Summary
Hier zijn twee methoden die afzonderlijk of in combinatie kunnen worden gebruikt voor het analyseren van het effect van bèta-amyloid op fibrine clot structuur. Inbegrepen is een protocol voor het maken van een in vitro fibrine clot, gevolgd door clot turbiditeit en scanning elektronen microscopie methodes.
Abstract
Dit artikel bevat methoden voor het genereren van in vitro fibrine stolsels en het analyseren van het effect van bèta-amyloid (Aβ) eiwit op clot formatie en structuur door spectrometrie en scanning elektronen microscopie (SEM). Aβ, dat vormt neurotoxische amyloïde aggregaten in de ziekte van Alzheimer (AD), heeft aangetoond dat interactie met fibrinogeen. Deze interactie Aβ-fibrinogeen maakt het fibrine clot structureel abnormale en resistent zijn tegen Fibrinolyse. Aβ-geïnduceerde afwijkingen in fibrine stolling kunnen ook bijdragen aan cerebrovasculaire aspecten van de AD-pathologie zoals microinfarcts, ontsteking, evenals, Cerebrale amyloïde angiopathie (CAA). Gezien de potentieel kritische rol van neurovasculaire tekorten in AD pathologie, heeft ontwikkeling van verbindingen die kunnen remmen of verminderen van de Aβ-fibrinogeen interactie veelbelovende therapeutische waarde. In vitro methoden door welke fibrine clot vorming kan worden gemakkelijk en systematisch geëvalueerd zijn potentieel nuttige hulpmiddelen voor het ontwikkelen van therapeutische stoffen. Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerde protocol voor in vitro generatie van het fibrine clot, alsmede een analyse van het effect van Aβ en Aβ-fibrinogeen interactie-remmers. De bepaling van de troebelheid clot is snelle, zeer reproduceerbaar en kan worden gebruikt om meerdere proefomstandigheden tegelijk, waardoor voor het screenen van grote aantallen Aβ-fibrinogeen remmers. Hit verbindingen uit deze screening kunnen verder worden geëvalueerd voor hun vermogen om te verzachten Aβ-geïnduceerde structurele afwijkingen van de fibrine clot architectuur met behulp van SEM. De effectiviteit van deze geoptimaliseerde protocollen is hier aangetoond door middel van TDI-2760, een onlangs geïdentificeerde Aβ-fibrinogeen interactie inhibitor.
Introduction
De ziekte van Alzheimer (AD), een neurodegeneratieve ziekte leidt tot cognitieve achteruitgang bij oudere patienten, voornamelijk voortkomt uit abnormale amyloid-bèta (Aβ) expressie, aggregatie en verminderde klaring resulterend in neurotoxiciteit1, 2. ondanks de goed gekarakteriseerd associatie tussen Aβ aggregaten en AD3, zijn de precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathologie ziekte niet goed begrepen4. Een groeiende hoeveelheid bewijs suggereert dat neurovasculaire tekorten een rol bij de progressie en de ernst van AD5 spelen, zoals Aβ rechtstreeks met de componenten van de bloedsomloop6 communiceert. Aβ heeft een hoge-affiniteit interactie met fibrinogeen7,8, die ook Aβ deposito's in zowel AD patiënten en muis modellen9,10,11 lokaliseert. Bovendien is de interactie Aβ-fibrinogeen induceert abnormale fibrine-clot formatie en structuur, evenals de weerstand tegen Fibrinolyse9,12. Een van de therapeutische mogelijkheden bij de behandeling van AD, is het verlichten van bloedsomloop tekorten door remming van de interactie tussen Aβ en fibrinogeen13,14. Wij, geïdentificeerd daarom diverse kleine verbindingen remming van de Aβ-fibrinogeen interactie met behulp van hoge-doorvoer screening en medicinale chemie benaderingen13,14. Om te testen van de werkzaamheid van Aβ-fibrinogeen interactie remmers, geoptimaliseerd we twee methoden voor de analyse van in vitro fibrine clot vorming: stollen troebelheid assay en scanning elektronen microscopie (SEM),14.
