Summary
Præsenteres her er to metoder, der kan bruges individuelt eller i kombination til at analysere effekten af beta-amyloid på fibrin blodprop struktur. Inkluderet er en protokol for at skabe en in vitro- fibrin blodprop, efterfulgt af blodprop Turbiditet og scanning Elektron Mikroskopi metoder.
Abstract
Denne artikel præsenterer metoder til at skabe i vitro fibrin blodpropper og analysere effekten af beta-amyloid (Aβ) protein på koageldannelse og struktur ved SPEKTROMETRI og scanning elektronmikroskopi (SEM). Aβ, som danner neurotoksiske amyloid aggregater i Alzheimers sygdom (AD), har vist sig at interagere med fibrinogen. Denne Aβ-fibrinogen interaktion gør fibrin blodprop strukturelt unormal og modstandsdygtige over for fibrinolyse. Aβ-induceret abnormiteter i fibrin koagulation kan også bidrage til cerebrovaskulær aspekter af annonce patologi såsom microinfarcts, inflammation samt cerebral amyloid angiopathie (CAA). På grund af neurovaskulære underskud potentielt kritiske rolle i annonce patologi, har udvikle forbindelser, som kan hæmme eller mindske Aβ-fibrinogen interaktion lovende terapeutisk værdi. In vitro metoder ved hvilke fibrin koageldannelse kan nemt og systematisk vurderes er potentielt nyttige værktøjer til at udvikle terapeutiske forbindelser. Præsenteres her er en optimeret protokol for in vitro- generation af fibrin blodprop, samt analyse af effekten af Aβ og Aβ-fibrinogen interaktion hæmmere. Blodprop turbiditet assay er hurtige, meget reproducerbare og kan bruges til at teste flere betingelser samtidig, giver mulighed for screening af stort antal Aβ-fibrinogen hæmmere. Hit forbindelser fra denne screening kan yderligere evalueret for deres evne til at rette op på Aβ-inducerede strukturelle abnormiteter af fibrin blodprop arkitektur ved hjælp af SEM. Effektiviteten af disse optimerede protokoller er demonstreret her ved hjælp af TDI-2760, en nyligt identificerede Aβ-fibrinogen interaktion hæmmer.
Introduction
Alzheimers sygdom (AD), en neurodegenerativ sygdom fører til kognitiv tilbagegang i ældre patienter, overvejende skyldes unormal beta-amyloid (Aβ) udtryk, sammenlægning og nedsat clearance resulterer i neurotoksicitet1, 2. trods den godt karakteriseret association mellem Aβ aggregater og AD3, de underliggende sygdom patologi præcise mekanismer er ikke vel forstået4. Stadig flere beviser antyder, at neurovaskulære underskud rolle for progression og sværhedsgraden af AD5, som Aβ interagerer direkte med komponenter af kredsløbssygdomme6. Aβ har en høj-affinitet interaktion med fibrinogen7,8, som også lokaliserer Aβ indskud i både AD patienter og mus modeller9,10,11. Derudover inducerer Aβ-fibrinogen interaktion unormal fibrin-koageldannelse samt struktur og modstand mod fibrinolyse9,12. En terapeutisk mulighed i behandling af annonce, lindre kredsløbssygdomme underskud ved at hæmme samspillet mellem Aβ og fibrinogen13,14. Derfor identificerede vi, flere små forbindelser hæmme Aβ-fibrinogen interaktion ved hjælp af high throughput screening og medicinalkemi tilgange13,14. For at teste effekten af Aβ-fibrinogen interaktion hæmmere, vi optimeret to metoder til analyse af in vitro- fibrin koageldannelse: størkne turbiditet assay og scanning elektronmikroskopi (SEM)14.
