Summary
Présentées ici sont deux méthodes qui peuvent être utilisés individuellement ou en combinaison pour analyser l’effet de la protéine bêta-amyloïde sur structure de caillot de fibrine. Inclus est un protocole créant un caillot de fibrine in vitro , suivie de turbidité de caillot et la microscopie électronique à balayage méthodes.
Abstract
Cet article présente des méthodes pour générer des caillots de fibrine in vitro et analyser l’effet de la protéine de bêta-amyloïde (Aß) sur la formation de caillots et de la structure par spectrométrie et microscopie électronique (MEB). Bêta-amyloïdes, qui forme des agrégats amyloïdes neurotoxiques dans la maladie d’Alzheimer (ma), s’est avéré d’interagir avec le fibrinogène. Cette interaction Aβ-fibrinogène rend le caillot de fibrine structurellement anormale et résistant à la fibrinolyse. Induite par l’Aß anomalies de coagulation de la fibrine peuvent aussi contribuer aux aspects cérébro-vasculaires de la pathologie AD tels que microinfarcts, l’inflammation, ainsi que, angiopathie amyloïde (CAA). Étant donné le rôle potentiellement critique des déficits neurovasculaire dans la pathologie de la ma, développement de composés qui peuvent inhiber ou réduire l’interaction Aβ-fibrinogène a une valeur thérapeutique prometteuse. Méthodes in vitro par lequel fibrine la formation de caillots peut être facilement et systématiquement évaluée sont des outils potentiellement utiles pour développer des composés thérapeutiques. Présenté ici est un protocole optimisé pour in vitro génération du caillot de fibrine, ainsi que l’analyse de l’effet des inhibiteurs d’interaction Aβ et Aβ-fibrinogène. Le test de turbidité de caillot est rapide, hautement reproductible et peut être utilisé pour tester plusieurs conditions en même temps, ce qui permet la projection d’un grand nombre d’inhibiteurs d’Aβ-fibrinogène. Succès composés de ce dépistage peuvent être évaluées davantage pour leur capacité à améliorer Aβ-induit des anomalies structurelles de l’architecture de caillot de fibrine à l’aide de SEM L’efficacité de ces protocoles optimisés est démontrée ici en utilisant TDI-2760, un inhibiteur d’interaction Aβ-fibrinogène identifié récemment.
Introduction
Maladie d’Alzheimer (ma), une maladie neurodégénérative conduisant à un déclin cognitif chez les personnes âgées, majoritairement découle anormale bêta-amyloïde (Aß) expression, d’agrégation et dégagement ayant une déficience entraînant neurotoxicité1, 2. Malgré l’association bien caractérisée entre les agrégats de bêta-amyloïdes et AD3, les mécanismes précis qui sous-tendent la pathologie de la maladie ne sont pas bien compris4. Plus en plus évident suggère que les déficits neurovasculaires jouent un rôle dans la progression et la sévérité des AD5, comme Aβ interagit directement avec les composants de l' appareil circulatoire6. Bêta-amyloïdes a une interaction de forte affinité avec le fibrinogène7,8, qui localise également aux dépôts de bêta-amyloïdes dans les patients de l’AD et les souris modèles9,10,11. Par ailleurs, l’interaction Aβ-fibrinogène induit la formation de caillot de fibrine anormale et structure, ainsi que la résistance à la fibrinolyse9,12. Une des possibilités thérapeutiques dans le traitement de la ma est atténuer les déficits circulatoires en inhibant l’interaction entre Aβ et fibrinogène13,14. Nous avons, par conséquent, identifié plusieurs petits composés inhibant l’interaction Aβ-fibrinogène à l’aide de criblage à haut débit et la chimie médicinale approches13,14. Pour tester l’efficacité des inhibiteurs de l’interaction Aβ-fibrinogène, nous avons optimisé les deux méthodes d’analyse de in vitro formation de caillots de fibrine : coagulation test de turbidité et scanning electron microscopy (SEM)14.