Clot troebelheid assay is een rechttoe-rechtaan en snelle methode voor de controle van fibrine clot vorming met behulp van UV-zichtbaar spectroscopie. Als de fibrine clot formulieren, licht is steeds meer verspreid en de troebelheid van de oplossing verhoogt. Omgekeerd, wanneer Aβ aanwezig is, de structuur van het fibrine clot wordt gewijzigd, en de troebelheid van het mengsel wordt verminderd (Figuur 1). Het effect van remmende stoffen kan worden beoordeeld voor de mogelijkheden waaruit u wilt terugzetten clot troebelheid Aβ-geïnduceerde afwijkingen. Terwijl de troebelheid assay voor snelle analyse van meerdere voorwaarden zorgt, biedt het beperkte informatie over de klonter vorm en structuur. SEM, waarin de topografie voor massieve voorwerpen is geopenbaard door elektron sonde, zorgt voor de analyse van de 3D-architectuur van de klonter15,16,17,18 en de beoordeling van hoe de aanwezigheid van Aβ en / of inhiberende verbindingen verandert die structuur9,14. Beide spectrometrie en SEM zijn klassieke laboratoriumtechnieken die zijn gebruikt voor verschillende doeleinden, bijvoorbeeld spectrofotometrie wordt gebruikt voor de controle van amyloïde aggregatie19,20. Evenzo, SEM wordt ook gebruikt voor het analyseren van fibrine clot gevormd uit het plasma van de ziekte van Alzheimer, Parkinson en trombo-embolische beroerte patiënten21,22,23. De protocollen die hier gepresenteerd worden geoptimaliseerd voor de beoordeling van de vorming van fibrine-clot reproduceerbaar en snelle wijze.
Het volgende protocol bevat de instructies voor de voorbereiding van een in vitro fibrine-clot zowel met als zonder Aβ. Het ook een overzicht van de methoden voor het analyseren van het effect van Aβ op fibrine clot formatie en structuur. De effectiviteit van deze twee methoden voor het meten van de remming van de Aβ-fibrinogeen interactie is aangetoond door middel van TDI-2760, een kleine remmende samengestelde14. Deze methoden, toestaan zowel individueel als samen voor snelle en eenvoudige analyse van in vitro fibrine clot vorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van Aβ42 en fibrinogeen p.a.
- Bereiden monomere Aβ42 van gelyofiliseerd poeder
- Warme Aβ42 poeder op kamertemperatuur en spin down bij 1.500 x g gedurende 30 s.
- Voeg 100 µL van ijskoude hexafluoroisopropanol (HFIP) per 0,5 mg Aβ42 poeder en incubeer gedurende 30 min op ijs.
Let op: Wees voorzichtig bij het verwerken van HFIP en alle stappen in een chemische kap. - Bereiden 20 µL aliquots en laat die de films lucht droog in een chemische kap voor 2-3 h. Films kan worden opgeslagen bij-20 ° C.
- Reconstrueren monomeer Aβ42 film in 10 µL van verse dimethylsulfoxide (DMSO) door agitatie in een bad ultrasoonapparaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 190 µL van 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) buffer (pH 7.4) en Pipetteer zachtjes op en neer.
- Verwijder de eiwit-aggregaten door centrifugeren bij 20,817 x g bij 4 ° C gedurende 20 minuten.
- Incubeer het supernatant bij 4 ° C's nachts en's anderendaags Centrifugeer de oplossing bij 20,817 x g bij 4 ° C gedurende 20 min te negeren verdere eiwit-aggregaten.
- Meten Aβ42 concentratie door bicinchoninic zuur (BCA) assay. Seriële verdunde gezuiverd bovien serumalbumine (BSA) van 1 mg/mL tot 0.0625 mg/mL 10 µL van elke standaard toevoegen aan de putjes van een multi goed plaat in drievoud te produceren een proteïne-standaard. Verdun Aβ monsters 1:4 en voeg toe 10 µL aan de putjes in drievoud. Vermeng BCA oplossingen A en B en 200 µL toe te voegen aan elk putje. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C en lezen op een afleesapparaat op 562 nm. Bewaar de resterende Aβ oplossing op ijs en gebruik deze voorbereiding voor troebelheid assay en SEM.
