Summary
ここでは、脳マトリックスを模倣するように設計された直交可変生体内神経膠芽腫患者由来細胞の三次元培養のためのプロトコルを提案する.このアプローチは、生体外で、通常文化で失われた神経膠芽腫細胞体内の多くの特徴を維持する実験のプラットフォームを提供します。
Abstract
膠芽腫 (GBM) は、最も一般的なまだ最も致命的な中枢神経系のがんです。近年、多くの研究は、GBM 進行と侵略のヒアルロン酸 (HA) など、ユニークな脳環境の細胞外マトリックス (ECM) の容易に焦点を当てています。ただし、ほとんどの in vitro培養モデルは、ECM のコンテキスト外にある糸球体基底膜セルを含めます。糸球体基底膜細胞のマウス異種移植片、一般的にも使用されます。生体内でモデルを腫瘍の挙動に複雑な腫瘍微小環境の個々 の機能の貢献を分離することは困難に作る。ここでは、研究者 HA 濃度と剛性を個別に変更することができる HA ハイドロゲルを用いた、三次元 (3 D) 文化プラットフォームについて述べる。高分子量 HA とポリエチレング リコール (PEG) は生きているセルの存在下でミハエル機追加を通して架橋ゲルを構成します。三次元ハイドロゲル培養患者由来 GBM 細胞展示生存と増殖率として、またはそれ以上のとき、培養として標準的な gliomaspheres。ハイドロゲルは ECM 擬態ペプチド相互作用特定セル ECM の効果を分離するための設立も実現します。ゲルは、生きた細胞三次元培養で視覚化されるように光学的透明です。最後に、HA ハイドロゲル文化は、分子・細胞解析、PCR、西部にしみが付くこと、セクショニング蛍光染色により観察が続くなどの標準的な技術と互換性があります。
Introduction
三次元 (3 D) 培養システムは、ネイティブ組織よりも、二次元 (2 D) 対応1,2セルとその周辺の細胞外マトリックス (ECM) との間の相互作用を要約します。組織工学の進歩は、新しい制御マトリックス微小環境に影響を与える細胞の挙動と 2) の有効性の調査 1) 化学および物理コンポーネントを有効にする、3 D の高度な文化のプラットフォームを得られている治療多くの病気、癌2を含むための戦略。体外モデル内分泌及び免疫能の信号などの全身的要因のアカウントできません、したがって体内モデルを置き換えることはできません完全に、彼らは再現性、実験コントロールを含むいくつかの利点を提供します。手頃な価格と速度です。ここでは、3 D で患者由来脳腫瘍細胞の培養が腫瘍生理、特に治療抵抗3を獲得の原動力の多くの側面をキャプチャ脳模倣ヒドロゲルの使用について述べる。これらの文化はより生体内で腫瘍モデルと臨床的観察3を表す他の方法と比べて。
膠芽腫 (GBM) は、わずか 1 〜 2 年4、5の生存期間中央値で、脳で発生した最も頻繁に、致命的ながんです。近年、多くの研究は、腫瘍 GBM6,7,8マトリックス環境の影響に焦点を当てています。ユニークな脳 ECM は、GBM 細胞遊走・増殖・治療抵抗6,7,8,9,10,11に影響を与えると報告されています。,12. ヒアルロン酸 (HA) は、他のギャグと対話するハイドロゲルのような形のためのプロテオグリカン メッシュ13脳豊富なグリコサミノグリカン (GAG)。多くの研究は、GBM の腫瘍における HA の過剰発現と癌の進行8,9,13,14,15,16、それ以降の効果を報告しています。 ,17。他の ECM の部品には、糸球体基底膜腫瘍増殖および浸潤6,7,15,18も影響します。たとえば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、糸球体基底膜に過剰に発現している通常、「rgd」へのバインディングを介して細胞表面のインテグリン受容体 heterodimerization を誘発腫瘍の生存19 を促進する複雑なシグナル伝達カスケードを開始 ,20,21。組織のマトリックスの物理的性質は生化学的な影響のほか、糸球体基底膜の進行22,23も影響します。
治療に抵抗性の継続的な獲得は、GBM 致死率4の主な要因の 1 つです。2D または gliomasphere モデルの有望な結果を示す薬物は、その後の動物の研究と臨床例3を示す樹状細胞の効果は、GBM の腫瘍の応答1に著しく貢献した失敗しています。動物モデルは、3 D を提供できますが、生理学的に異種の患者細胞の微小環境を適切なし、臨床的に関連性の高い結果24,25, 脳微小環境、生体内での複雑さを生成機能、細胞マトリックスの相互作用を含む特定する主要な生物学的成果を決定するために挑戦になります。新しい治療標的の同定は生化学的および生物物理プロパティが定義されている簡略化された文化のプラットフォームを使用しての恩恵を受ける。
