Summary
Här presenterar vi ett protokoll för tredimensionella kultur av patientderiverade glioblastoma celler inom ortogonalt avstämbara biomaterial utformade för att efterlikna hjärnans matrisen. Detta tillvägagångssätt ger en in vitro-, Experimentell plattform som underhåller många egenskaper i vivo glioblastoma celler normalt förlorade i kultur.
Abstract
Glioblastom (GBM) är den vanligaste och mest dödliga, centrala nervsystemet cancern. Under de senaste åren har många studier fokuserat på hur de extracellulär matrixen (ECM) unik hjärnan miljön, såsom hyaluronsyra (HA), underlättar GBM progression och invasion. Men inkluderar de flesta i vitro kultur modeller GBM celler utanför ramen för en ECM. Murina xenograft GBM celler används vanligen också. I vivo modeller gör det dock svårt att isolera bidrag från enskilda funktioner i den komplexa tumör närmiljön till tumör beteende. Här beskriver vi en HA hydrogel-baserade, tredimensionella (3D) kultur plattform som tillåter forskare att självständigt ändra HA koncentration och stelhet. Ultrahög molekylvikt HA och polyetylenglykol (PEG) omfattar hydrogels, som är tvärbundna via Michael-typ tillägg i närvaro av levande celler. 3D hydrogel kulturer av patientderiverade GBM celler uppvisar lönsamhet och spridning priser lika bra som eller bättre än, när odlade som standard gliomaspheres. Hydrogel systemet möjliggör också införlivandet av ECM-mimetiska peptider för att isolera effekterna av särskilda cell-ECM interaktioner. Hydrogeler är optiskt transparenta så att levande celler kan avbildas i 3D kultur. Slutligen är HA hydrogel kulturer kompatibla med standardtekniker för molekylära och cellulära analyser, inklusive PCR, Western blotting och kryosnitt följt av immunofluorescens färgning.
Introduction
Tredimensionella (3D) kultur system recapitulate interaktioner mellan celler och deras omgivande extracellulär matrix (ECM) i native vävnader bättre än deras tvådimensionell (2D) motsvarigheter1,2. Framsteg inom vävnadsteknik har gett sofistikerade, 3D kultur plattformar som möjliggör kontrollerade undersökningar (1) hur kemiska och fysiska komponenter av matrix närmiljön påverkar cellen beteenden och 2) effekten av nya terapeutiska strategier för ett antal sjukdomar, däribland cancer2. Även om in vitro- modeller kan inte redogöra för systemisk faktorer, såsom endokrina och immun signaler, och således kan inte helt ersätta i vivo modeller, ger de flera fördelar inklusive reproducerbarhet, experimentell kontroll, överkomliga priser och hastighet. Här, beskriver vi användning av hjärnan-mimetiska hydrogels i vilken 3D kulturer patientderiverade hjärnan tumörceller fånga många aspekter av tumör fysiologi, särskilt dynamiken i förvärva behandling resistance3. Jämfört med andra in vitro- metoder, representera dessa kulturer bättre i vivo tumör modeller och kliniska observationer3.
Glioblastom (GBM) är den mest frekventa och dödliga cancer med ursprung i hjärnan, med en medianöverlevnad på bara 1-2 år4,5. Under de senaste åren har många studier fokuserat på påverkan av tumör matrix miljö i GBM6,7,8. Unik hjärnan ECM har rapporterats påverka GBM cellmigration, proliferation och terapeutiska motstånd6,7,8,9,10,11 , 12. hyaluronsyra (HA) är en rikligt glykosaminoglykan (GAG) i hjärnan, där det interagerar med andra GAGs och proteoglykaner till bildar ett hydrogel-liknande mesh13. Många studier har rapporterat HA överuttryck i GBM tumörer och dess efterföljande effekter på cancer progression8,9,13,14,15,16 ,17. Andra ECM komponenter också påverka GBM tumör tillväxt och invasion6,7,15,18. Till exempel Fibronektin och Aktiebolaget Trav & Galopp, vilket är vanligtvis ökad utsträckning hos GBM, framkalla heterodimerization av cellen ytbehandlar integrin receptorer genom bindning till sekvensen ”RGD” och initiera komplexa signalering kaskader som främjar tumör överlevnad19 ,20,21. Förutom biokemisk påverkan påverka fysikaliska egenskaper av vävnadsmatris också GBM progression22,23.
Kontinuerliga förvärv av resistens mot terapier är en av de viktigaste drivkrafterna för GBM dödlighet4. Droger som visar lovande resultat i 2D- eller gliomasphere modeller har misslyckats i efterföljande djurstudier och kliniska fall3, som visar att effekterna av microenvironmental faktorer bidragit till GBM tumör svar1. Även djurmodeller kan ge en 3D, fysiologiskt lämplig mikromiljö xenografted patientens celler och generera kliniskt relevanta resultat24,25, komplexiteten i den hjärnan närmiljön i vivo gör det utmanande för att avgöra vilka funktioner, inklusive cell-matrix interaktioner, är nyckeln till specifika biologiska utfall. Identifiering av nya terapeutiska mål kommer att dra nytta av användningen av förenklade kultur plattformar som biokemiska och biofysiska egenskaper definieras.