- Bereiden van fibrinogeen oplossing
- Meten van 20 mg gelyofiliseerd fibrinogeen poeder in een tube van 15 mL en resuspendeer met voorverwarmde 2 mL 20 mM hydroxyethylpiperazine ethaan sulfonzuur (HEPES) buffer (pH 7.4).
- Incubeer in een waterbad 37 ° C gedurende 10 minuten.
- Filtreer de oplossing door een filter van de spuit 0,2 µm en bewaren bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Neem uit de oplossing van 4 ° C en filter opnieuw door 0.1 µm spuit filter verwijderen fibrinogeen aggregaten of voorafbestaand fibrine.
- Meten van de concentratie van fibrinogeen door BCA assay. Volg de instructies vanaf stap 1.1.8. Bewaar de resterende fibrinogeen-oplossing bij 4 ° C en gebruik deze voorbereiding voor troebelheid assay en SEM.
2. clot troebelheid Assay
- Aan elk experimentele putje van de 96-wells-plaat, voeg toe 20 µL van 30 µM Aβ42 oplossing uit stap 1.1.8 zodat de eindconcentratie 3.0 µM in 200 µL van de buffer is. Voeg een gelijk volume 5% DMSO in 50 mM Tris buffer (pH 7.4) buffer in de 96-wells-plaat-controleputjes.
Opmerking: De exacte omvang van de Aβ42 bij deze stap is niet belangrijk. Voor lage concentratie preparaten een hoger volume kan worden gebruikt, en het volume van de klonter vorming buffer kan worden aangepast. Het eindvolume moet 200 µL blijven. - Als het testen van remmende stoffen, Verdun de verbinding bij de concentratie werken als DMSO. Samengestelde toevoegen of DMSO alleen voor een besturingselement in de putjes met Aβ42 en meng goed.
Opmerking: Aβ42 oplossing moet vormen een discrete droplet op de bodem van de put, de compound of DMSO rechtstreeks in het midden van de druppel moet worden pipetted. - Verdun de stockoplossing van fibrinogeen uit stap 1.2.4 in clot vorming buffer (20 mM HEPES-buffer (pH 7.4), 5 mM CaCl2en 137 mM NaCl) en toe te voegen aan Aβ42 met en controle putjes van de 96-wells-plaat. Het volume van de oplossing van fibrinogeen aanpassen zodat de uiteindelijke concentratie 1,5 µM in totaal 200 µL reactie volume wordt. Pipetteer de oplossing langzaam en te voorkomen dat de vorming van luchtbellen. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten schudden op een draaiend platform.
Opmerking: Het volume van fibrinogeen oplossing kan variëren afhankelijk van de voorraad concentratie, maar het totale volume in elk goed moet 170 µL tijdens de incubatie. - Bereid trombine oplossing door ontbinding van commercieel gezuiverde trombine poeder in ddH2O te maken van een stamoplossing van 50 U/mL. Vul aan tot de 5 U/mL werkoplossing in 20 mM HEPES-buffer (pH 7.4) direct vóór gebruik.
- Na 30 min van incubatie, voeg gelijktijdig 30 µL van trombine oplossing (5 U/mL) in de fibrinogeen oplossingen in de 96-wells-plaat van stap 2.3 met meerkanaalspipet. Toevoeging van trombine leidt zal onmiddellijk de klonter-vorming. Daarom toevoegen trombine direct in het centrum van de oplossing van fibrinogeen met zorg om te voorkomen dat de vorming van luchtbellen.
Opmerking: De activiteit van trombine kan variëren tussen experimentele omstandigheden, evenals trombine tal. De juiste concentratie moet krachtig produceren stolsels wellicht empirisch vastgesteld. - Lees de absorptie van in vitro clot op een afleesapparaat onmiddellijk na de toevoeging van trombine. Meet de extinctie bij 350 nm in de loop van 10 min., iedere 30-60 s. uitvoeren de hele test bij kamertemperatuur.