ECM、生体材料プラットフォームの個々 の生化学的および物理的な機能を真に直交制御を達成していない GBM の腫瘍微小環境26,27以前に報告した生体材料のモデルとは異なりここを有効に報告されたは、GBM 細胞表現型に複数の独立した機能の貢献のデカップリング。GBM 患者由来細胞の 3次元培養用 HA ベース、直交可変ハイドロゲル システムを紹介します。ヒドロゲルは二成分ポリマーから形成される: 1) 生理活性 HA、2) 生物学的に不活性ポリエチレング リコール (PEG)。ペグは、低蛋白質の吸着と最小限の免疫原性28広く使用されている生体適合性と親水性材料です。ここで、HA 鎖グルクロン酸基の約 5% は市販 4-腕-ペグ ミハエル機追加を通してマレイミドと終了する架橋結合を有効にするチオール基と官能基化します。体の最も一般的な形式として、HA は高分子量分画法のチェーンに存在します。ここでは、HMW HA (500-750 kDa) の変更の度に HA とその細胞の受容体、CD4429を含むネイティブ相互作用を維持するために役立ちます。置き換えて PEG チオール HA チオールのマレイミドに総チオールの一定モル比を維持しながら、結果として得られるゲルの力学特性から HA 濃度を切り離すことができます。さらに、定義された平均数各 4 腕ペグ マレイミド化武器にペプチドのシステインで終わるを共役に理論空燃比のコントロールを使用できます。ECM から派生した、接着性ペプチドの設立により、生化学的・化学的信号が導入された1細胞のインテグリンとの相互作用。マレイミド チオール添加は、電池封止材と患者由来細胞の生存を最大にするために必要な時間を最小限に抑え、生理条件下で非常に迅速に発生します。また、ハイドロゲル文化は典型的な組織標本のような扱うことができる、西部にしみが付くこと、フローサイトメトリー、蛍光染色など標準的な技術と互換性が。次のプロトコルでは、ハイドロゲル、GBM 患者由来細胞と生化学分析のための技術の 3 D の文化の確立を製造するための手順について説明します。
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Protocol
人間の組織コレクションのすべての手順は制度上承認されたプロトコルの下で行われました。
1. ヒアルロン酸なチオール化
注: 特に明記しない限り、モル比がカルボキシル基の合計数に関する記載をしています。
- 脱、蒸留水 (式行先方向2O) オートクレーブ滅菌、250 mL 三角フラスコに 10 mg/ml ヒアルロン酸ナトリウム (HA、500-750 kDa) の 500 mg を溶解します。HA を完全に溶解する 2 時間室温で攪拌ソリューション (~ 200 rpm)。なチオール化処理中に攪拌反応を維持するのに攪拌棒及び電磁攪拌プレートを使用します。
- 0.1 M 塩酸 (HCl) を使用して、5.5 HA 溶液の pH を調整します。69.6 mg (モル比 × 0.25) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド (EDC) の重量を量り。
注: 不溶 EDC は、HA ソリューションに直接追加できますが、通常式行先方向2O の mL の 1 にまず EDC を溶解し、HA ソリューションに EDC ソリューションをすばやく追加する簡単です。前の解散式行先方向の 1 mL 中2O もできる N ヒドロキシスクシンイミド (NHS) とシスタミン dihydrocholoride 1.3 と 1.4 の手順で反応を追加する前に。 - 反応する NHS の 17.9 mg (モル比 x 0.125) を追加します。5.5 0.1 M HCl を使用して反応液の pH を調整し、45 分間室温で反応を孵化させなさい。
- 反応液にシスタミンの塩酸の 70.0 mg (モル比 × 0.25) を追加します。6.25 に pH 調整に 0.1 M 水酸化ナトリウム (NaOH) を使用します。一晩攪拌しながら室温で反作用を孵化させなさい。
- 次の日、約 8 に反応液の pH 調整に 1 M 水酸化ナトリウムを使用します。反応に 192 mg (モル比 x 4) ジチオトレイトール (DTT) を追加します。1-2 時間室温で攪拌を残すし、DTT の付加の後で 8 に pH を調整します。
