har vanligvis traineeprogram praksis flere runder med gelation uten celler før du utfører "ekte" innkapsling eksperimenter.
To faktorer kan bli forskjøvet til å modulere gelation hastighet: reaksjon temperatur og forløper pH. Senke temperaturen reaksjon ved å plassere den godt platen på is mens bremser reaksjonen og gir større tid å blande forløper løsninger. Men må dette gjøres under sterile forhold med riktig aseptiske teknikker. Tilsvarende kan pH i forløperen løsninger endres for å øke eller redusere reaksjonstiden med høyere eller lavere pH, henholdsvis. Siden thiolated HA er dialyzed mot surt vann å hindre disulfide obligasjon formasjon, vil rekonstituert thiolated HA gi lavere pH enn ellers kan forventes. Generelt rekonstituering i 20 mM HEPES HBSS buffer, justere pH 9, vil gi en pH i nærheten 7 da 15 mg/mL av thiolated HA (~ 5% thiolated) er oppløst. Vi anbefaler å bruke pH 6.8-7 thiolated HA løsning å tillate selv blande gel løsning samtidig maksimere cell helse.
Såing tetthet under innkapsling er avgjørende for mobilnettet levedyktighet og eksperimentelle reproduserbarhet. Vi anbefaler seeding i størrelsesorden 100.000 til 2,000,000 celler/mL. Vi har funnet at dette området er optimal for levedyktigheten til de fleste celletyper mens forebygge over-confluency i en eksperimentell tidsrom på minst 3 uker. Innledende seeding tetthet som optimaliserer levedyktighet bør fastsettes eksperimentelt for hver celle brukes.
Ekstrem forsiktighet bør utvises ved endring celle medium for å unngå skadelige hydrogel kulturer. Spesielt, ta vare ikke å Sug opp hydrogel i pipette. Dermed ikke bruker vakuum aspirasjon og i stedet bruke en steril overføring pipette inneholder manuelt. Endre bare halve mediet i en kultur godt samtidig kan også.
Generelt krever denne teknikken praksis for å oppnå nødvendig fingerferdighet og konsistens. Når en lab-spesifikk protokoll er opprettet, kan 3D kultur systemet forskeren bruke mange karakterisering metoder som typisk for cellekultur og explanted vev. Vi har her beskrives flere metoder for analyse, inkludert immunofluorescence, flowcytometri, vestlige blotting og bioluminesens imaging live, 3D kulturer (figur 2-3). For mer detaljert protokoller karakterisering metoder, se Xiao et al. 20173. Som HA/PEG hydrogels optisk gjennomsiktig, kan endelig standard * lys teknikker, inkludert AC confocal bildebehandling, brukes til å overvåke live, 3D kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med finansiering fra NIH (R21NS093199) og UCLA ARC 3R Award. Våre sincerest takk går til lab av Dr. Harley Kornblum for levering av cellelinjer HK301 og HK157. Vi takker også UCLA vev patologi Core Laboratory (TPCL) for og kryosnitt, avansert lys mikroskopi/spektroskopi kjernen anlegg (ALMISSE) i California Nanosystems Institute (CNSI) ved UCLA for bruk av AC confocal mikroskop, UCLA tørkes Institutt for Molekylær Imaging for å bruke IVIS tenkelig system, UCLA molekylær instrumentering Center (mikrofon) for å gi magnetisk resonans spektroskopi og flyt cytometri kjernen i Jonsson omfattende Cancer Center (JCCC) ved UCLA for å gi instrumentering for flyt cytometri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
References
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3d culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Holland, E. C.
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006 - 2010. Journal of Neuro-Oncology. 15 (6), 788-796 (2013).
- Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (6), 1046-1069 (2004).
- Zamecnik, J. The extracellular space and matrix of gliomas. Acta Neuropathologica. 110 (5), 435-442 (2005).
- Jadin, L., et al. Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors. Annals of translational medicine. 3 (6), (2015).
- Park, J. B., Kwak, H. J., Lee, S. H.
- Pedron, S., et al. Spatially graded hydrogels for preclinical testing of glioblastoma anticancer therapeutics. MRS communications. 7 (3), 442-449 (2017).
- Jiglaire, C. J., et al. Ex vivo cultures of glioblastoma in three-dimensional hydrogel maintain the original tumor growth behavior and are suitable for preclinical drug and radiation sensitivity screening. Experimental cell research. 321 (2), 99-108 (2014).
- Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
- Day, A. J., Prestwich, G. D. Hyaluronan-binding proteins: tying up the giant. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 4585-4588 (2002).
- Wiranowska, M., Tresser, N., Saporta, S. The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro. Anticancer Research. 18 (5A), 3331-3338 (1998).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. GLIA. 59 (8), 1169-1180 (2011).
- Gilg, A. G., et al. Targeting hyaluronan interactions in malignant gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors. Clinical Cancer Research. 14 (6), 1804-1813 (2008).
- Misra, S., Hascall, V. C., Markwald, R. R., Ghatak, S. Interactions between hyaluronan and its receptors (CD44, RHAMM) regulate the activities of inflammation and cancer. Frontiers in immunology. 6, 201 (2015).
- Varga, I., et al. Expression of invasion-related extracellular matrix molecules in human glioblastoma versus intracerebral lung adenocarcinoma metastasis. Zentralblatt fur Neurochirurgie. 71 (4), 173-180 (2010).
- Guo, W., Giancotti, F. G. Integrin signalling during tumour progression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 816-826 (2004).
- Bello, L., et al. αvβ3 and αvβ5 integrin expression in glioma periphery. Neurosurgery. 49 (2), 380-390 (2001).
- Chamberlain, M. C., Cloughsey, T., Reardon, D. A., Wen, P. Y. A novel treatment for glioblastoma: integrin inhibition. Expert review of neurotherapeutics. 12 (4), 421-435 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Oh, Y. T., et al. Translational validation of personalized treatment strategy based on genetic characteristics of glioblastoma. PloS one. 9 (8), e103327 (2014).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. C. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
- Zhu, J. Bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 31 (17), 4639-4656 (2010).
- Stern, R., Asari, A. A., Sugahara, K. N. Hyaluronan fragments: an information-rich system. European journal of cell biology. 85 (8), 699-715 (2006).
- Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Ellman's reagent: 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination. Analytical biochemistry. 94 (1), 75-81 (1979).
- Jin, R., et al. Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) hydrogels via Michael addition: An injectable biomaterial for cartilage repair. Acta biomaterialia. 6 (6), 1968-1977 (2010).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of visualized experiments. 41, 3-7 (2010).