Till skillnad från tidigare rapporterade biomaterial modeller av GBM tumör mikromiljö26,27 som inte har uppnått sann ortogonala kontroll över enskilda biokemiska och fysiska funktioner av ECM, biomaterial plattformen rapporterade här möjliggör frikoppling av bidrag från flera oberoende funktioner till GBM cell fenotyp. Här presenterar vi ett HA-baserade, ortogonalt avstämbara, hydrogel system för 3D kultur av patientderiverade glioblastoma Multiforme celler. Hydrogeler bildas från två polymerkomponenter: (1) biologiskt aktiva HA och 2) biologiskt inert polyetylenglykol (PEG). PEG är en allmänt använd biokompatibelt och hydrofila material med låg protein adsorption och minimal immunogenicitet28. Här, ca 5% av glukuronsyra sura beståndsdelarna på HA kedjor är functionalized med thiol grupper att aktivera crosslinking till en kommersiellt tillgänglig 4-arm-PEG avslutas med maleimides via Michael-typ tillägg. I sin vanligaste form i kroppen finns HA i ultrahög molekylvikt (HMW) kedjor. Här, en låg grad av modifiering HMW hektar (500-750 kDa) hjälper till att bevara infödda interaktioner av HA och dess cellreceptorer, inklusive CD4429. Genom att ersätta PEG-tiol för HA-thiol bibehållen en konstant molar förhållandet av totala tioler till maleimides, kan HA koncentration frikopplas från mekaniska egenskaper av den resulterande hydrogels. Stökiometriska kontroller kan dessutom användas till cystein-avslutad peptider att en definierad Genomsnittligt antal maleimide-avslutad armar på varje 4-arm-PEG-konjugat. Införlivandet av ECM-derived, självhäftande peptider kan interaktioner med integriner på odlade celler, genom vilka biokemiska och kemiska signaler är sensorik1. Maleimide-thiol tillägg uppstår mycket snabbt under fysiologiska betingelser, minimera tidsåtgången för cell inkapsling och maximera överlevnad patientderiverade celler. Dessutom hydrogel kulturer kan behandlas som typiska vävnad preparatet och är kompatibel med standard karakterisering tekniker inklusive Western blotting, flödescytometri och immunofluorescens färgning. Följande protokoll beskriver förfarandena för att fabricera hydrogels, upprätta 3D cellkulturer patientderiverade GBM och tekniker för biokemisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla mänsklig vävnad samling åtgärder genomfördes under institutionellt godkända protokoll.
1. Thiolation av hyaluronsyra
Obs: Molar nyckeltal anges med avseende på totala antalet bildas grupper om inget annat anges.
- Lös 500 mg Natriumhyaluronat (HA, 500-750 kDa) på 10 mg/mL i avjoniserat, destillerat vatten (Dihs2O) i autoklav steriliseras, 250 mL-Erlenmeyerkolv. Rör om lösningen (~ 200 rpm) i rumstemperatur i 2 timmar att helt upplösa HA. Använd en uppståndelse bar och magnetiska rör plattan för att hålla reaktion omrörning under thiolation förfarandet.
- Med 0,1 M saltsyra (HCl), justera pH 5,5 HA lösningen. Väg upp 69,6 mg (0,25 x molar förhållandet) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC).
Obs: Även om oupplösta EDC kan läggas direkt till HA lösningen, det är oftast lättare att upplösa EDC först i 1 mL Dihs2O och sedan snabbt lägga till EDC lösningen att HA lösningen. Före upplösningen i 1 mL Dihs2O kan också göras med N-hydroxysuccinimide (NHS) och cysteaminklorhydrat dihydrocholoride innan du lägger till reaktionen i steg 1.3 och 1.4. - Lägg till 17,9 mg (0,125 x molar förhållandet) av NHS i reaktionen. Justera pH-värdet i den reaktion lösningen till 5.5 använder 0.1 M HCl och inkubera reaktionen vid rumstemperatur i 45 minuter.
- Lägg till 70,0 mg (0,25 x molar förhållandet) cysteaminklorhydrat dihydroklorid i reaktion lösning. Använda 0,1 M natriumhydroxid (NaOH) för att justera pH till 6,25. Inkubera reaktionen vid rumstemperatur över natten under omrörning.