Test de turbidité de caillot est une méthode simple et rapide pour le suivi de formation de caillots de fibrine en utilisant la spectroscopie UV-visible. Tant que le caillot de fibrine, formes, lumière est plus en plus dispersés et la turbidité de la solution augmente. À l’inverse, lorsque Aβ est présent, la structure du caillot de fibrine est altérée et la turbidité du mélange est réduite (Figure 1). L’effet des composés inhibiteurs peut être évaluée pour le potentiel de restaurer caillot turbidité d’anomalies induite par l’Aß. Alors que le test de turbidité permet pour l’analyse rapide des conditions multiples, il fournit des informations limitées sur le caillot forme et la structure. SEM, dans lequel la topographie des objets solides est révélée par la sonde électronique, permettant l’analyse de l’architecture 3D du caillot15,16,17,18 et l’évaluation de la façon dont la présence de bêta-amyloïdes et composés inhibiteurs et/ou modifie cette structure9,14. Les deux spectrométrie et SEM sont des techniques de laboratoire classiques qui ont été utilisés à diverses fins, par exemple, spectrophotométrie est utilisée pour surveiller l’agrégation amyloïde19,20. De même, SEM est également utilisé pour analyser le caillot de fibrine formé à partir du plasma de l’Alzheimer, Parkinson et maladies thrombo-emboliques patients21,22,23. Les protocoles présentés ici sont optimisés pour l’évaluation de la formation de caillot de fibrine de façon reproductible et rapide.
Le protocole suivant fournit les instructions pour la préparation d’un in vitro -caillot de fibrine avec et sans Aβ. Il détaille également les méthodes pour analyser l’effet des bêta-amyloïdes sur la formation de caillots de fibrine et de la structure. L’efficacité de ces deux méthodes pour mesurer l’inhibition de l’interaction d’Aβ-fibrinogène est démontrée à l’aide de TDI-2760, un petit composé inhibiteur14. Ces méthodes, individuellement et ensemble, permettent une analyse rapide et simple de in vitro formation de caillots de fibrine.
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Protocol
1. préparation du fibrinogène et Aβ42 pour l’analyse
- Préparer Aβ42 monomère de poudre lyophilisée
- Réchauffer Aβ42 poudre à température ambiante et de la rotation vers le bas à 1 500 g pendant 30 s.
- Ajouter 100 µL de hexafluoroisopropanol glacee (HFIP) par 0,5 mg de poudre de Aβ42 et incuber pendant 30 minutes sur la glace.
ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous manipulez HFIP et effectuez toutes les opérations sous une hotte chimique. - Préparer 20 µL d’extraits et de laisser que l’air films sec dans une hotte chimique pour 2-3 h. Films peut être conservé à-20 ° C.
- Reconstituer film monomère de Aβ42 dans 10 µL de frais diméthyl sulfoxyde (DMSO) en agitant dans un sonicateur bain pendant 10 min à température ambiante.
- Ajouter 190 µL de tampon de 50 mM tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris) (pH 7,4) et Pipeter monte et descend doucement.
- Supprimer les agrégats de protéines par centrifugation à 20 817 x g à 4 ° C pendant 20 min.
- Incuber le surnageant à 4 ° C pour la nuit et le lendemain Centrifuger la solution à 20 817 x g à 4 ° C pendant 20 min pour écarter d’autres agrégats de protéines.
- Mesurer la concentration de Aβ42 par dosage de l’acide (BCA) de bicinchoninic. Série diluée purifié l’albumine sérique bovine (BSA) de 1 mg/mL à 0,0625 mg/mL à produire un niveau de protéines, ajouter 10 µL de chaque étalon sur les puits d’une plaque multipuite en triple exemplaire. Diluer les échantillons Aβ 1:4 et ajouter 10 µL dans les puits en triple exemplaire. Mélanger BCA solutions A et B et ajouter 200 µL à chaque puits. Incuber 30 min à 37 ° C et de lire sur un lecteur de plaque à 562 nm. Conserver la solution d’Aβ restante sur la glace et utilisez cette préparation pour le dosage de la turbidité et SEM
- Préparer la solution de fibrinogène
- Mesurer 20 mg de poudre lyophilisée de fibrinogène dans un tube de 15 mL et une nouvelle suspension avec préchauffé 2 mL de 20 mM hydroxyethylpiperazine éthane sulfonique (HEPES) tamponné (pH 7,4).