- 4 pH 調整に 1 M 塩酸を使用します。漬け透析膜 (境界線は分子量 13 kDa 前後) に全体の反応混合物を転送し、dialyze 式行先方向に対して2O は、Ph4 に調整済み。
注: 式行先方向2O 透析量は少なくとも 40 回反応 HA ソリューション (式行先方向2O、pH 4 の 2 L に 50 mL のサンプルなど) の量をする必要があります。 - 二度毎日室温で 3 日間の (式行先方向2O、pH 4) 透析液を交換します。
- 0.22 μ m 膜、真空ポンプ式フィルターを通って透析ソリューションをフィルター処理します。フラッシュは、液体窒素中でのチオール HA ソリューションをフリーズします。2 日間にわたって乾燥試料を凍結するのに、エアカーテンを使用します。チオール HA 乾燥した形で保存できます-20 ° C で真空デシケータに少なくとも 6 ヶ月間。
- なチオール化の程度を決定するには、Ellman テストおよび/またはプロトン NMR 分光法30,31を使用します。
2. 架橋材料の準備
- 周囲の光への露出を最小限に抑えるため黄色瓶で HEPES 緩衝生理食塩水 (20 mM HEPES ハンクのバランスの取れた塩食塩水 (HBSS) バッファー、8-9 の pH に調整) (この例では、13.3 mg/mL) に必要な濃度で HA チオールを溶解します。かき混ぜソリューションをしてください。
注: pH が 8 以上、溶液濃度が高すぎるまたはゲル化前に長すぎるため攪拌ソリューションが残っている場合、HA に共役のチオール基間のジスルフィド結合形成する場合があります。この問題を避けるためには、チオール HA の 15 mg/mL 以下使用し、ヒドロゲルを形成の 2 時間以内チオール HA を溶解します。 - 4-腕-ペグ-マレイミド (ペグ マル、20 kDa) と 4-腕-ペグ-チオール (PEG チオール、20 kDa) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.4 では、PEG マルと PEG チオール溶液 50 mg/mL を準備するを解消します。
注: それは完全にペグの試薬を溶解するため、少なくとも 1 時間かかります。 - ECM 由来ペプチドを追加するには場合、は、ストック溶液を調製する PBS のシステインを含むペプチドを溶解します。
注: は、ストック濃度 2 〜 4 mM を使用します。 - ソーク シリコーンゴム金型それらをきれいする少なくとも 20 分とし、オートクレーブ用エタノールでそれらの殺菌のため。
3. ゲルの架橋と電池封止材
注: 例としてここでは、4 つの個人、0.5% (w/v) ハ 80 μ L のゲルと 1 kPa の圧縮弾性率のカプセル化は記述されている3。さまざまなプロパティを持つハイドロゲルをもたらす例のレシピの表 1を参照してください: インテグリン結合ペプチド RGD を組み込む 2 つのゲルおよびペプチドの活性のネガティブ コントロールとしてシステイン キャップを組み込む 2 つのゲル。GBM 患者由来細胞の濃度をシードは、500,000 細胞/ml です。
- 120 μ L の PBS に原液の 40 μ L を追加することで 12.5 mg/mL にペグ マル原液 (50 mg/mL、2.2 の段階から) を希釈します。2 つの 1.5 mL 遠心チューブに希釈した溶液を分割各チューブがある 80 μ L。
- 株式 RGD 解決 (2.8 mM、ステップ 2.3 から) 1 つの管の 16 μ L と 2 番目の管にストック システイン ソリューション (ステップ 2.3 からは 2.8 mM) の 16 μ L を追加します。ミックスする渦。3.9 の手順で使用するまで、氷の上ペグ マル RGD またはペグ-マル-システインのソリューションを配置します。
メモ: ペプチドの ~ 140 μ m 利回りヒドロゲルをここで説明したプロシージャ。これはペプチドと占領されてすべての 8 使用可能なペグ腕から約 1 と同じです。これは、利用可能なマレイミド グループにペプチドのシステイン終了のモル比を変えることによって変えることができます。一般に、ペプチドの 280 μ M の最大濃度は、マレイミド架橋ハイドロゲルで利用できるグループの十分な数を残しつつ実現できます。 - 5 mg/mL に PEG チオール原液 (50 mg/mL、2.2 の段階から) を希釈すると、36 μ L の PBS を 50 mg/mL の 4 μ L の原液を混合することによって。ステップ 2.1 から溶存、チオール HA の 120 μ L を混合物に追加します。