Opmerking: Sommige verbindingen remmer kunnen het wijzigen van de extinctie van de oplossing bij 350 nm, in dat geval de troebelheid kan worden gemeten op 405 nm.
3. scanning elektronen microscopie
- Voorbereiding van clot, fixatie en wassen
- Plaats schoon gesiliconiseerd glas cirkel cover dia's (12 mm) in een 12-well of 24-well plaat met pincet.
- Fibrinogeen in clot vorming buffer voor te bereiden. Zie protocol stap 1.2 voor meer informatie.
- Om te evalueren van het effect van interactie-remmers Aβ-fibrinogeen in fibrine clot structuur, volg de instructies voor incubatie zoals beschreven voor de troebelheid assay (stap 2). Omvat altijd-controleputjes die fibrinogeen in de afwezigheid van zowel Aβ en remmers bevatten.
- Pipetteer 80 µL van het mengsel van fibrinogeen uit stap 3.1.3 op de cover dia's. Zachtjes verspreiden de oplossing zodat het gelijkmatig wordt verdeeld op de dia deksel.
- Trombine voorraad (50 U/mL) verdund in 20 mM HEPES gebufferde zoutoplossing om een eindconcentratie van 2.5 U/mL en Voeg 20 µL rechtstreeks naar het midden van de fibrinogeen oplossing zonder mengen.
Opmerking: Indien nodig, kan er een hogere concentratie van trombine werken (5 U/mL) worden gebruikt. - De 12-well afdekplaat met een plastic deksel en laat het op kamertemperatuur voor 30-60 min.
- Tijdens het uitvoeren van stolling reactie bereiden uitdroging en fixatie oplossingen. Natrium cacodylate buffer (0,1 M, pH 7.4) voor te bereiden. Verdun 10% Glutaaraldehyde stockoplossing in natrium cacodylate buffer (0,1 M, pH 7.4) te maken van een 2% oplossing van Glutaaraldehyde werken. Houd al deze oplossingen op ijs. Vers verdunde Glutaaraldehyde (2%) moet worden gebruikt binnen 1 week, wanneer correct opgeslagen in een koelkast bij 4 ° C.
- Verdun absolute ethanol (100%) in dubbel gedestilleerd water (80%, 50% en 20% ethanol). Houd deze ethanol oplossingen en absolute ethanol (100%) op het ijs.
Let op: Wees voorzichtig bij het verwerken van natrium cacodylate en Glutaaraldehyde, voert u deze stappen uit in een chemische kap. - Na 30 min, voorzichtig wassen de stolsels met ijskoude natrium cacodylate buffer (0,1 M) twee keer. Voeg toe 2 mL van de buffer aan elk putje, zodanig dat de klonter volledig is ondergedompeld. De goed afdekplaat met een deksel en laat het gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Na 2 min, verwijder voorzichtig de buffer met een 1 mL pipet of smalle stengel overdracht pipet. Eenmaal herhaald.
- Fix de stolsels met ijskoude Glutaaraldehyde (2%). Houden de goed plaat op ijs, voeg ongeveer 2-3 mL 2% Glutaaraldehyde aan elk putje. Zorg ervoor dat de stolsels zijn volledig ondergedompeld. Dek en laat de plaat op het ijs gedurende 30 minuten.
- Na 30 min, zachtjes de Glutaaraldehyde verwijderen uit elk putje en spoelen de stolsels met behulp van natrium cacodylate buffer (0,1 M) zoals hierboven (2 min, tweemaal) beschreven. Houd de goed plaat op ijs.
- Seriële uitdroging van clot en kritische punt drogen
- Uitdrogen van de stolsels in een gesorteerde reeks van ijskoude ethanol wast in stap 3.1.8 (20%, 50%, 80%, 100% en again100%) voor elke 5 min voorbereid. Voeg voor elke reeks ethanol, 2-3 mL, ervoor te zorgen dat de stolsels zijn ondergedompeld. Cover en incubeer op ijs.