- Följande dag, Använd 1 M NaOH för att justera pH reaktion lösningen på runt 8. Lägga till 192 mg (4 x molar förhållandet) Ditiotreitol (DTT) reaktionen. Justera pH tillbaka till 8 efter tillsats av DTT och låt omrörning i 1-2 timmar i rumstemperatur.
- Använda 1 M HCl för att justera pH till 4. Överför hela reaktionsblandningen till pre blötläggas dialys membran (molekylvikt cut-off runt 13 kDa) och dialyze mot Dihs2O pre justerat till pH 4.
Obs: Volymen av Dihs2O för dialys bör vara minst 40 gånger volymen av reagerade HA lösningen (t.ex. 50 mL prov i 2 L av Dihs2O, pH 4). - Ersätta dialyslösning (Dihs2O, pH 4) två gånger dagligen i 3 dagar i rumstemperatur.
- Filtrera dialyzed lösningen genom ett 0,22 µm membran, vakuum-driven filter. Blixt frysa lösning av thiolated HA i flytande kväve. Använda en lyophilizer för att frysa torra prover under 2 dagar. Thiolated HA i torr form kan lagras i ett vakuum förslutna torkugn vid-20 ° C i minst 6 månader.
- För att avgöra graden av thiolation, använda Ellman's test och/eller proton NMR spektroskopi30,31.
2. beredning av Crosslinking material
- Lös thiolated HA på önskad koncentration (i detta exempel, 13,3 mg/mL) i HEPES-buffrad koksaltlösning (20 mM HEPES i Hanks balanserad salt saltlösning (HBSS) buffert, justerat för att falla inom ett pH på 8-9) i en bärnstensfärgad injektionsflaska att minimera exponering för omgivande ljus. Förvara lösningen omrörning.
Obs: Bildandet av disulfide obligationer mellan tioler konjugerat till HA kan uppstå om pH är över 8, lösning koncentration är för hög eller om lösningen är kvar omrörning för länge innan gelation. För att undvika det här problemet Använd under 15 mg/mL thiolated HA och upplösa thiolated HA inom 2 timmar bilda hydrogels. - Lös 4-arm-PEG-maleimide (PEG-Mal, 20 kDa) och 4-arm-PEG-tiol (PEG-thiol, 20 kDa) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4, att förbereda 50 mg/mL PEG-Mal och PEG-thiol stamlösningar.
Obs: Det tar minst 1 timme att helt upplösa PEG reagenser. - Om du lägger till ECM-derived peptider, lös cystein-innehållande peptider i PBS att förbereda en stamlösning.
Obs: Använd en lager koncentration av 2-4 mM. - Blöt silikongummi formar i etanol för minst 20 min att rena dem och sedan Autoklavera dem för sterilisering.
3. Hydrogel Crosslinking och Cell inkapsling
Obs: som ett exempel här, inkapsling av fyra enskilda, 80 µL hydrogels med 0,5% (w/v) HA och 1 kPa tryckhållfasthet elasticitetsmodul är beskrivna3. Se tabell 1 för exempel recept som ger hydrogels med varierande egenskaper: två hydrogels införliva den integrin-bindande peptiden RGD och två hydrogels införliva cystein caps som negativ kontroll för peptid aktivitet. Seedning koncentration av patientderiverade GBM celler är 500 000 celler/mL.
- Späd PEG-Mal stamlösningen (50 mg/mL, från steg 2.2) till 12,5 mg/mL genom att lägga till 40 µL stamlösning till 120 µL PBS. Dela den utspädda lösningen i två 1,5 mL mikrocentrifugrör så att varje tub har 80 µL.
- Lägg till 16 µL lager RGD lösning (från steg 2,3 2,8 mM) på en tub och 16 µL lager cystein lösning (från steg 2,3 2,8 mM) till det andra röret. Vortex att blanda. Placera de PEG-Mal-RGD eller PEG-Mal-CYS lösningarna på is tills användning i steg 3,9.
Obs: Förfarandet som beskrivs här avkastning hydrogels med ~ 140 µM av peptid. Detta motsvarar cirka 1 av varje 8 tillgängliga PEG armar ockuperat med en peptid. Detta kan varieras genom att ändra molar förhållandet av cystein-avslutad peptider tillgängliga maleimide grupper. I allmänhet kan en maximikoncentration på 280 µM av peptid uppnås samtidigt som du fortfarande har tillräckligt antal maleimide grupper tillgängliga för hydrogel crosslinking. - Späd PEG-thiol stamlösning (50 mg/mL, från steg 2.2) 5 mg/ml genom att blanda 4 µL av 50 mg/mL stamlösning med 36 µL av PBS. Tillsätt 120 µL av upplöst, thiolated HA från steg 2.1 till blandningen.