Blodprop turbiditet assay er en straight-forward og hurtig metode til overvågning af fibrin koageldannelse ved hjælp af UV-synlige spektroskopi. Som fibrin blodprop former, lys er mere og mere spredt og turbiditet af løsningen øger. Omvendt, når Aβ er til stede, strukturen af fibrin blodprop er ændret, og turbiditet i blandingen er reduceret (figur 1). Effekten af hæmmende forbindelser kan vurderes for potentiale til at gendanne blodprop turbiditet fra Aβ-induceret abnormiteter. Mens turbiditet analysen giver mulighed for hurtig analyse af flere betingelser, giver det begrænsede oplysninger om blodprop form og struktur. SEM, hvor topografi af faste genstande er afsløret af elektron sonde, giver mulighed for analyse af blodprop15,16,17,18 3D arkitektur og vurdering af hvordan tilstedeværelsen af Aβ og / eller hæmmende stoffer ændrer struktur9,14. Både massespektrometri og SEM er klassisk laboratoriemetoder, der er blevet anvendt til forskellige formål, eksempelvis spektrofotometri bruges til overvågning af amyloid sammenlægning19,20. SEM bruges ligeledes, også til at analysere fibrin blodprop dannet fra plasma af Alzheimers, Parkinsons og tromboemboliske apopleksi patienter21,22,23. Protokollerne præsenteres her er optimeret til vurdering af fibrin-koageldannelse i en reproducerbar og hurtig måde.
Følgende protokol indeholder vejledning til forberedelse af en in vitro- fibrin-blodprop både med og uden Aβ. Det beskriver også metoder til at analysere effekten af Aβ på fibrin koageldannelse og struktur. Effektiviteten af disse to metoder til måling af hæmning af Aβ-fibrinogen interaktion er påvist ved hjælp af TDI-2760, en lille hæmmende sammensatte14. Disse metoder, både individuelt og sammen, giver mulighed for hurtig og enkel analyse af in vitro- fibrin blodprop dannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af Aβ42 og Fibrinogen til analyse
- Forberede monomere Aβ42 fra frysetørrede pulver
- Varm Aβ42 pulver til stuetemperatur og spin-ned på 1.500 x g for 30 s.
- Tilsæt 100 µL af iskolde hexafluoroisopropanol (HFIP) pr. 0,5 mg Aβ42 pulver og Inkuber i 30 min på is.
FORSIGTIGHED: Vær forsigtig ved håndtering af HFIP og udføre alle trinene i en kemisk hætte. - Forberede 20 µL delprøver og lad film air tørre i en kemisk hood for 2-3 h. film kan opbevares ved-20 ° C.
- Rekonstruere monomere Aβ42 film i 10 µL af frisk dimethylsulfoxid (DMSO) ved agitation i et badekar sonikator i 10 min ved stuetemperatur.
- Tilføje 190 µL af 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) buffer (pH 7,4) og pipetteres op og ned forsigtigt.
- Fjerne protein aggregater ved centrifugering ved 20,817 x g ved 4 ° C i 20 min.
- Inkuber supernatanten ved 4 ° C for natten og næste dag centrifuge løsning på 20,817 x g ved 4 ° C i 20 min. for at kassere yderligere protein aggregater.
- Måle Aβ42 koncentration af bicinchoninic syre (BCA) assay. Seriel fortyndet renset bovint serumalbumin (BSA) fra 1 mg/mL til 0.0625 mg/mL til at producere en protein standard, tilsæt 10 µL af hver standard brønde i en multi godt plade i tre eksemplarer. Fortynd Aβ prøver 1:4 og tilsæt 10 µL brønde i tre eksemplarer. Bland BCA løsninger A og B og tilføje 200 µL til hver brønd. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C og læse på en Pladelæser på 562 nm. Holde den resterende Aβ løsning på is og bruge denne forberedelse for turbiditet assay og SEM.
- Forberede Fibrinogen løsning
- Måle 20 mg af frysetørrede fibrinogen pulver i en 15 mL tube og genopslæmmes med pre varmede 2 mL af 20 mM hydroxyethylpiperazine Ethan ethylbenzthiazolinsulfonsyre syre (HEPES) buffer (pH 7,4).
- Inkuber i et 37 ° C vandbad i 10 min.
- Filtrer løsning gennem en 0,2 µm sprøjte filter og opbevares ved 4 ° C i 30 min. Tage ud løsning fra 4 ° C og filter igen gennem 0,1 µm sprøjte filter til at fjerne fibrinogen aggregater eller eksisterende fibrin.
- Måle fibrinogen koncentration af BCA assay. Følg vejledningen fra trin 1.1.8. Holde den resterende fibrinogen løsning ved 4 ° C og bruge denne forberedelse for turbiditet assay og SEM.