注: HMW ha ソリューションは非常に粘性します。したがって、全体オリフィス マイクロ ピペット チップを使用してソリューションを転送することをお勧めします。ピペット ソリューション マイクロ ピペット チップの壁に付着を避けるためにゆっくりと測定精度を向上させる。 - 組織培養処理 12 ウェル プレートの各ウェルに清潔で乾燥した金型 (2.4 の手順で準備) を配置します。ピペット チップのクリーン、鈍端を使用して、ゲルの金型と金型とウェル プレートの下部とのダブル チェック封を押します。
注: は、漏れを防止するカプセル化の前にもう一度シールを確認します。 - 細胞糸球体基底膜を通過、単一のセルに分離および細胞濃度が3を前述の決定します。
注: いくつかの GBM の行は、単一のセルに解離ことはできません。この場合、全体の gliomaspheres をカプセル化できます。ただし、再現性を改善するために正確なセルをカウント後解離の単一細胞を準備します。Gliomasphere 通過のためのプロトコルは別の研究室によって異なりますこれらの多く、ハイドロゲル カプセル化対応の可能性が高いです。- (推奨)500 x g で 5 分間の遠心 gliomaspheres は上澄みを除去し、細胞ペレットに細胞解離酵素の 1 つの mL を追加します。その後、扇動するためにチューブをやさしくタッピング 5 分間インキュベートします。
- セルに完全培地 (50 ng/mL EGF、DMEM/f12 キーで 20 ng/mL 25 μ g/mL のヘパリン、G21 サプリメント 1% ペニシリン/ストレプトマイシン FGF-2) の 4 つの mL を追加します。
- 再び 5 分間 500 × g で遠心し、上清を削除します。最後に、1 mL の完全培地で細胞ペレットを再懸濁します、70 μ m の細胞ストレーナーを浮遊細胞を通過します。(推奨) 洗浄セルの数を最大にする完全な媒体の追加 4 mL でストレーナーが回復しました。
- 細胞診断を使用して懸濁液中の濃度を推定します。各チューブが 〜 80,000 のセルを含む 2 の遠心チューブに細胞懸濁液を分割します。5 分; 500 × g で遠心分離します。一般的に、80,000 セル 2 80 μ L ヒドロゲルを構成します。
- 上澄みを除去し、PEG マル RGD ソリューションの 80 μ L で 1 ペレットとペグ-マル-システイン溶液の (3.1 の手順で) 80 μ L で 2 番目のペレットを再懸濁します。
- 200 μ L、ワイド オリフィス マイクロ ピペット チップを使用して、(3.4 の手順で準備)、各ゴム シリコーン型に (上記の手順 3.3) から HA ソリューションの 40 μ L を調剤します。
- 200 μ L、ワイド オリフィス マイクロ ピペット チップを使用して、ペグ-マル-システインのペグ マル RGD 細胞液金型で HA の 40 μ L をミックスします。すぐに 10 倍以上ないピペットを上下。準備されているゲル カルチャごとに繰り返します。
注: この手順、初期ゲル化がすぐに発生するので、練習 (30 秒)。上下のピペット先端をも混合できるように金型の別の場所に移動しながら。空気の泡の形成を避けるために液面下先端を常に保ちます。混ぜないでソリューション ゲルのピペット内部形式を取得ことがあります、何度もヒントを行います。ペグ-マル-システインとペグ マル RGD 希望 RGD ペプチド濃度を達成するために様々 な比率で組み合わせて使用できます。 - 反応の完了を確認する 5 〜 10 分の 37 ° C 細胞文化のインキュベーターにゲルでカプセル化されたセルを含むウェル プレートを配置します。
- 形成されたゲルの各ウェルに培地の 2 〜 2.5 mL を追加します。カビやゲルを優しく、滅菌、2 μ L ピペット チップやマイクロ-ヘラを使用します。ウェル プレートから、金型を削除するのに鉗子を滅菌済みを使用します。セル インキュベーター (37 ° C、5% CO2) 文化と未来の実験のために戻るウェル プレートを配置します。