- Verwijder de ethanol oplossing om met een 1 mL pipet of druppelaar Wegwerp pipet na elke stap ethanol. Verwijder volledig niet de ethanol. Zorg ervoor dat het oppervlak van de klonter niet wordt blootgesteld aan lucht.
Opmerking: Uitdroging in absolute ethanol (100%) moet tweemaal worden uitgevoerd. - Terwijl het monster ondergedompeld in de laatste 100% ethanol, overdragen aan een kritisch punt droger (CPD). Gebruik een monsterhouder CPD of de houder van een cover slip met een wasmachine voor de overdracht van de dia's in de bedwelmingsruimte CPD. Plaats ten minste één ring tussen elke dia.
- Neem de cover dia uit de CPD-zaal en mount het op een beginnetje van de SEM met behulp van koolstof tape.
- Sputter coating en beeldvorming
- Alle monsters met SEM stub overbrengen in de zaal sputter coating.
- Sputter jas minder dan 20 nm goud/palladium of andere geleidende materialen, zoals koolstof, met behulp van een vacuüm sputter coater.
Opmerking: We hebben gebruikt 18 nm van goud/palladium coating. De coating sputter werd uitgevoerd voor 45 s en de coating snelheid was 4 Å / s. Sputter gecoat monsters zijn stabiel wanneer goed bewaard in een droge omgeving bij kamertemperatuur gedurende enkele weken. SEM analyse kan op elk gewenst moment worden uitgevoerd. - Verwerven van beelden op een scannende elektronen microscoop voorzien van de SE2-detector op 4 kV.
Opmerking: De pixelgrootte van de afbeelding in dit beeld reeks van 13 nm-31 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de in vitro assay (troebelheid) bloedstolling, cleaves de enzym trombine fibrinogeen, wat resulteert in de vorming van fibrine netwerk24. Deze fibrine clot formatie veroorzaakt verstrooiing van het licht door de oplossing, wat resulteert in verhoogde troebelheid (Figuur 1), plateauing voor het einde van de lezing periode (Figuur 2, groen). Wanneer de fibrinogeen was geïncubeerd in aanwezigheid van Aβ42, de troebelheid van de oplossing daalde, met de curve tot een maximale hoogte van ongeveer de helft van fibrinogeen alleen (figuur 2A, blauw). In een recente publicatie, waren een aantal Aβ aggregatie blokkers gesynthetiseerd en beoordeeld op hun vermogen om te remmen de Aβ-fibrinogeen interactie, identificatie van de samengestelde TDI-276014. TDI-2760 hebben in onze studie we gebruikt om te blokkeren Aβ-fibrinogeen interactie. Zoals gemeld eerder, in aanwezigheid van de TDI-2760, het effect van was Aβ verbeterd, zoals de troebelheid hoger dan bij Aβ alleen (figuur 2A, rood was). Het effect van de TDI-2760, lijkt niet te wijten aan achtergrond turbiditeit als de verbinding niet veranderde het fibrine clot troebelheid Aβ toen afwezig (figuur 2A, paars). De in vitro stolling troebelheid assay beschreven hier is een snelle en eenvoudige methode door welke fibrine-clot vorming en factoren die dat proces verzachten kunnen kunnen worden waargenomen. GPRP, waarvan bekend is dat het verstoren van fibrine polymerisatie via het verstoren van fibrine monomeer knop holes interacties18,25 kan als positieve controle worden gebruikt voor de troebelheid assay (figuur 2B). Overeenstemming met de eerdere verslagen25, met de aanwezigheid van GPRP peptide, de troebelheid van fibrine clot was aanzienlijk verminderd in vergelijking tot de vorming van fibrine clot met haar afwezigheid (figuur 2B, blauwe versus groen).