2. blodprop turbiditet Assay
- Hvert eksperimentelle hul i 96-brønd plade, skal du tilføje 20 µL af 30 µM Aβ42 løsning fra trin 1.1.8, så dets endelige koncentration er 3,0 µM i 200 µL af bufferen. Tilføje den samme mængde af 5% DMSO i 50 mM Tris buffer (pH 7,4) til buffer kontrolhullerne i 96-brønd plade.
Bemærk: Det nøjagtige volumen af Aβ42 på dette trin er ikke vigtigt. For lav koncentration præparater, en højere volumen kan bruges, og mængden af blodprop dannelse buffer kan justeres. Endelige rumfang skal være 200 µL. - Hvis test hæmmende forbindelser, fortyndes sammensat arbejde koncentration som DMSO. Tilføje sammensatte eller DMSO alene for et kontrolelement til brønde med Aβ42 og bland godt.
Bemærk: Aβ42 løsning bør danne en diskret droplet i bunden af brønden, sammensat eller DMSO bør være pipetted direkte ind i midten af denne droplet. - Fortynd fibrinogen stamopløsning fra trin 1.2.4 i blodprop dannelse buffer (20 mM HEPES buffer (pH 7,4), 5 mM CaCl2og 137 mM NaCl) og tilføje det til Aβ42 indeholdende og kontrol pladens huller, 96-brønd. Juster volumen fibrinogen løsning, så dens slutkoncentration bliver 1,5 µM i samlede 200 µL reaktion volumen. Afpipetteres løsningen langsomt og undgå at danne bobler. Inkuber plade ved stuetemperatur i 30 min. ryster på en roterende platform.
Bemærk: Volumen fibrinogen løsning afhænger af dens bestand koncentration, men den samlede mængde i hver godt skal være 170 µL mens inkubation. - Forberede thrombin løsning ved at opløse kommercielt renset thrombin pulver i ddH2O at gøre en stamopløsning af 50 U/mL. Fortyndes til de 5 U/mL brugsopløsning på 20 mM HEPES buffer (pH 7,4) umiddelbart før brug.
- Efter 30 min inkubation, samtidig tilføje 30 µL af thrombin løsning (5 U/mL) i fibrinogen løsninger i 96-brønd plade fra trin 2.3 ved hjælp af multikanalpipette. Tilsaetning af thrombin vil straks indlede blodprop dannelse. Derfor tilføje thrombin direkte ind i midten af fibrinogen løsning med forsigtighed for at undgå at danne bobler.
Bemærk: Aktiviteten af thrombin kan variere mellem forsøgsbetingelser, samt thrombin masser. Den korrekte koncentration, der kræves til håndfast producere blodpropper kan have fastsættes empirisk. - Læse absorbans af in vitro- blodprop på en Pladelæser umiddelbart efter thrombin tilsætning. Absorbansen måles på 350 nm i løbet af 10 min, hver 30-60 s. udføre hele analysen ved stuetemperatur.
Bemærk: Nogle hæmmer forbindelser kan ændre løsning absorbans på 350 nm, i hvilket tilfælde turbiditet kan maales ved 405 nm.
3. scanning elektronmikroskopi
- Forberedelse af blodprop, fiksering og vask
- Sted rent Silikoniseret glas cirkel dække dias (12 mm) i en 12-godt eller 24-godt plade med pincet.
- Forberede fibrinogen i blodprop dannelse buffer. Se protokollen trin 1.2 for detaljer.
- For at evaluere effekten af Aβ-fibrinogen interaktion hæmmere på fibrin blodprop struktur, Følg instruktionerne til udrugning som beskrevet for turbiditet assay (trin 2). Altid omfatte kontrolhullerne, der indeholder fibrinogen i mangel af både Aβ og hæmmere.
- Der afpipetteres 80 µL af fibrinogen blandingen fra trin 3.1.3 på cover dias. Forsigtigt sprede løsningen, så det er jævnt fordelt på diasset dækning.
- Fortyndes thrombin stock (50 U/mL) i 20 mM HEPES bufferet saltvand til en endelig koncentration på 2,5 U/mL og tilsættes 20 µL direkte til centrum af fibrinogen løsning uden blanding.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, kan en højere thrombin arbejder koncentration (5 U/mL) blive brugt. - Dække 12-godt pladen med et plastlåg og lade det blive ved stuetemperatur i 30-60 min.