- Incuber dans un bain-marie à 37 ° C pendant 10 min.
- Filtrer la solution à travers un filtre de seringue 0,2 µm et conserver à 4 ° C pendant 30 min. Reprendre la solution de 4 ° C et le filtre par filtre de seringue 0,1 µm pour éliminer les agrégats de fibrinogène ou préexistants de fibrine.
- Mesurer la concentration de fibrinogène par dosage de la BCA. Suivez les instructions de l’étape 1.1.8. Garder la trace de la solution de fibrinogène à 4 ° C et utilisez cette préparation pour le dosage de la turbidité et SEM
2. caillot turbidité Assay
- Dans chaque loge expérimentale de la plaque à 96 puits, ajouter 20 µL de solution de Aβ42 30 µM de l’étape 1.1.8 afin que sa concentration finale est 3,0 µM dans 200 µL de tampon. Ajouter le même volume de DMSO 5 % dans un tampon Tris 50 mM (pH 7,4) pour tamponner les puits de contrôle dans la plaque à 96 puits.
Remarque : Le volume exact de Aβ42 à cette étape n’est pas important. Pour les préparations de faible concentration, un volume plus élevé peut être utilisé, et le volume de la mémoire tampon la formation de caillot peut être ajusté. Le volume final devrait rester 200 µL. - Si les essais composés inhibiteurs, diluer le composé à la concentration de travail comme le DMSO. Ajouter composé ou le DMSO uniquement pour un contrôle dans les puits avec Aβ42 et bien mélanger.
NOTE : Solution Aβ42 devrait former une gouttelette discrète au fond du puits, le composé ou DMSO devrait être distribué directement dans le centre de la goutte. - Diluer la solution mère de fibrinogène 1.2.4 d’étape dans le tampon de la formation de caillot (un tampon HEPES 20 mM (pH 7,4), 5 mM CaCl2et 137 mM NaCl) et ajoutez-le à Aβ42 contenant et le contrôle des puits de la plaque à 96 puits. Réglez le volume de la solution de fibrinogène afin que sa concentration finale devient 1,5 µM dans 200 µL réaction valorisé. La solution, déposer lentement et éviter la formation de bulles. Incuber les plaques à température ambiante pendant 30 min en secouant sur une plate-forme tournante.
Remarque : Le volume de solution de fibrinogène peut varier selon sa concentration en stock, mais le volume total dans chacun devrait bien être 170 µL en incubation. - Préparer la solution de thrombine en dissolvant la poudre de thrombine commercialement purifiée dans ddH2O pour faire une solution de 50 U/mL. Diluer à la solution de travail 5 U/mL dans un tampon HEPES 20 mM (pH 7,4) directement avant utilisation.
- Après 30 min d’incubation, en même temps ajouter 30 µL de solution de thrombine (5 U/mL) dans les solutions de fibrinogène dans la plaque à 96 puits de 2,3 étape à l’aide de la pipette multicanaux. Addition de thrombine mettent immédiatement en branle la formation de caillots. Par conséquent, ajouter la thrombine directement dans le centre de la solution de fibrinogène avec soin afin d’éviter la formation de bulles.
Remarque : L’activité de la thrombine peut varier entre des conditions expérimentales, mais aussi beaucoup de thrombine. La concentration correcte requise pour produire robuste caillots peut-être devoir être déterminées empiriquement. - Lire l’absorbance d’in vitro caillot sur un lecteur de plaque immédiatement après l’addition de thrombine. Mesurer l’absorbance à 350 nm au cours des 10 min, chaque 30-60 s. effectuer l’essai entier à température ambiante.