Na het hetzelfde protocol en omstandigheden als de bepaling van de troebelheid hierboven beschreven, fibrine stolsels werden voorbereid in de aanwezigheid en de afwezigheid van Aβ en/of TDI-2760. De stolsels werden vervolgens verwerkt voor elektronenmicroscopie door fixatie, uitdroging, kritisch punt drogen en goud-sputter coating (Figuur 1). Fibrinogeen in aanwezigheid van alleen trombine en CaCl2 gevormd een maaswijdte van fibrine, met langwerpig en tussenliggende draden van fibrine, alsmede grotere bundels (figuur 3A). Toen Aβ aanwezig was, werd de draden fibrine dunner, met verschillende kleverige bosjes/aggregaten die aangeeft Aβ-geïnduceerde structurele afwijkingen (figuur 3B). In overeenstemming met de resultaten van de troebelheid assay, TDI-2760 gedeeltelijk hersteld de structuur van het fibrine clot van Aβ-geïnduceerde veranderingen, zoals minder bosjes waren aanwezig (Figuur 3 C). Samen met de troebelheid assay onthult SEM de omvang en de kwaliteit van Aβ-geïnduceerde veranderingen tot fibrine clot vorming, alsmede de doeltreffendheid van een remmende stof, TDI-2760.
Figuur 1 : Schematische weergave van fibrine clot analyse door troebelheid assay en SEM. Het schema toont de stappen die betrokken zijn bij fibrine clot analyse en het effect van Aβ op fibrine clot turbiditeit en structurele topografie. De bars van de schaal van SEM beelden (linksonder) zijn 2 µm en de vergroting is 10, 000 X. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Meting van het effect Aβ42 op in vitro fibrine clot vorming door troebelheid assay. (A) fibrinogeen was geïncubeerd in de aanwezigheid en de afwezigheid van Aβ42. Clot formatie was geïnduceerd door trombine, wat resulteert in verhoogde troebelheid van de oplossing (groen). In aanwezigheid van Aβ42, was de fibrine clot abnormaal gestructureerd, wat resulteert in verminderde troebelheid (blauw). De samengestelde TDI-2760 of DMSO werden geïncubeerd met de fibrinogeen oplossing, zowel met als zonder Aβ42. TDI-2760 gerestaureerd Aβ42-geïnduceerde daling van turbiditeit (rood) zonder dat de normale clot vorming (paars). (B) de troebelheid van een bekende Fibrinolyse-remmer, GPRP werd ook gemeten als positieve controle voor deze test. Fibrinogeen was geïncubeerd in de aanwezigheid en de afwezigheid van 1,5 µM GPRP en de troebelheid gemeten na het toevoegen van trombine. Vergelijkbaar met Aβ42, de troebelheid van fibrine clot formatie werd aanzienlijk teruggebracht in aanwezigheid van GPRP (blauw versus groen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Scanning electron microfoto van Aβ-geïnduceerde afwijkingen naar fibrine clot architectuur. Scanning electron microfoto van fibrine clot structuur verkregen uit gezuiverde fibrinogeen (A), fibrinogeen + Aβ42 (B), fibrinogeen + Aβ42 + TDI-2760 (C). Clot vorming werd ingeleid door trombine en CaCl2 toe te voegen aan het mengsel. De structurele analyse blijkt dat stolsels gevormd in aanwezigheid van Aβ42 dunner en abnormaal geklonterd ten opzichte van fibrinogeen vanzelf. TDI-2760, die is bekend dat remt Aβ42-fibrinogeen interactie, gecorrigeerd gedeeltelijk de Aβ42 veroorzaakte structurele afwijking van het fibrine clot. De bar van de schaal is 1 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methoden bieden een reproduceerbaar en snelle methode voor de beoordeling van fibrine clot vorming in vitro. Bovendien, de eenvoud van het systeem vergemakkelijkt de interpretatie van hoe Aβ invloed op de vorming van fibrine clot en structuur relatief rechttoe-rechtaan. In dit lab vorige publicatie, werd aangetoond dat deze tests kunnen worden gebruikt voor het testen van verbindingen voor hun vermogen om te remmen de Aβ-fibrinogeen interactie13,14. Met behulp van deze twee testen, een reeks van gesynthetiseerde stoffen werden geanalyseerd voor de mogelijkheid voor de remming van de Aβ-fibrinogeen interactie. Eigenlijk, de bepaling van de troebelheid clot kan worden gebruikt om een beperking van de pool van hit verbindingen die therapeutisch potentieel hebben, als niet alle verbindingen die de Aβ-fibrinogeen interactie remmen kunnen ook fibrine clot vorming herstellen kunnen.