- Mens koagulation reaktion kører, forberede dehydrering og fiksering løsninger. Forberede natrium cacodylate buffer (0,1 M, pH 7,4). Fortyndet 10% glutaraldehyd stamopløsning i natrium cacodylate buffer (0,1 M, pH 7,4) til at gøre en 2% opløsning af glutaraldehyd i orden. Holde alle disse løsninger på is. Frisk fortyndet glutaraldehyd (2%) bør anvendes inden for 1 uge, hvis de er korrekt opbevaret i køleskab ved 4 ° C.
- Fortynd absolut ethanol (100%) i dobbelt destilleret vand (80%, 50% og 20% ethanol). Holde disse ethanol løsninger og absolut ethanol (100%) på is.
Forsigtighed: Vær forsigtig, når du håndterer natrium cacodylate og glutaraldehyd, udføre disse trin i en kemisk hætte. - Efter 30 min, forsigtigt vaske blodpropper med iskold natrium cacodylate buffer (0,1 M) to gange. Tilsættes 2 mL af bufferen til hver brønd, således at blodprop er helt nedsænket. Dække godt pladen med et låg og lad det i 2 min. ved stuetemperatur. Efter 2 min, forsigtigt fjerne bufferen ved hjælp af en 1 mL pipette eller smalle stilk overførsel pipette. Gentag én gang.
- Lave blodpropper med iskold glutaraldehyd (2%). At holde godt pladen på is, tilføje omkring 2-3 mL 2% glutaraldehyd til hver brønd. Sørg for, at blodpropper er helt neddykket. Dække og forlader pladen på is i 30 min.
- Efter 30 min, forsigtigt fjerne glutaraldehyd fra hver brønd og vaske blodpropper ved hjælp af natrium cacodylate buffer (0,1 M), som beskrevet ovenfor (2 min, to gange). Holde godt pladen på is.
- Seriel dehydrering af blodprop og kritiske punkt tørring
- Dehydrere blodpropper i en gradueret række iskold ethanol vasker forberedt i trin 3.1.8 (20%, 50%, 80%, 100% og again100%) i 5 min. For hver ethanol serie, tilføje 2-3 mL, og sørg for, at blodpropper er neddykket. Dække og Ruger på is.
- Efter hver ethanol skridt, fjerne ethanol løsning ved hjælp af en 1 mL pipette eller engangs pipette dropper. Fjern ikke ethanolen helt. Sørg for blodprop overfladen ikke udsættes for luft.
Bemærk: Dehydrering i absolut ethanol (100%) bør udføres to gange. - Samtidig med at den prøve, der er nedsænket i den endelige 100% ethanol, overføre til et kritisk punkt tørretumbler (CPD). Bruge en CPD prøve eller en cover slip indehaveren med en skive til overførsel dias i CPD kammer. Placere mindst én skive mellem hvert dias.
- Tegne dækning dias fra CPD kammer og montere den på en SEM stub ved hjælp af kulstof tape.
- Sputter belægning og billedbehandling
- Overføre alle prøverne med SEM stub til sputter belægning kammer.
- Sputter pels mindre end 20 nm af guld/palladium eller andre ledende materialer, såsom kulstof, ved hjælp af et vakuum sputter coater.
Bemærk: Vi har brugt 18 nm af guld/palladium belægning. Sputter belægning blev udført for 45 s og belægning hastighed var 4 Å / s. Sputter belagt prøver er stabilt, når det opbevares korrekt i et tørt miljø ved stuetemperatur til få uger. SEM analyse kan udføres når som helst. - Erhverve billeder på en scanning elektron mikroskop udstyret med SE2 detektor på 4 kV.