Remarque : Certains composés inhibiteurs peuvent altérer l’absorbance de la solution à 350 nm, dans lequel cas la turbidité peut être mesurée à 405 nm.
3. microscopie électronique
- Préparation du caillot, la fixation et lavage
- Endroit propre siliconé lames de couverture cercle de verre (12 mm) dans une assiette de 12 puits ou 24 puits avec une pincette.
- Préparer le fibrinogène dans le tampon de la formation de caillot. Voir protocole étape 1.2 pour plus de détails.
- Pour évaluer l’effet des inhibiteurs de l’interaction Aβ-fibrinogène sur structure de caillot de fibrine, suivez les instructions pour l’incubation comme décrit pour le dosage de la turbidité (étape 2). Incluez toujours les puits témoins contenant fibrinogène en l’absence de bêta-amyloïdes et inhibiteurs.
- Distribuer 80 µL du mélange de l’étape 3.1.3 sur les diapositives de couverture fibrinogène. Délicatement étalées la solution afin qu’elle est répartie sur la diapositive de la couverture.
- Diluer le stock de thrombine (50 U/mL) dans une solution saline de 20 mM HEPES tamponnée à une concentration finale de 2,5 U/mL et ajouter 20 µL directement au centre de la solution de fibrinogène sans mélange.
Remarque : Si nécessaire, une concentration plus élevée de travail thrombine (5 U/mL) peut être utilisée. - Couvrir la plaque de 12 puits avec un couvercle en plastique et laissez-le à température ambiante pendant 30-60 min.
- Tandis que la réaction de coagulation est en marche, préparer des solutions de déshydratation et de la fixation. Préparer le tampon de cacodylate de sodium (0,1 M, pH 7,4). Diluer la solution glutaraldéhyde 10 % dans du tampon de cacodylate de sodium (0,1 M, pH 7,4) pour faire une solution de glutaraldéhyde diluée de 2 %. Garder toutes ces solutions sur la glace. Glutaraldéhyde fraîchement diluée (2 %) doit être utilisé dans la semaine, lorsque entreposé dans un réfrigérateur à 4 ° C.
- Diluer l’éthanol absolu (100 %) dans l’eau bidistillée (80 %, 50 % et 20 % d’éthanol). Gardez ces solutions d’éthanol et l’éthanol absolu (100 %) sur la glace.
Attention: Soyez prudent lorsque vous manipulez le cacodylate de sodium et le glutaraldéhyde, effectuez ces opérations sous une hotte chimique. - Après 30 min, laver doucement les caillots avec tampon de cacodylate de sodium glacee (0,1 M). Ajouter 2 mL de tampon dans chaque puits, tels que le caillot est complètement immergé. Couvrir la plaque bien avec un couvercle et laissez-le pendant 2 min à température ambiante. Après 2 min, retirez délicatement le tampon à l’aide d’une pipette 1 mL ou une pipette de transfert tige étroite. Répéter une fois.
- Difficulté les caillots au glutaraldéhyde glacé (2 %). Garder la plaque bien sur la glace, ajouter environ 2-3 mL de glutaraldéhyde à 2 % dans chaque puits. Veillez à ce que les caillots sont complètement immergés. Couvrez et laissez la plaque sur la glace pendant 30 min.
- Après 30 min, retirez le glutaraldéhyde de chaque puits doucement et laver les caillots à l’aide de tampon de cacodylate de sodium (0,1 M) tel que décrit ci-dessus (2 min, deux fois). Maintenir la plaque bien sur la glace.