Er zijn een paar aspecten van de troebelheid bepaling die kunnen oplossen toestaan of beperken van het gebruik van deze techniek. De belangrijkste beperking is dat kunnen er enkele verschillen tussen de experimenten die de interpretatie van de resultaten kunnen bemoeilijken. Sommige van deze variatie is te wijten aan de activiteit van trombine. Om op te lossen voor trombine activiteit, kunnen gebruikers meerdere concentraties van trombine voor clot-vorming activiteit voorafgaand aan begin van experimenteren met Aβ en test verbindingen testen. Onder de experimentele omstandigheden hier gepresenteerd, vergroot Aβ, bij gebrek aan fibrinogeen, niet de troebelheid van de oplossing hierboven achtergrondniveaus die aangeeft dat waargenomen troebelheid curven zijn als gevolg van fibrine polymerisatie. Echter Aβ is een peptide aggregatie-gevoelig en geen hogere concentratie van Aβ oplossing voor een zeer lange tijd bewaard bij kamertemperatuur of 37 ° C (enkele uren) fibrillar aggregaten die leiden verhoogde troebelheid tot kunnen kan vormen. Als analyseren het effect van een Aβ oplossing die voor langere tijd bij kamertemperatuur of warmer is opgeslagen, kan de status van de aggregatie van de oplossing worden bepaald door de transmissie-elektronenmicroscopie. In het protocol beschreven hier, worden vers bereide Aβ en fibrinogeen oplossingen gebruikt, die aggregatie kwesties moeten elimineren. Echter, om de kwaliteit van deze preparaten ze zijn beoordeeld door transmissie-elektronenmicroscopie. Bovendien, wanneer u een nieuwe partij van commerciële Aβ peptide, moet de omvang van oligomerisatie en oligomeren hoeveelheid worden beoordeeld door transmissie-elektronenmicroscopie. Omdat er mogelijk veel te veel variatie in peptide kwaliteit en verhouding van voorgevormde aggregaten en monomeer Aβ, die zeker gevolgen heeft voor de oligomerisatie tarief. Het is raadzaam om te controleren van de concentratie van Aβ oplossing (BCA methode) vóór het incuberen voor oligomerisatie. U wilt minimaliseren deze variaties, we geprobeerd met behulp van ten minste 0,1 mg/mL Aβ oplossing voor oligomeren vorming reactie.
Omdat deze test ook gevoelig voor kleine veranderingen in het milieu zoals temperatuur en beweging is, moeten troebelheid lezingen uit verschillende experimenten niet samen worden geanalyseerd. Dit betekent dat het aantal voorwaarden die kunnen worden vergeleken beperkt is door het aantal putten dat trombine kan gelijktijdig aan worden toegevoegd met een meerkanaalspipet (dwz., 12). Gebruikers moeten ook bewust dat viscositeit of de kleur in de buffers en test verbindingen kan leiden tot een hoge achtergrond troebelheid, verduistert het signaal van de klonter fibrine en interpretatie van het experiment te bemoeilijken. Als alle besturingselementen zijn opgenomen in elk experiment, moet het wel kunnen gemakkelijk bepalen als achtergrond signaal is het wijzigen van de extinctie van de turbiditeit.