注: は、ゲル培養の害を避けるために上へ垂直に金型を引き出します。一般に、ゲル培養における培地ごとに 3-4 日を置き換える必要があります。メディアを削除するときにゲルを吸引しないように注意してください。これは問題です、プラスチック転送ピペットを使用してお勧めします。発光セルの数を追跡するイメージングが予定されている場合とエンコード恒常前述3として、カプセル化する前にルシフェラーゼ発現レンチ増殖型 GBM 細胞する必要があります。生物発光イメージング培養培地 1 時間発光イメージング前に D-ルシフェリンの 1 mM を追加します。
4. ウェスタンブロッティング用試薬
- 氷上 (ゲルのサンプルあたり 1) 1.5 mL 遠心管を冷やします。4 ° C にクールな遠心
- ウェル プレートからメディアを削除します。Prechilled マイクロ遠心チューブ用にゲルを転送します。
- 1 x プロテアーゼ/ホスファターゼの抑制剤、RIPA バッファーの 100 μ L を追加します。
- ゲル 20 G 針を 1 mL の注射器を使用して、分割に少なくとも 20 回の針を通して全体の混合物を押すことによって取得します。
- スピン ベンチ トップ遠心とサンプルが氷の上に戻って配置を使用してサンプルをフラッシュします。
- 渦は、簡単にすべて 5 分の合計 20 分のサンプルします。
- 4 ° C で 15 分 14000 × g で遠心分離機サンプル
- 上清を新しい、事前に冷やしたマイクロ遠心チューブ用に転送し、-20 ° C (短期) で格納または-80 ° c (長期)。前述3として標準的な手順を使用して電気泳動を行います。
5 フローサイトメトリー用ハイドロゲル文化から単一セルの抽出
- 1.5 mL 遠心チューブに (ステップ 3.11) からゲル文化を媒体と転送を削除します。
- 500 μ L の解離細胞の酵素を (例えば、 TrypLE エクスプレス) 37 ° C 5 分、時折扇動するためにチューブをフリックでゲルを孵化させなさい。
- 完全培地 5 mL を 50 mL の遠心管に混合物を転送します。氷の上には、チューブを配置します。
- 20 G 針を 10 mL のシリンジを接続します。慎重に引き出します細胞懸濁液を上下をとおして 8 回。
- 新しい 50 mL 遠心管に 70 μ m 携帯こし器を通して混合物を流れます。任意の残りの細胞を収集するストレーナーを介して追加の 5 mL の完全培を適用します。
- 400 x g でサンプルを遠心分離機 5 分、上清を除去し、(使用する標準プロトコル3) フローサイトメトリー用バッファーでペレットを再懸濁します。
6. 区分のためのゲルの凍結保存
- ゲルの文化 (ステップ 3.11) からメディアを削除します。
- 4 ° C で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 2 ml ゲル培養を一晩インキュベートします。
注意: PFA は毒性があり慎重に処理する必要があります。 - 次の日には、PFA を削除します。ゲルに PBS で 2 mL 5% ショ糖を追加し、室温で 1 時間インキュベートします。
- 2 ml の PBS で 20% ショ糖の 5% ショ糖液を交換し、30 分間インキュベートします。
- 2 ml の PBS 新鮮な 20% のショ糖のショ糖液を交換、追加 30 分間インキュベートします。
- 3 回 2 ml の PBS 新鮮な 20% のショ糖のショ糖液を交換してください。4 ° C で一晩インキュベートします。
- 最適な切削温度 (OCT) 化合物 20% のショ糖を準備します。
メモ: 10 月の粘度によるスクロースの分解がかかるいくつか (夜間) 最大時間。撹拌を維持するために解散時にシェーカーに混合物を置くことをお勧めします。 - 次の日は、20% のショ糖液を削除し、優しくゲル上 10 月ソリューションで 20% ショ糖を注ぐ。全体のゲルをカバーすることを確認します。4 ° C 3 時間で孵化させなさい。
- フラットで大規模なへら; を使用して埋め込み型の中心にゲルを転送します。これは、ゲルの損傷を避けるために慎重に行う必要があります。
- ドライアイスの過剰とチャンバー内クールな 2 methylbutane。
- 純粋な 10 月 (ないショ糖) と埋め込み型を入力します。金型の上端のすぐ下を入力します。
- 浸漬冷却 2 methylbutane でゲルのサンプルを凍結し、断面に進みます。
- クライオスタット; を使用してサンプルのセクション10-18 μ m の切片厚と-26 ° C 程度のセクショニング温度をお勧めします。
- 前述3として断面ゲル文化に関する標準的な免疫染色の手順を実行します。