Obs: Lösningar HMW hektar är mycket trögflytande. Således rekommenderar vi med wide-öppning mikropipett tips för att överföra lösningar. Pipett långsamt för att undvika lösning sticker till väggarna i mikropipett tip och förbättra mätnoggrannheten. - Placera rena, torra formarna (bereddes i steg 2,4) i varje brunn icke-vävnadskultur behandlade 12-bra platta. Använda ren, trubbiga ände en pipettspetsen, tryck på gel mögel och dubbelkolla tätning mellan formarna och botten av väl plattan.
Obs: Kontrollera tätningen igen precis innan inkapsling att förhindra läckage. - Passagen odlade GBM celler, dissociera att enstaka celler och bestämma cellkoncentrationen beskrivs som tidigare3.
Obs: Vissa GBM linjer inte särskiljas till enstaka celler. I det här fallet kan vara inkapslade hela gliomaspheres. Dock förbereda dissocierade enstaka celler efter exakt cell inventering för att förbättra reproducerbarheten. Protokollet för gliomasphere passaging varierar bland olika labs och många av dessa är sannolikt kompatibel med hydrogel inkapsling.- (Rekommenderas) Centrifug gliomaspheres vid 500 x g för 5 min. avlägsna supernatanten och tillsätt 1 mL av cell dissociation enzym till cellpelleten. Sedan, inkubera i 5 min, knacka på röret att agitera.
- Tillsätt 4 mL komplett odlingsmedium (50 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, 25 µg/mL heparin, G21 tillägg och 1% penicillin/streptomycin i DMEM/F12) till cellerna.
- Centrifugera igen 500 x g under 5 minuter och ta bort supernatanten. Slutligen Återsuspendera cellpelleten i 1 mL av komplett medium och passera suspenderade celler genom en sil med 70 µm i cellen. (Rekommenderas) tvätta silen med ytterligare 4 mL av komplett medium att maximera antalet celler återvinns.
- Beräkna koncentrationen av celler i avstängning med hjälp av en hemocytometer. Dela cellsuspensionen i 2 centrifugrör, där varje tub innehåller ~ 80.000 celler. Centrifugera 500 x g för 5 min; i allmänhet får 80.000 celler upp 2 80 µL hydrogels.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera en pellet i 80 µL av PEG-MAL-RGD lösning och en andra pelleten i 80 µL av PEG-MAL-CYS lösning (beredd enligt steg 3.1).
- Med en 200 µL, wide-öppning mikropipett tip, fördela 40 µL HA lösning (från steg 3.3 ovan) i varje gjutform av gummi (som bereddes i steg 3,4).
- Med en 200 µL, wide-öppning mikropipett tips, blanda den 40 µL PEG-MAL-CYS eller PEG-MAL-RGD cell lösning med HA lösningen i mögel. Pipettera upp och ned snabbt mer än 10 gånger. Upprepa för varje gel kultur förbereds.
Obs: Detta steg kräver övning, eftersom inledande gelation sker snabbt (inom 30 s). Pipettera upp och ner medan du flyttar spetsen till olika platser i formar för att säkerställa även blandning. Alltid hålla spetsen under flytande nivå att undvika bildas luftbubblor. Gör inte blanda lösningen för många gånger som gel kan få bildas inuti mikropipett spets. PEG-MAL-CYS och PEG-MAL-RGD kan kombineras vid varierande förhållanden att uppnå önskad RGD peptid koncentration. - Placera den väl plattan som innehåller gel-inkapslat celler till en 37 ° C cell kultur inkubator för 5-10 minuter att säkerställa genomförandet av reaktionen.
- Tillsätt 2-2,5 mL odlingsmedium till varje brunn med bildas geler. Använd en steril, 2 µL pipettspetsen eller mikro-spatel, försiktigt separeras mögel och gel. Använda försteriliserade pincett för att ta bort mögel från väl plattan. Placera väl plattan tillbaka till cellen inkubator (37 ° C och 5% CO2) för kultur och framtida experiment.
Anmärkning: Dra mögel vertikalt uppåt för att undvika att skada de gel kulturerna. I allmänhet bör medium i gel kulturer bytas var 3-4 dagar. Se till att inte aspirera hydrogels när du tar bort medium. Om detta är ett problem, rekommenderar vi att du använder plast överföring pipett. Om Mareld imaging för att spåra mobilnummer är planerad, måste GBM celler vara sensorik med lentivirus kodning konstitutivt luciferas uttryck innan inkapsling, som tidigare beskrivits3. För Mareld imaging, lägga till 1 mM från D-luciferin odlingsmedium 1 h före luminiscens imaging.
4. lysate beredning för Western Blotting
- Chill 1,5 mL mikrocentrifugrör på is (1 per gel prover). Cool centrifug till 4 ° C.
- Ta bort mediet från plattor. Över geler till prechilled mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 100 µL av RIPA bufferten med 1 x proteas/fosfatas-hämmare.
- Med en 1 mL spruta med en 20 G nål, bryta upp gelen genom att trycka hela blandningen genom nålen minst 20 gånger.