De troebelheid assay vindt u informatie over of de vorming van het fibrine clot wordt belemmerd door Aβ en bovendien als remmer verbindingen dit effect verlichten kunnen. Echter, het niet onthullen hoe de structuur van het fibrine clot wordt gewijzigd in reactie op Aβ en/of getroffen verbindingen. Deze kwestie kan worden aangepakt door SEM, omdat dit voor directe visualisatie van de clot-architectuur zorgt. SEM is een gevestigde techniek en routinematig wordt gebruikt voor het visualiseren van clot structuur uit gezuiverde fibrinogeen of plasma. Het traditionele clot voorbereidingsproces voor SEM analyse kan echter ingewikkeld en tijdrovend. Bovendien, kleine verschillen in protocollen tussen verschillende onderzoeksgroepen kunnen maken het uitdagend om te repliceren resultaten24. Om deze kwesties werd dit geoptimaliseerd protocol ontwikkeld, waarmee het effect van Aβ ertoe dunner fibrine strengen en bosjes van eiwitten kunnen worden waargenomen (Figuur 3). Zoals gezien bij de bepaling van de troebelheid, vermindert TDI-2760 het effect van Aβ, herstel van de typische structuur van fibrine bundels (Figuur 3).
Er zijn een paar stappen in de bereiding van de monsters SEM, die ook oplossen wellicht. Bij het gebruik van zeer lage concentraties van fibrinogeen (0,5 µM of minder), de stolsels niet stevig aan het glasplaatje kan worden bevestigd en kunnen beschadigd/gewassen weg tijdens de fixatie/wassen stappen. Als met behulp van lage concentraties van fibrinogeen, kan de klonter vorming tijd, tussen de toevoeging van trombine en fixatie, worden verhoogd tot enkele uren, als dit de stabiliteit van de klonter verhogen kan. Ook moeten gebruikers Vermijd het gebruik van hoge sterkte fosfaatbuffer of fosfaatgebufferde zoutoplossing voor zowel de turbiditeit en SEM testen, als fosfaat-ionen met calcium-gemedieerde clot vorming proces interfereren kunnen. Als een andere hoge zout met buffer voor clot vorming en SEM analyse, na fixatie, gebruikt moet wassen stappen ook worden uitgevoerd met koude ddH2O.
SEM analyse van niet-geleidende monsters zoals fibrine stolsels vereist coating met geladen deeltjes zoals goud, palladium, zilver of carbon. Laagdikte is een belangrijke factor in SEM beeldbewerking, zoals het is mogelijk dat een zeer dikke metalen coating de oppervlakte topografie van ultra-structuur van het fibrine clot kan maskeren. In dit protocol, dun goud/palladium coating (minder dan 20 nm) worden gebruikt voor sputter coating. Om te bereiken van minder dan 20 nm dikte, het sputteren werd gedaan voor 45 s met een laag tarief van 4 Å / s. Deze dunne coating (18 nm) lijkt niet te maskeren de oppervlaktekenmerken van fibrine vergadering. Als echter bezorgd over het maskeren van de ultra-structuur van de klonter, koolstof coating kan worden gebruikt als alternatief voor goud/palladium, omdat dit minder "eilandjes" van moleculen van de coating op het materiaal.
Terwijl de nadruk ligt hier op de Aβ-fibrinogeen interactie is, kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast voor het analyseren van de interactie van andere proteïnen of verbindingen met het clot fibrine. Deze instructies te volgen moeten de onderzoekers kunnen reproduceren in vitro fibrine clot vorming en analyses uitvoeren met deze gestroomlijnde clot-troebelheid assay en SEM protocollen. Zoals hier wordt weergegeven met de eerder gepubliceerde remmer samengestelde TDI-2760, deze methoden bieden waardevolle informatie met betrekking tot fibrine clot formatie die kan worden toegepast op verdere studies zowel in vitro als in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Auteurs bedanken Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso en Michael Foley van Tri-institutionele Therapeutics Discovery Instituut (TDI), New York voor de synthese van Aβ-fibrinogeen interactie remmers en hun waardevolle suggesties. Auteurs dank ook de leden van de lab Strickland voor nuttige discussie. Dit werk werd gesteund door de NIH grant NS104386, de ziekte van Alzheimer Drug Discovery Foundation en Robertson therapeutische Ontwikkelingsfonds voor H.A., NIH verlenen NS50537, de Tri-institutionele Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation, en John A. Herrmann voor SS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).
- Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
- Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
- Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
- Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
- Ahn, H. J., et al. Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
- Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
- Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
- Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
- Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
- Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
- Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
- Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
- Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
- Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
- Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
- Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
- Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
- Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease. PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).
- Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
- Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).