Bemærk: Billedets pixelstørrelse i dette billede sæt vifte fra 13 nm-31 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro- koagulation (turbiditet) assay kløver enzymet thrombin fibrinogen, resulterer i dannelsen af fibrin netværk24. Denne fibrin koageldannelse forårsager spredning af lyset passerer gennem den løsning, som resulterer i øget turbiditet (figur 1), plateauing inden udgangen af perioden læsning (figur 2, grøn). Når fibrinogen var inkuberes med Aβ42, turbiditet af løsningen faldet med kurven nå en maksimal højde på cirka halvdelen af fibrinogen alene (figur 2A, blå). I en nylig publikation, var en serie af Aβ sammenlægning blokkere syntetiseret og vurderet for deres evne til at hæmme Aβ-fibrinogen interaktion, at identificere de sammensatte TDI-276014. Vi har brugt TDI-2760 i vores undersøgelse til at blokere Aβ-fibrinogen interaktion. Som rapporteret tidligere, i overværelse af TDI-2760, effekten af blev Aβ forbedret, da turbiditet var højere end med Aβ alene (figur 2A, red). Effekten af TDI-2760 synes ikke at være på grund af baggrunden turbiditet som sammensat ikke ændre fibrin blodprop turbiditet når Aβ var fraværende (figur 2A, lilla). Den in vitro- koagulation turbiditet assay beskrevet her er en hurtig og enkel metode ved hvilken fibrin-blodprop dannelse og faktorer, der kan dæmpe denne proces kan observeres. GPRP, som er kendt for at blande sig med fibrin polymerisering via forstyrrer fibrin monomer knop-hullers interaktioner18,25 kan bruges som en positiv kontrol for turbiditet assay (figur 2B). Overensstemmelse med de tidligere rapporter25, med tilstedeværelsen af GPRP peptid, fibrin blodprop turbiditet blev væsentligt reduceret i forhold til fibrin koageldannelse med sit fravær (figur 2B, blå vs grøn).
Efter den samme protokol og betingelser som turbiditet analysen ovenfor beskrevne, fibrin blodpropper blev udarbejdet i tilstedeværelse og fravær af Aβ og/eller TDI-2760. Blodpropper blev derefter behandlet for Elektron Mikroskopi af fiksering, dehydrering, kritiske punkt tørring og guld-sputter belægning (figur 1). Fibrinogen kun thrombin og CaCl2 dannet en fibrin mesh med aflange og indtrængere tråde af fibrin samt større bundter (figur 3A). Når Aβ var til stede, blev fibrin tråde tyndere, med flere klæbrige klumper/aggregater med angivelse af Aβ-inducerede strukturelle abnormiteter (figur 3B). Overensstemmelse med turbiditet assay resultater, TDI-2760 restaureret delvist struktur af fibrin blodprop fra Aβ-inducerede ændringer, som færre klumper var til stede (figur 3 C). Sammen med turbiditet assay afslører SEM omfanget og kvaliteten af Aβ-inducerede ændringer til fibrin koageldannelse og effektiviteten af en hæmmende sammensatte, TDI-2760.
Figur 1 : Skematisk fremstilling af fibrin blodprop analyse af turbiditet assay og SEM. Skematiske viser de forskellige trin i fibrin blodprop analyse og effekten af Aβ på fibrin blodprop Turbiditet og strukturelle topografi. Skala barer af SEM billeder (nederst til venstre) er 2 µm og forstørrelsen er 10, 000 X. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Måling af effekt Aβ42 på in vitro- fibrin blodprop dannelse af turbiditet assay. (A) Fibrinogen blev udruget i tilstedeværelse og fravær af Aβ42. Koageldannelse blev fremkaldt af thrombin, hvilket resulterer i øget turbiditet løsning (grøn). I overværelse af Aβ42, var fibrin blodprop unormalt struktureret, resulterer i nedsat turbiditet (blå). Den sammensatte TDI-2760 eller DMSO blev inkuberet med fibrinogen løsning, både med og uden Aβ42. TDI-2760 restaureret Aβ42-induceret fald af turbiditet (rød) uden at ændre den normale koageldannelse (lilla). (B) turbiditet af en kendt fibrinolyse hæmmer, GPRP blev også målt som positiv kontrol til dette assay. Fibrinogen blev udruget i tilstedeværelse og fravær af 1,5 µM GPRP og turbiditet målt efter tilsætning af thrombin. Svarende til Aβ42, turbiditet af fibrin koageldannelse blev væsentligt reduceret i overværelse af GPRP (blå versus grøn). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Scanning elektron micrographs af Aβ-induceret afvigelser fibrin blodprop arkitektur. Scanning elektron micrographs af fibrin blodprop struktur fremstillet af renset fibrinogen (A), fibrinogen + Aβ42 (B), fibrinogen + Aβ42 + TDI-2760 (C). Koageldannelse blev indledt ved at tilføje thrombin og CaCl2 til blandingen. Den strukturelle analyse afslørede, at blodpropper dannet i overværelse af Aβ42 er tyndere og unormalt klumpet, i forhold til fibrinogen af sig selv. TDI-2760, som er kendt for at hæmme Aβ42-fibrinogen interaktion, korrigeret delvist Aβ42 induceret strukturelle abnormitet af fibrin blodprop. Skalalinjen er 1 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder, der beskrives her give en reproducerbar og hurtigt middel til vurdering af fibrin blodprop dannelse i vitro. Desuden er enkelheden i systemet gør fortolkning af hvordan Aβ påvirker fibrin koageldannelse og struktur forholdsvis ligetil. I denne øvelse forrige udgivelse, blev det vist, at disse assays kan bruges til at teste forbindelser for deres evne til at hæmme Aβ-fibrinogen interaktion13,14. Ved hjælp af disse to assays, en serie af syntetiserede forbindelser blev analyseret for evne til at hæmme Aβ-fibrinogen interaktion. Faktisk, blodprop turbiditet assay kan bruges til at indsnævre puljen af hit forbindelser til dem, der har terapeutiske potentiale, som ikke alle forbindelser, der kan hæmme Aβ-fibrinogen interaktion kan også gendanne fibrin blodprop dannelse.