- Flash spin provet med bänk topp mikrocentrifug och placera provet tillbaka på isen.
- Vortex prover kort varje 5 min för totalt i 20 min.
- Centrifugera proverna vid 14000 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till nya, pre kyld mikrocentrifugrör och förvaras vid-20 ° C (kortvarig) eller och -80 ° C (långsiktiga). Utföra gelelektrofores använder standardiserade förfaranden, som tidigare beskrivits3.
5. extrahera enstaka celler från Hydrogel kulturer för flödescytometri
- Ta bort medium och överföring gel kultur (från steg 3.11) i en 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Inkubera gel med 500 µL av cell dissociation enzymet (t.ex. TrypLE Express) vid 37 ° C i 5 min, ibland snärta röret att agitera.
- Över blandningen i en 50 mL centrifugrör med 5 mL av komplett medium. Placera röret på is.
- Bifoga en 20G nål på en 10 mL-sprutan. Dra försiktigt cellsuspensionen upp och ner genom nålen 8 gånger.
- Flöde blandningen genom 70 µm cell SIL i en ny 50 mL centrifugrör. Applicera ytterligare 5 mL av komplett medium genom silen att samla alla resterande celler.
- Centrifugera provet vid 400 x g för 5 min. avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i önskad buffert för flödescytometri (med standardprotokoll3).
6. Frysförvaring av hydrogeler för snittning
- Ta bort mediet från gel kulturer (från steg 3.11).
- Inkubera gel kulturer med 2 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) vid 4 ° C över natten.
FÖRSIKTIGHET: PFA är giftigt och måste hanteras försiktigt. - Den nästa dag, ta bort PFA. Tillsätt 2 mL 5% sackaros i PBS till geler och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
- Byt ut 5% sackaroslösning med 2 mL 20% sackaros i PBS och inkubera i 30 min.
- Ersätta sackaroslösning med 2 mL färsk 20% sackaros i PBS och inkubera i en ytterligare 30 min.
- För tredje gången, ersätta sackaroslösning med 2 mL färsk 20% sackaros i PBS. Inkubera vid 4 ° C över natten.
- Förbereda 20% sackaros i Optimal skärtemperatur (ULT) förening.
Obs: På grund av viskositeten hos OCT, upplösning av sackaros kan ta lite tid (upp till natten). Vi rekommenderar att sätta blandningen på en shaker under upplösning att upprätthålla agitation. - Nästa dag, ta bort 20% sackaros lösningen och häll försiktigt 20% sackaros i OCT lösning över gelen. Se till att täcka hela gelen. Inkubera vid 4 ° C för 3 h.
- Överföra gelen in i centrera av en inbäddning mögel med en stor, platt spatel; Detta måste göras noggrant för att undvika att skada gelen.
- Cool 2-methylbutane släpper en nedkyld med ett överskott av torr-is.
- Fyll inbäddning mögel med ren OCT (ingen sackaros). Fyll till precis nedanför övre kanten av mögel.
- Frysa hydrogel provet genom nedsänkning i luftkylda 2-methylbutane och sedan vidare till snittning.
- Avsnitt provet med en kryostat; snittjocklek 10-18 µm och snittning temperatur på ca-26 ° C rekommenderas.
- Utför vanliga immunfärgning procedurer på sektionerad gel kultur, som tidigare beskrivits3.
Obs: PFA är känt irriterande och cancerframkallande. Vänligen hanteras och kasseras PFA enligt lokalt tillämpliga standarder och regler.
7. total RNA-extraktion från prover i Hydrogel
Obs: Här beskriver vi ett protokoll med hjälp av ett kommersiellt kit (se tabell av material) för att extrahera total-RNA från hydrogel odlade celler. Buffertar och allt material finns inom satsen används.
- Ta bort odlingsmedium. Använda P1000 överföring pipett med wide-bore spets för att överföra hydrogel kulturen i 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Tillsätt 350 µL buffert RLT hydrogel kultur.
- Använder en 20 G nål bifogas en 1 mL spruta, strimla gelen genom att trycka hela blandningen genom nålen minst 20 gånger.
- Över hela blandningen till en Homogenisatorer kolumn placeras i en 2 mL collection tube. Centrifugera vid 13 000 x g i 2 min.
- Över supernatanten till en ren 1,5 mL mikrocentrifug rör. Var noga med att inte störa gel fällningen vid botten.
- Blanda lysate provet med 350 µL av 100% etanol. Överföra alla provet till en spin kolumn (från kit) plats i en 2 mL collection tube. Centrifugera i 1 minut vid 13 000 x g.
- För efterföljande steg för RNA rening för PCR, följ det allmänna protokollet av kit tillverkaren.