注: 刺激および発がん性物質、PFA は知られています。処理、PFA をローカル規格や規制に従って処分してください。
7 ハイドロゲルのサンプル総 RNA の抽出
注: ここで述べるはコマーシャルを使用してプロトコル (材料の表を参照) をハイドロゲル培養細胞からの総 RNA を抽出するキットです。使用キット内のバッファーおよびすべての素材があります。
- 培を削除します。ワイドボア チップ P1000 転送ピペットを使用して、1.5 mL 遠心チューブにハイドロゲル文化を転送します。
- ハイドロゲル文化にバッファー RLT の 350 μ L を追加します。
- 1 mL の注射器に取り付けられた 20 G 針を使用して、少なくとも 20 回の針を通して全体の混合物を押すことによりゲルを細断処理します。
- 2 mL 採取管は、ホモジナイザー列に全体の混合物を転送します。2 分 13,000 × g で遠心分離機します。
- きれいな 1.5 mL 遠心チューブに上清を移します。下部に沈殿物のゲルを邪魔しないように注意します。
- 100% エタノールの 350 μ L でライセート サンプルをミックスします。すべてのサンプルを 2 mL コレクション チューブでスピン (キット) から列の場所に転送します。13,000 × g で 1 分間遠心します。
- PCR のための RNA の浄化の後のステップのキットの製造業者によって提供される一般的なプロトコルに従ってください。
注: RNA を抽出すると、一度 PCR のための標準のプロトコルを使用できます。
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Representative Results
チオール HA の各バッチの1H-NMR または・ イールマンのテストを使用してなチオール化の程度を確認する必要があります。ハ一貫してここで説明されている手順を使用して変更の ~ 5% なチオール化 (ハ二糖類にチオール基のモル比として定義) が生成されます(図 1)。
この新しい文化のプラットフォームの設定は、大規模な実験を実施する前に良い文化の生存を確保するための厳格なテストを実行する各研究室を必要があります。私たちの 80 μ L ヒドロゲル、播種密度 500,000 細胞/ml (40,000 セル/ゲル) と一貫して、同等またはより、gliomasphere 文化(図 2 a-2 C)増殖率の結果します。HA/ペグとしてハイドロゲルが光学的に透明な細胞の挙動観察できる位相コントラストや蛍光顕微鏡を使用するカルチャのライブ、3 D に直接。図 3 aは、カプセル化後、4 日 RGD 含有ヒドロゲルの GBM 細胞展示侵襲的表現型、ハイドロゲル培養細胞中ペグ-マル-システインを使用してコントロール球状形態。
研究者が日まで埋め込まれた腫瘍に達する進歩的な成長24,32ヶ月を待つ必要がありますどこの xenograft モデルで典型的なよう患者由来細胞はまた新しい文化環境を調整する時間を取る。したがって、実験では, 大部分の細胞が指数関数的成長段階に入ったことを確認するための薬物治療などを開始する前に 4-8 日の培養をお勧めします。薬物治療を超えて可溶性シクロ-RGD のような競争力のあるゲルの RGD と細胞の相互作用を混乱させる、試薬は培養培地(図 3 a)に追加できます。
ハイドロゲル体制は、グリオーマ細胞生物学を調査するための多くの一般的な方法と互換性が。齧歯動物の異種移植腫瘍を監視する一般的に使用される生物発光イメージングを使用して実行可能なセルの相対数を治療の過程でハイドロゲルの文化で観察できます。図 3 bは、ハイドロゲル培養 GBM 細胞に対するエルロチニブ治療の効果は 6 日間に行った、このメソッドの例を示します。一般に、ハイドロゲル文化は西部のしみまたは PCR の lysates を準備するとき、組織サンプルとして処理できます。劈開ポリ ADP ポリメラーゼの西部のしみの分析は、扱われた CD44 ノックダウン細胞におけるアポトーシスの相対的な度合いが HA ヒドロゲル(図 3)0.5% で培養した野生型糸球体基底膜の細胞よりも高いことを示します。同様に、フローサイトメトリー解放そのまま組織 (図 2) から単一のセルの標準的なプロトコルを使用してを介して分析、ハイドロゲルの文化から単一細胞懸濁液を用意できます。細胞機能に加えてハイドロゲルを用いた、3 D 文化の凍結切片培養細胞により作製した ECM を保持します。たとえば、ハイドロゲル文化(図 3 D)のエルロチニブ治療タイプ IV コラーゲン変化のパターンを蒸着。