Der er et par aspekter af turbiditet assay, der kan kræve fejlfinding eller begrænse brug af denne teknik. Den store begrænsning er, at der kan være nogle variationer mellem de eksperimenter, som kan komplicere fortolkningen af resultaterne. Nogle af denne variation er at skyldes thrombin aktivitet. Du kan foretage fejlfinding for thrombin aktivitet, kan brugere teste flere koncentrationer af thrombin for blodprop-dannelse aktivitet forud for begyndelsen eksperimenter med Aβ og test forbindelser. Under forsøgsbetingelser præsenteres her, øger Aβ, i mangel af fibrinogen, ikke turbiditet af løsningen ovenfor baggrundsniveauer med angivelse af den konstaterede turbiditet kurver er på grund af fibrin polymerisering. Men Aβ er en sammenlægning-tilbøjelige peptid og en højere koncentration af Aβ løsning når opbevares i meget lang tid ved stuetemperatur og 37 ° C (flere timer) kan danne fibrillar tilslagsmaterialer, hvilket kan resultere i øget turbiditet. Hvis analysere effekten en Aβ-løsning, der har været opbevaret i længere tid ved stuetemperatur eller varmere, kan sammenlægning status af løsningen bestemmes ved transmissions Elektron Mikroskopi. I protokollen beskrevet her, bruges frisklavet Aβ og fibrinogen løsninger, som skal fjerne sammenlægning problemer. Men for at sikre kvaliteten af disse præparater er de blevet vurderet af transmissions Elektron Mikroskopi. Desuden, når du bruger en ny masse kommercielle Aβ peptid, bør omfanget af oligomerisering og mængden af oligomerer vurderes af transmissions Elektron Mikroskopi. Fordi der kan være mange til masse variation i peptid kvalitet og forholdet mellem præfabrikerede aggregater og monomere Aβ, som helt sikkert påvirker oligomerisering sats. Det kan tilrådes at kontrollere koncentrationen af Aβ løsning (BCA metode) før inkubere for oligomerisering. For at minimere disse variationer, forsøgte vi at bruge mindst 0,1 mg/mL af Aβ løsning for oligomer dannelse reaktion.
Fordi denne analyse, er også følsomme over for små miljømæssige ændringer såsom temperatur og motion, skal turbiditet aflæsninger fra forskellige eksperimenter ikke analyseres sammen. Det betyder, at antallet af forhold, der kan sammenlignes er begrænset af antallet af brønde at thrombin kan samtidig tilføjes med en multikanalpipette (dvs., 12). Brugere bør også være opmærksom på, at viskositet eller farve i buffere og test forbindelser kan føre til en høj baggrund turbiditet, tilsløre signalet fra fibrin blodprop og vanskeliggør fortolkning af eksperimentet. Men hvis alle kontrolelementerne er inkluderet i hvert forsøg, bør det være muligt at let finde ud af, hvis baggrund signal er at ændre turbiditet absorbans.