- Série déshydratation du caillot et du séchage du point critique
- Déshydrater les caillots dans une série graduée de lave-éthanol glacé, préparé à l’étape 3.1.8 (20 %, 50 %, 80 %, 100 % et again100 %) de 5 min chacun. Pour chaque série d’éthanol, ajouter 2 à 3 mL, en s’assurant que les caillots sont submergées. Couvrir et laisser incuber sur la glace.
- Après chaque étape de l’éthanol, supprimer la solution d’éthanol à l’aide d’une pipette 1 mL ou un compte-gouttes pipette à usage unique. Ne pas enlever complètement l’éthanol. Assurez-vous que la surface de caillot n’est pas exposée à l’air.
NOTE : Déshydratation de l’éthanol absolu (100 %) doit être effectuée deux fois. - Tout en gardant l’échantillon immergé dans la finale 100 % d’éthanol, transfert à un point critique sèche (CPD). Utiliser un porte-échantillon DPC ou le titulaire de la lamelle couvre-objet avec une rondelle pour transférer les diapositives dans la chambre de la CPD. Placez au moins une rondelle entre chaque diapositive.
- Sortir la lame de la couverture de la chambre de DPC et montez-la sur un talon de SEM à l’aide de ruban de carbone.
- Pulvérisation cathodique revêtement et imagerie
- Transférer tous les échantillons avec talon de SEM dans la chambre de revêtement par pulvérisation cathodique.
- Par pulvérisation cathodique manteau inférieur à 20 nm d’or/palladium ou autres matériaux conducteurs, comme le carbone, à l’aide d’une coucheuse par pulvérisation cathodique sous vide.
NOTE : Nous avons utilisé 18 nm de revêtement or/palladium. Le revêtement par pulvérisation cathodique a été réalisé pour 45 s et la vitesse de revêtement a 4 Å / s. échantillons de pulvérisation enduite sont stables lorsqu’ils sont conservés correctement dans un endroit sec à température ambiante pendant quelques semaines. SEM analyse peut être effectuée à tout moment. - Acquisition d’images sur un microscope électronique à balayage équipé avec le détecteur de SE2 à 4 kV.
Remarque : Taille de pixel de l’image dans cette image la valeur gamme de 13 nm-31 nm.
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Representative Results
Dans in vitro test (turbidité) de la coagulation, la thrombine enzyme clive fibrinogène, entraînant la formation de la fibrine réseau24. Cette formation de caillot de fibrine entraîne la diffusion de la lumière passant à travers la solution, ce qui entraîne une augmentation de la turbidité (Figure 1), plafonnement avant la fin de la période de lecture (Figure 2, vert). Lorsque le fibrinogène est incubé en présence de Aβ42, la turbidité de la solution diminue, avec la courbe pour atteindre une hauteur maximale de près de la moitié celui de fibrinogène seul (Figure 2 a, bleu). Dans une publication récente, une série d’inhibiteurs de l’agrégation Aβ ont été synthétisés et évalués pour leur capacité à inhiber l’interaction Aβ-fibrinogène, identifier les composés TDI-276014. Nous avons utilisé des TDI-2760 dans notre étude pour bloquer l’interaction Aβ-fibrinogène. Comme indiqué précédemment, en présence de TDI-2760, l’effet des bêta-amyloïdes a été amélioré, comme la turbidité était supérieure à celle d’Aβ seul (Figure 2 a, rouge). L’effet du TDI-2760 ne semble pas être en raison de la turbidité de fond comme le composé n’a pas changé la turbidité de caillot de fibrine lorsque Aβ était absent (Figure 2 a, pourpre). L' in vitro de coagulation test de turbidité décrite ici est une méthode rapide et simple par laquelle caillot de fibrine-formation et les facteurs qui peuvent atténuer ce processus peuvent être observés. GPRP, qui est appelé à interférer avec la polymérisation de la fibrine par interférant avec le monomère de fibrine-l’orifice de la poignée des interactions18,25 peut servir de témoin positif pour le dosage de la turbidité (Figure 2 b). Compatible avec les précédents rapports25, avec la présence du peptide GPRP, la turbidité de caillot de fibrine est significativement réduite par rapport à la formation de caillots de fibrine avec son absence (Figure 2 b, bleu vs verts).