図 1:代表 H1チオール ヒアルロン酸の核磁気共鳴スペクトル。統合されたピークは、チオールと HA グルクロン酸基の約 5% が変更されていることを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:ハイドロゲル カプセル化細胞の増殖します。12 ウェル プレートで作製した 80 μ L ゲルの例 A) 画像。架橋結合の後ヒドロゲルは細胞培養液で腫れていた。増殖率の B) 代表の結果は、フローサイトメトリーを用いて測定。1 μ m GBM 細胞 (HK301) 培養カプセル化または通過後 4 日に 2.5 h のエドゥ (5-エチニル-2 '-デオキシウリジン)。クリック反応は共役暁らの詳細として、法人のエドゥに蛍光染料に使用されました。2017。 どこの文化にエドゥは追加されません、3否定的なコントロールが含まれていた。C) 代表共焦点顕微鏡画像のライブ (緑) と死者 (赤) 細胞糸球体基底膜細胞 (HK157) のハイドロゲル培養が確立された後 24 時間。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: キャラクタリゼーション。止後 8 日間のさまざまな条件の下で 0.5% (w/v) HA ハイドロゲル培養細胞の A) 代表的な位相コントラスト画像。矢印は、侵襲的な形態を持つ細胞を示しています。発光信号 B) 代表的な画像は、1 μ M エルロチニブまたは車両 (DMSO) 治療の 15 日後測定。1 mM D-ルシフェリンは細胞培養培地 1 h のイメージ作成前に追加されました。セルがレンチ ウイルスのカプセル化の前にホタルのルシフェラーゼ発現のエンコーディングで導入しました。C) 代表免疫ブロット画像分析は、ポリ ADP ポリメラーゼ (PARP-cl) 式 GBM 細胞 (HK301) 培養 0.5% (w/v) HA ゲルおよび 1 kPa の圧縮弾性率に切断。すべてトリミング同じしみから示されている画像があった。1 μ m エルロチニブまたは車両 (DMSO) による治療後のコラーゲン IV (緑) とヘキスト 33342 (青) ハイドロゲル培養 HK301 細胞 12 日の D) 代表的な染色スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ゲル型 | 一部、(40 μ L 各) | B 部 (各 40 μ L) | ||||
| 4Arm PEG MAL (50 mg/mL) | システインや RGD (2.81 mM) | PBS (pH 7.4) | 4Arm-ペグ-チオール (50 mg/mL) | PBS (pH 7.4) | ハ-S (13.3 mg/mL) | |
| 0.5% (w/v) HA 1 kpa | 10 Μ L | 4.00 Μ L | 26 Μ L | 1.00 Μ L | 9.00 Μ L | 30.0 Μ L |
| 0.5% (w/v) HA 2kPa | 20.0 Μ L | 4.00 Μ L | 16.0 Μ L | 8.00 Μ L | 2.00 Μ L | 30.0 Μ L |
| 0.1% (w/v) HA 1 kpa | 10 Μ L | 4.00 Μ L | 26 Μ L | 8.00 Μ L | 26.0 Μ L | 6.00 Μ L |
表 1。ゲル製剤 HA 濃度と機械的性質の独立制御を降伏します。
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Discussion
この 3 D 培養系を用いた再現性のあるデータの生成が必要です: HA、2) 効率的なヒドロゲル前駆体の混合とハイドロゲルの処理を達成するために練習の 1) 一貫したバッチ間なチオール化文化の損傷を防ぐため、3) 播種に最適化使用される各セルラインの密度です。
ヒドロゲルの HA の特定の重量の割合が必要な ha なチオール化の程度は、架橋密度を決定します。ハ各なチオール化反作用のための一貫した量を使用してバッチ間変動を最小限に抑えることをお勧めします。HA の少なくとも 300 の mg おすすめチオール HA の同じバッチは複数の実験の繰り返しに使用できるために各なチオール化反応に使用します。マレイミド基 4 腕ペグにチオール基のモル比は 1.1: 1 の最大架橋効率性を確保する常にする必要があります。したがって、なチオール化の度合いが変化した場合、PEG マル追加の量も合わせなければなりません。ときにペプチドを結合して、マレイミド ゲルを形成する前に、この計算のための使用可能なマレイミド類の合計数からテザー ペプチド ペグ腕の推定数を減算しなければなりません。さらに、解散と一貫性のあるゲル化を防ぐため、ジスルフィド結合の形成を避けるために 10-15% 以下 HA なチオール化の度を保つことをお勧めします。