Obs: När RNA utvinns, standardprotokoll för PCR kan användas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För varje parti av thiolated HA, bör graden av thiolation verifieras med H1-NMR eller en Ellman's test. HA ändring med hjälp av proceduren som beskrivs här konsekvent genererar ~ 5% thiolation (definierat som molar förhållandet av tioler att HA disackarider) (figur 1).
Inrättandet av denna nya kultur-plattform kräver varje laboratorium utföra rigorösa tester för att säkerställa bra kultur lönsamhet före genomförandet av storskaliga experiment. Våra 80 µL hydrogels med sådd täthet 500 000 celler/mL (40 000 celler/gel) leda konsekvent spridning priser som är jämförbara med eller bättre än, gliomasphere kulturer (figur 2A-2 C). Som HA/PEG kan hydrogeler är optiskt transparenta, cell beteenden observeras direkt i live, 3D kulturerna med fas kontrast eller fluorescence mikroskopi. Figur 3A visar att 4 dagar efter inkapsling, GBM celler i RGD-innehållande hydrogels uppvisar en invasiv fenotyp, medan celler odlade i hydrogel med PEG-MAL-CYS kontroller har en sfäriska morfologi.
Som är typiskt med xenograft-modeller där forskare måste vänta i dagar till månader tills implanterade tumörer nå progressiv tillväxt24,32, ta patientderiverade celler också tid att anpassa sig till en ny kultur miljö. Således rekommenderar vi odla 4-8 dagar innan experiment, till exempel missbruksbehandling, att se till att de flesta celler har angett exponentiella tillväxtfasen. Utöver läkemedelsbehandling, kan reagenser som lösliga cyclo-RGD, som konkurrenskraftigt störa cell interaktioner med RGD i hydrogels, läggas till odlingsmedium (figur 3A).
Våra hydrogel-systemet är kompatibelt med många gemensamma metoder för att undersöka glioma cellbiologi. Med hjälp av Mareld imaging, som vanligen används för att övervaka gnagare xenograft tumörer, kan relativa antalet livskraftiga celler observeras i hydrogel kulturer under behandlingens gång. Figur 3B innehåller ett exempel på denna metod, där effekterna av erlotinib behandling på hydrogel-odlade GBM celler utvärderades under 6 dagar. Hydrogel kulturer kan i allmänhet behandlas som vävnadsprover när du förbereder lysates för Western blot och PCR. Western blot analys av klyvs poly ADP polymeras indikerar att relativa grad av apoptos i behandlade CD44 knockdown cellerna är högre än vildtyp GBM celler odlade i 0,5% HA hydrogels ()figur 3 c). På samma sätt, enda cellsuspensioner kan framställas från hydrogel kulturer för analys via flödescytometri med standardprotokoll för befriande enstaka celler från intakta vävnader (figur 2). Förutom funktioner som cellen bevara kryosnitt av hydrogel-baserade, 3D kulturer ECM deponeras av odlade celler. Till exempel nedfall mönster av typ IV kollagen Skift vid erlotinib behandling av hydrogel kulturer (figur 3D).
Figur 1 : Representant H 1 -NMR spectrumen av thiolated hyaluronsyra. Integrerad topparna indikerar att cirka 5% av HA glukuronsyra sura grupper har ändrats med en tiol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Spridning av hydrogel-inkapslat celler. (A) exempel bilder av påhittade 80 µL geler i 12 brunnar. Efter crosslinking, var hydrogels svullna i cellodlingsmedium. (B) representativa resultat av spridning uppmätt med flödescytometri. GBM celler (HK301) inkuberades med 1 µM EdU (5-ethynyl-2′-deoxiuridin) för 2,5 h på den fjärde dagen efter inkapsling eller passaging. En klicka-reaktion användes till konjugat fluorescerande färgämne till bolagiserade EdU, som beskrivs i Xiao et al. 2017.3 negativa kontroller, där ingen EdU lades till kulturer, ingick. (C) representant konfokalmikroskopi bilder av live (grön) och döda (röd) celler 24 timmar efter hydrogel kulturer av GBM celler (HK157) var etablerat. Skala barer = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Karakterisering. (A) representativa fas bilder av 0,5% (w/v) HA hydrogel-odlade celler under varierande förhållanden för 8 dagar efter inkapsling i kontrast. Pilarna anger celler med en invasiv morfologi. (B) representativa bilder av Mareld signal mätas efter 15 dagars behandling med 1 µM erlotinib eller fordon (DMSO). 1 mM D-luciferin lades till cellodlingsmedium 1 h före imaging. Cellerna var sensorik med lentivirus kodning för konstitutiva uttryck för firefly luciferas innan inkapsling. (C) representant immun-blot bilder analysera avspjälkar poly ADP polymeras (cl-PARP) uttryck i GBM celler (HK301) odlade i hydrogels med 0,5% (w/v) HA och 1 kPa tryckhållfasthet modulus. Alla beskurna bilderna var från samma blot. (D) representativa färgning av kollagen IV (grön) och Hoechst 33342 (blå) i hydrogel-odlade HK301 celler 12 dagar efter behandling med 1 µm erlotinib eller fordon (DMSO). Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Gel typ | Del ett (40 µL varje) | Del B (40 µL varje) | ||||