Suivant le même protocole et conditions que le test de turbidité décrites ci-dessus, les caillots de fibrine ont été préparés en présence et en absence d’Aβ et/ou TDI-2760. Les caillots sont ensuite traitées pour la microscopie électronique par la fixation, la déshydratation, séchage des points critiques et or-cathodique revêtement (Figure 1). Fibrinogène en présence seulement la thrombine et CaCl2 forme un maillage de fibrine, avec filetage allongé et intercalés de fibrine, mais aussi les plus gros faisceaux (Figure 3 a). Quand Aβ était présent, les threads de fibrine est devenu plus minces, avec plusieurs touffes/agrégats collants indiquant les anomalies structurelles induite par l’Aß (Figure 3 b). Cohérente avec les résultats de titrage de turbidité, TDI-2760 partiellement restauré la structure du caillot de fibrine des changements induits par l’Aß, car moins massifs étaient présents (Fig. 3 C). Ainsi que le dosage de la turbidité, SEM révèle l’étendue et la qualité des changements induits par l’Aß à la formation de caillots de fibrine, ainsi que l’efficacité d’un composé inhibiteur, TDI-2760.
Figure 1 : Représentation schématique de l’analyse de caillot de fibrine par dosage de turbidité et SEM. Le schéma montre les étapes de l’analyse de caillot de fibrine et l’effet de l’Aß sur la turbidité de caillot de fibrine et de la topographie structurelle. Les barres d’échelle d’images (en bas à gauche) de la SEM 2 µm et le grossissement est de 10, 000 X. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Mesure de l’effet Aβ42 sur in vitro formation de caillot de fibrine par dosage de la turbidité. (A) fibrinogène est incubé en présence et en absence de Aβ42. La formation de caillots est induite par la thrombine, résultant en une augmentation de la turbidité de la solution (vert). En présence de Aβ42, le caillot de fibrine était anormalement structuré, ce qui entraîne une diminution de la turbidité (bleu). Le composé TDI-2760 ou le DMSO sont incubées avec la solution de fibrinogène, avec et sans Aβ42. TDI-2760 restauré Aβ42 induite par la diminution de la turbidité (rouge) sans altérer la formation de caillots normal (violet). (B) la turbidité d’un inhibiteur de la fibrinolyse connus, GPRP a également été mesurée comme témoin positif pour ce dosage. Fibrinogène est incubé en présence et en absence de 1,5 µM GPRP et la turbidité mesurée après l’addition de thrombine. Semblable à Aβ42, la turbidité de la formation de caillots de fibrine est significativement réduite en présence de GPRP (bleu et vert). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Balayage des micrographies d’induite par l’Aß anomalies à l’architecture de caillot de fibrine. Numérisation des micrographies de structure de caillot de fibrine provenant de fibrinogène purifiée (A), fibrinogène + Aβ42 (B), fibrinogène + Aβ42 + TDI-2760 (C). La formation de caillots a été initiée en ajoutant de la thrombine et CaCl2 au mélange. L’analyse structurale a révélé que les caillots formés en présence de Aβ42 sont plus minces et anormalement contagieuse par rapport au fibrinogène par lui-même. TDI-2760, qui est connu pour inhiber l’interaction Aβ42-fibrinogène, partiellement corrigé l’anomalie structurelle Aβ42 induite dans le caillot de fibrine. Barre d’échelle est 1 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les méthodes décrites ici constituent un moyen reproductible et rapid d’évaluation de fibrine caillot formation in vitro. En outre, la simplicité du système rend l’interprétation de la façon dont Aβ affecte la formation de caillots de fibrine et la structure relativement simple. La dernière publication de ce laboratoire, il a été démontré que ces tests peuvent servir à tester les composés pour leur capacité à inhiber l’Aβ-fibrinogène interaction13,14. Une série de composés synthétisés à l’aide de ces deux essais, on a analysé la capacité d’inhiber l’interaction Aβ-fibrinogène. En fait, le test de turbidité de caillot peut être utilisé pour affiner la piscine de succès composés à ceux qui ont un potentiel thérapeutique, que pas tous les composés qui peuvent inhiber l’interaction Aβ-fibrinogène peuvent également restaurer la formation de caillots de fibrine.