Turbiditet analysen indeholder oplysninger om hvorvidt dannelsen af fibrin blodprop hindres af Aβ og endvidere hvis hæmmer forbindelser kan afhjælpe denne effekt. Det dog ikke afsløre, hvordan strukturen af fibrin blodprop er ændret i svar til Aβ eller ramte forbindelser. Dette spørgsmål kan blive behandlet af SEM, da dette giver mulighed for direkte visualisering af blodprop arkitektur. SEM er en veletableret teknik og bruges rutinemæssigt til at visualisere blodprop struktur fra renset fibrinogen eller plasma. Men den traditionelle blodprop forberedelse proces for SEM analyse kan være kompliceret og tidskrævende. Derudover kan små forskelle i protokoller mellem forskellige forskergrupper gøre det udfordrende at kopiere resultater24. For at løse disse problemer blev denne optimerede protokol udviklet, hvormed effekten af Aβ at fremkalde tyndere fibrin indsatsområder og klumper af protein kan observeres (figur 3). Som set med turbiditet assay, mindsker TDI-2760 effekten af Aβ, genoprette den typiske struktur af fibrin bundter (figur 3).
Der er et par skridt i SEM prøveforberedelse, som kan også kræve fejlfinding. Når du bruger meget lave koncentrationer af fibrinogen (0,5 µM og derunder), blodpropper kan ikke være solidt fastgjort til glas dias og kan være beskadiget/vaskes væk under fiksering/vask trin. Hvis du bruger lave koncentrationer af fibrinogen, kan blodprop dannelse tid, mellem tilsaetning af thrombin og fiksering, øges op til flere timer, da dette kan øge blodprop stabilitet. Også bør brugere undgå bruger højstyrke fosfat buffer eller fosfatbufferet saltopløsning til både Turbiditet og SEM assays, som fosfat-ioner kan interferere med calcium-medieret blodprop dannelse processen. Hvis du bruger nogen andre høje salt indeholdende buffer for koageldannelse og SEM analyse, efter fiksering, bør vask trin også udføres med kold ddH2O.
SEM analyse af ikke-ledende prøver såsom fibrin blodpropper kræver belægning med ladede partikler som, guld, palladium, sølv eller kulstof. Belægning tykkelse er en vigtig faktor i SEM billeddannelse, som det er muligt, at et meget tykt metal belægning kan maskere ultra-struktur overflade topografi fibrin blodprop. I denne protokol, tynde guld/palladium belægning (mindre end 20 nm) er brugt til sputter belægning. For at opnå mindre end 20 nm tykkelse, den sputtering blev gjort til 45 s med en belægning på 4 Å / s. Denne tynde belægning (18 nm) synes ikke at maskere de overflade funktioner af fibrin forsamling. Men hvis bekymret over maskering ultra-struktur af blodprop, carbon belægning kan bruges som et alternativ til guld/palladium, som det vil efterlade færre "øer" af belægning molekyler på materialet.
Mens fokus her har været på Aβ-fibrinogen interaktion, kan denne protokol let modificeret til at analysere samspillet mellem andre proteiner eller forbindelser med fibrin blodprop. Efter disse instruktioner, skal efterforskerne kunne reproducere i vitro fibrin koageldannelse og udføre analyse med disse strømlinede clot-turbiditet assay og SEM protokoller. Som vist her med den tidligere udgivne hæmmer sammensatte TDI-2760, disse metoder giver værdifulde oplysninger om fibrin blodprop dannelse, der kan anvendes til yderligere undersøgelser både in vitro og i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfattere takke nationer Kawasaki, Kazuyoshi Aso og Michael Foley fra Tri-institutionelle Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York for syntese af Aβ-fibrinogen interaktion hæmmere og deres værdifulde forslag. Forfatterne også takke medlemmerne af Strickland lab for nyttig diskussion. Dette arbejde blev støttet af NIH grant NS104386, Alzheimer's Drug Discovery Foundation og Robertson terapeutiske Udviklingsfond for H.A., NIH give NS50537, Tri-institutionelle Therapeutics Discovery Institut, Alzheimer's Drug Discovery Foundation, RUDIN Family Foundation, og John A. Herrmann for S.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).
- Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
- Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
- Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
- Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
- Ahn, H. J., et al. Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
- Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
- Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
- Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
- Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
- Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
- Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
- Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
- Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
- Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
- Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
- Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
- Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
- Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease. PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).
- Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
- Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).