| 4Arm-PEG-MAL (50mg/mL) | Cystein eller RGD (2,81 mM) | PBS (pH 7,4) | 4Arm-PEG-tiol (50mg/mL) | PBS (pH 7,4) | HA-S (13,3 mg/mL) | |
| 0,5% (w/v) HA 1kPa | 10 ΜL | 4.00 ΜL | 26 ΜL | 1.00 ΜL | 9.00 ΜL | 30,0 ΜL |
| 0,5% (w/v) HA 2kPa | 20,0 ΜL | 4.00 ΜL | 16,0 ΜL | 8.00 ΜL | 2.00 ΜL | 30,0 ΜL |
| 0,1% (w/v) HA 1kPa | 10 ΜL | 4.00 ΜL | 26 ΜL | 8.00 ΜL | 26,0 ΜL | 6.00 ΜL |
Tabell 1. Hydrogel formuleringar ger oberoende kontroll HA koncentration och mekaniska egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generering av reproducerbara data med detta 3D kultur system kräver: 1) konsekvent sats till sats thiolation ha, 2) praxis för att uppnå effektiv blandning av hydrogel prekursorer och hantering av hydrogel kulturer för att förhindra skador och 3) optimerad sådd densitet för varje cell linje används.
När en viss viktprocent av HA önskas i hydrogel, avgör graden av thiolation av HA crosslink densitet. Vi rekommenderar att du använder en konsekvent mängd HA för varje thiolation reaktion för att minimera sats till sats variation. Vi föreslår att minst 300 mg av HA användas för varje thiolation reaktion så att samma parti av thiolated HA kan användas för flera experimentella repetitioner. Molar förhållandet av tioler till maleimide grupper på 4-arm PEG bör alltid vara 1.1:1 att säkerställa maximal crosslinking effektivitet. Således, om graden av thiolation är varierad, då mängden PEG-Mal lagt till måste justeras. När peptider är konjugerat till maleimides före gel bildandet, måste det uppskattade antalet PEG armar med uppbundna peptider subtraheras från det totala antalet tillgängliga maleimides för denna beräkning. Dessutom rekommenderar vi att graden av HA thiolation under 10-15% att undvika disulfide bond bildas som hindrar upplösning och konsekvent gelation.
Michael-typ tillägg reaktionen mellan thiol- och maleimide säkerställer att gelation uppstår i under en minut. Medan detta snabb gelation minimerar mängden tid celler upphängd i hydrogel prekursorer är utan komplett medium, som kan äventyra deras livskraft, kräver inkapsling processen erfarenhet med alla pipettering och blandning åtgärder för att uppnå reproducerbara resultat. Vi har vanligtvis nya praktikanter öva flera omgångar av gelation utan celler innan du utför ”riktiga” inkapsling experiment.
Två faktorer kan finjusteras för att modulera gelation hastighet: reaktion temperatur och föregångaren pH. Sänka reaktion temperatur genom att placera den väl plattan på is under omrörning saktar reaktionen och ger större tid att blanda föregångare lösningar. Detta måste dock göras under sterila förhållanden med korrekt aseptisk teknik. Likaså kan pH i föregångaren lösningar ändras för att öka eller minska reaktionstiden med högre eller lägre pH, respektive. Eftersom thiolated HA är dialyseras mot surt vatten att förhindra disulfide bond bildning, kommer att ombildade thiolated HA ge lägre pH än annars kan förväntas. I allmänhet beredning i 20 mM HEPES i HBSS buffert, justerad till pH 9, kommer att ge ett pH nära 7 när 15 mg/mL thiolated HA (~ 5% thiolated) är upplöst. Vi rekommenderar att du använder pH 6,8-7 thiolated HA lösningen att tillåta även blanda gellösningen samtidigt maximera cell hälsa.
Seedning densitet under inkapsling är kritisk för cellulära livskraft och experimentell reproducerbarhet. Vi rekommenderar att sådd i intervallet 100 000 till 2 000 000 celler/mL. Vi har funnit att detta intervall är optimal för livskraften i de flesta celltyper samtidigt förhindra över-konfluens inom en experimentell tidsperiod på minst 3 veckor. Det ursprungliga sådd densitet som optimerar lönsamhet bör bestämmas experimentellt för varje celltyp som används.
Extrem försiktighet iakttas när du ändrar cell mediet för att undvika skadliga hydrogel kulturer. Särskilt ta hand inte för att aspirera hydrogel i pipetten. Således inte använder vakuum aspiration och i stället använda sterila pipett för att aspirera manuellt. Ändra bara halva mediet i en kultur väl i taget kan också hjälpa.