Il y a quelques aspects de l’essai de turbidité qui peuvent exiger de dépannage ou restreindre l’utilisation de cette technique. La principale limitation est qu’il peut y avoir quelques variations entre les expériences qui peuvent compliquer l’interprétation des résultats. Une partie de cette variation est due à l’activité de la thrombine. Pour dépanner pour l’activité de la thrombine, les utilisateurs peuvent tester plusieurs concentrations de thrombine pour l’activité de la formation de caillots avant de commencer l’expérimentation avec des composés Aβ et de test. Dans les conditions expérimentales présentées ici, bêta-amyloïdes, en l’absence de fibrinogène, n’augmente pas la turbidité de la solution au-dessus des niveaux de fond qui indique qui a observé les courbes de turbidité résultent de la polymérisation de la fibrine. Cependant, Aß est un peptide sujettes à l’agrégation et une plus forte concentration de la solution d’Aβ lorsqu’ils sont conservés pendant une très longue période à température ambiante ou à 37 ° C (plusieurs heures) peut former des agrégats fibrillaires qui peuvent entraîner une augmentation de la turbidité. Si l’analyse de l’effet une solution de bêta-amyloïdes qui a été stockée pendant de longues périodes de temps à température ambiante ou plus chaud, l’état d’agrégation de la solution peut être déterminé par microscopie électronique à transmission. Dans le protocole décrit ici, solutions Aβ et de fibrinogène fraîchement préparées sont utilisées, qui devrait éliminer les problèmes de l’agrégation. Toutefois, pour assurer la qualité de ces préparations ont été évaluées par microscopie électronique à transmission. En outre, lorsque vous utilisez un nouveau lot de commercial peptide Aβ, l’importance d’oligomérisation et quantité d’oligomères devrait évaluée par microscopie électronique à transmission. Parce qu’il pourrait y avoir un lot à variation dans la qualité de peptide et rapport des agrégats préformés et Aβ monomère, qui influe certainement sur le taux d’oligomérisation. Il est conseillé de vérifier la concentration de bêta-amyloïdes solution (méthode BCA) avant incubation d’oligomérisation. Pour minimiser ces variations, nous avons essayé d’utiliser au moins 0,1 mg/mL de solution d’Aβ pour la réaction de formation d’oligomères.
Parce que ce dosage est également sensible aux petits changements environnementaux comme la température et le mouvement, lectures de turbidité différentes expériences de ne devraient pas être analysés. Cela signifie que le nombre de conditions qui peuvent être comparées est limité par le nombre de puits que la thrombine peut être ajoutée en même temps à avec une pipette multicanaux (i.e., 12). Les utilisateurs doivent être également au courant de que cette viscosité ou la couleur dans les tampons et les composés d’essai peut conduire à une turbidité ambiants, obscurcissant le signal provenant du caillot de fibrine et rendant difficile l’interprétation de l’expérience. Toutefois, si tous les contrôles sont inclus dans chaque expérience, il devrait être possible de déterminer facilement si le signal de fond est altérant l’absorbance de la turbidité.