チオールおよびマレイミド グループの間ミハエル機付加反応により、そのゲル化分の下で発生します。この高速ゲル化ヒドロゲル前駆体中に浮遊細胞は、生存を危険にさらす可能性があります、完全な媒体なし、時間の量を最小限に抑える封止工程ピペッティングと混合を達成するための手順をすべての経験が必要です。再現性のある結果。通常、我々 は「本物の」カプセル化実験を実行する前にセルを持たないゲル化のいくつかのラウンドの練習の新しい研修生をあります。
ゲル化速度を調節する 2 つの要素を調整できます: 反応温度と前駆体の pH。混合しながら氷の上もプレートを配置することによって反応温度を下げることの反応が遅くなります、前駆体を混合するより時間を提供します。しかし、これは適切な無菌技術を用いた無菌条件下で行う必要があります。同様より高いまたはより低い pH をそれぞれ使用して反応時間を増減する前駆体溶液の pH を変更ことができます。チオール HA をジスルフィド結合形成を防ぐために酸性水に対して透析、再構成したチオール HA はそれ以外の場合は期待されるかもしれないより低い pH をもたらします。一般に、再構築の 20 mM HEPES HBSS バッファー、ph 9、調整 pH は 7 時近くになります 15 mg/mL チオール HA の (~ 5% チオール) が解散しました。使用してお勧め pH 6.8 7 チオール HA ソリューションも細胞の健康を最大化しながら、ゲル溶液の混合を許可します。
カプセル化の間播種密度細胞生存率の実験的再現性が重要です。2,000,000 に 100,000 セル/mL の範囲で種まきをお勧めします。我々 は、少なくとも 3 週間の実験の時間枠内での confluency を防止しながらこの範囲がほとんどの種類の細胞の生存に最適なを発見しました。使用セル タイプごとに生存率を最適化初期播種密度を実験的に決定する必要があります。
細心の注意は、有害なハイドロゲル文化を避けるために細胞の培地を変更することにすべき。特に、ピペットにハイドロゲルを吸引しないように注意してください。したがって、真空吸引を使用していない、転送滅菌ピペットを使用して手動で吸引します。一度にうまく文化中の半分だけを変更することができます。
一般に、この手法では、必要な手先の器用さと一貫性を達成するために練習が必要です。ラボ固有のプロトコルが確立されると、3次元培養システムにより細胞培養と器官培養切片組織の典型的なとして多くの評価方法を使用する研究者です。ここでは、蛍光抗体法、フローサイトメトリー、西部のしみが付くこと、ライブ、3 D 文化(図 2-3)の生物発光イメージングなど、分析のためのいくつかのテクニックを説明しました。特性評価手法の詳細なプロトコルは、シャオ他20173を参照してください。最後に、HA/ペグ ヒドロゲル、光学的透明、共焦点イメージングなどの標準的な光学顕微鏡技術は、3 D ライブ文化を監視する使用できます。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、NIH (R21NS093199) とカリフォルニア大学ロサンゼルス校アーク 3 r の賞からの資金でサポートされていました。私たちの心からの感謝は、博士ハーレー Kornblum の HK301 と HK157 のセル行の規定の研究室に行きます。我々 もありがとう UCLA 組織病理コア研究室 (TPCL) セクショニング、高度な光顕微鏡/分光法中核施設 (施し) ucla カリフォルニア ・ ナノシステム研究所 (CNSI) の共焦点顕微鏡、UCLA crump さん所の使用のためIVIS イメージング システム、カリフォルニア大学ロサンゼルス校分子計測センター (MIC) 流れのインストルメンテーションを提供する磁気共鳴分光法と流れ Cytometry コアでジョンソン総合がんセンター (日数) ucla を提供するための分子イメージングフローサイトメトリー。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
References
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