I allmänhet kräver denna teknik praxis att uppnå nödvändig fingerfärdighet och konsekvens. När en lab-specifika protokoll har upprättats kan systemets 3D kultur forskaren använda många metoder för karakterisering som typiska för cellodling och explanterad vävnader. Här har vi beskrivit flera tekniker för analys, inklusive immunofluorescens, flödescytometri, western blotting och Mareld avbildning av levande, 3D kulturer (figur 2-3). För mer detaljerade protokoll karakterisering metoder, se Xiao et al. 20173. Slutligen HA/PEG hydrogeler är optiskt transparent, kan standard ljusmikroskopi tekniker, inklusive confocal imaging, användas att övervaka live, 3D kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds med finansiering från NIH (R21NS093199) och den UCLA ARC 3R's Award. Vår uppriktiga tack till labbet av Dr. Harley Kornblum för tillhandahållande av HK301 och HK157 cellinjer. Vi tackar också UCLA vävnad patologi Core laboratorium (TPCL) för kryosnitt, avancerade ljus Microscopy/spektroskopi core facilitet (ALMS) i California Nanosystems Institute (CNSI) vid UCLA för användning av confocal mikroskopet, UCLA Crump Institutet för Molekylär avbildning för att använda IVIS bildsystem, UCLA molekylär Instrumentation Center (MIC) för att tillhandahålla magnetisk resonans spektroskopi och flöde flödescytometri Core i Jonsson omfattande Cancer Center (JCCC) vid UCLA för att tillhandahålla instrumentering för flödet flödescytometri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
References
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3d culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Holland, E. C.
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006 - 2010. Journal of Neuro-Oncology. 15 (6), 788-796 (2013).
- Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (6), 1046-1069 (2004).
- Zamecnik, J. The extracellular space and matrix of gliomas. Acta Neuropathologica. 110 (5), 435-442 (2005).
- Jadin, L., et al. Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors. Annals of translational medicine. 3 (6), (2015).
- Park, J. B., Kwak, H. J., Lee, S. H.
- Pedron, S., et al. Spatially graded hydrogels for preclinical testing of glioblastoma anticancer therapeutics. MRS communications. 7 (3), 442-449 (2017).
- Jiglaire, C. J., et al. Ex vivo cultures of glioblastoma in three-dimensional hydrogel maintain the original tumor growth behavior and are suitable for preclinical drug and radiation sensitivity screening. Experimental cell research. 321 (2), 99-108 (2014).
- Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
- Day, A. J., Prestwich, G. D. Hyaluronan-binding proteins: tying up the giant. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 4585-4588 (2002).
- Wiranowska, M., Tresser, N., Saporta, S. The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro. Anticancer Research. 18 (5A), 3331-3338 (1998).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. GLIA. 59 (8), 1169-1180 (2011).
- Gilg, A. G., et al. Targeting hyaluronan interactions in malignant gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors. Clinical Cancer Research. 14 (6), 1804-1813 (2008).
- Misra, S., Hascall, V. C., Markwald, R. R., Ghatak, S. Interactions between hyaluronan and its receptors (CD44, RHAMM) regulate the activities of inflammation and cancer. Frontiers in immunology. 6, 201 (2015).
- Varga, I., et al. Expression of invasion-related extracellular matrix molecules in human glioblastoma versus intracerebral lung adenocarcinoma metastasis. Zentralblatt fur Neurochirurgie. 71 (4), 173-180 (2010).
- Guo, W., Giancotti, F. G. Integrin signalling during tumour progression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 816-826 (2004).
- Bello, L., et al. αvβ3 and αvβ5 integrin expression in glioma periphery. Neurosurgery. 49 (2), 380-390 (2001).
- Chamberlain, M. C., Cloughsey, T., Reardon, D. A., Wen, P. Y. A novel treatment for glioblastoma: integrin inhibition. Expert review of neurotherapeutics. 12 (4), 421-435 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Oh, Y. T., et al. Translational validation of personalized treatment strategy based on genetic characteristics of glioblastoma. PloS one. 9 (8), e103327 (2014).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. C. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
- Zhu, J. Bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 31 (17), 4639-4656 (2010).
- Stern, R., Asari, A. A., Sugahara, K. N. Hyaluronan fragments: an information-rich system. European journal of cell biology. 85 (8), 699-715 (2006).
- Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Ellman's reagent: 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination. Analytical biochemistry. 94 (1), 75-81 (1979).
- Jin, R., et al. Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) hydrogels via Michael addition: An injectable biomaterial for cartilage repair. Acta biomaterialia. 6 (6), 1968-1977 (2010).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of visualized experiments. 41, 3-7 (2010).