Le dosage de la turbidité fournit des informations sur la question de savoir si la formation du caillot de fibrine est entravée par Aβ et de plus si les composés inhibiteurs peuvent atténuer cet effet. Toutefois, il ne révèlent comment la structure du caillot de fibrine est modifiée en réponse aux bêta-amyloïdes et/ou frappé composés. Cette question peut être résolue par SEM, car cela permet une visualisation directe de l’architecture du caillot. SEM est une technique bien établie et est régulièrement utilisée pour visualiser la structure du caillot de fibrinogène purifiée ou de plasma. Toutefois, le processus d’élaboration traditionnelle caillot pour analyse SEM peut être complexe et chronophage. En outre, de petites différences dans les protocoles entre différents groupes de recherche peuvent rendre difficile de reproduire les résultats24. Pour résoudre ces problèmes, ce protocole optimisé a été développé, avec laquelle l’effet de Aβ pour induire des brins plus minces de fibrine et de touffes de protéine peuvent être observés (Figure 3). Comme on le voit avec le test de turbidité, TDI-2760 atténue l’effet des bêta-amyloïdes, restaurer la structure typique des faisceaux de fibrine (Figure 3).
Il y a quelques étapes dans la préparation des échantillons SEM, qui peut-être également exiger de dépannage. Lors de l’utilisation de très faibles concentrations de fibrinogène (0,5 µM ou moins), les caillots ne peut pas être solidement fixées à la lame de verre et peut être endommagé/lavé loin pendant les étapes de fixation/lavage. Si l’utilisation de faibles concentrations de fibrinogène, le temps de formation de caillot, entre l’addition de thrombine et de fixation, peut être augmentée jusqu'à plusieurs heures, car cela peut augmenter la stabilité du caillot. Aussi, les utilisateurs devraient éviter à l’aide du tampon phosphate haute résistance ou une solution saline tamponnée au phosphate pour la turbidité et des essais de SEM, ions phosphates peuvent interférer avec le processus de formation de caillot induite par le calcium. Si vous utilisez un autre sel élevé contenant un tampon pour la formation de caillots et l’analyse de la SEM, après fixation, étapes de lavage doit également avoir lieu avec ddH froid2O.
SEM l’analyse des échantillons non conducteurs comme les caillots de fibrine requiert revêtement avec particules chargées telles que, or, palladium, argent ou carbone. L’épaisseur du revêtement est un facteur important dans l’imagerie de la SEM, tel qu’il est possible qu’un revêtement métallique très épais peut masquer la topographie de surface ultra-structure du caillot de fibrine. Dans ce protocole, mince revêtement or/palladium (moins de 20 nm) sont utilisés pour le revêtement par pulvérisation cathodique. Pour parvenir à moins de 20 épaisseur nm, la pulvérisation a été fait pour 45 s avec un taux de revêtement de 4 Å / s. Ce revêtement mince (18 nm) n’apparaît pas à masquer les caractéristiques de la surface de montage de la fibrine. Toutefois, si préoccupé par masquant l’ultra-structure du caillot, revêtement de carbone peut servir comme alternative à l’or/palladium, car il laissera moins « îlots » de molécules de revêtement sur le matériel.
Alors que met ici l’accent est sur l’interaction d’Aβ-fibrinogène, ce protocole peut être facilement modifié pour analyser l’interaction d’autres protéines ou composés avec le caillot de fibrine. En suivant ces instructions, enquêteurs devraient être en mesure de reproduire in vitro formation de caillots de fibrine et effectuer une analyse avec ces dosage simplifié caillot-turbidité et les protocoles de SEM. Comme le montre ici avec l’inhibiteur publiée antérieurement composé TDI-2760, ces méthodes fournissent des renseignements précieux au sujet de la formation de caillots de fibrine qui peut s’appliquer à d’autres études in vitro et in vivo.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Auteurs remercient Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso et Michael Foley de Tri-institutionnels Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York pour la synthèse d’inhibiteurs d’interaction Aβ-fibrinogène et leurs précieuses suggestions. Auteurs remercient également les membres du laboratoire Strickland de discussion utile. Ce travail a été soutenu par les NIH grant NS104386, Alzheimer Drug Discovery Foundation et fonds de développement thérapeutique Robertson pour H.A., NIH grant NS50537, la Tri-institutionnels Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation et John A. Herrmann pour la S.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
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