Summary
Presenteres her er to metoder som kan brukes individuelt eller sammen for å analysere effekten av beta-amyloid fibrin blodpropp struktur. Inkludert er en protokoll for å opprette en i vitro fibrin blodpropp, etterfulgt av blodpropp turbiditet og skanning elektronmikroskop metoder.
Abstract
Denne artikkelen presenterer metoder for å generere i vitro fibrin clots og analysere effekten av beta-amyloid (Aβ) protein på blodpropp dannelse og struktur av massespektrometri og skanning elektronmikroskop (SEM). Aβ, som danner nevrotoksiske amyloid aggregater i Alzheimers sykdom (AD), har vist å samhandle med fibrinogen. Dette Aβ-fibrinogen interaksjon gjør fibrin blodpropp strukturelt unormale og motstandsdyktig mot fibrinolyse. Aβ-indusert unormalt i fibrin clotting kan også bidra til cerebrovascular aspekter av AD patologi som microinfarcts, betennelse, i tillegg til, cerebral amyloid angiopathy (CAA). Gitt den potensielt kritiske rollen nevrovaskulære underskudd i AD patologi, har utvikle forbindelser som kan hemme eller redusere Aβ-fibrinogen interaksjon lovende terapeutisk verdi. In vitro metoder av hvilke fibrin blodpropp formasjon kan lett og systematisk vurderes er potensielt nyttig verktøy for utvikling av terapeutiske forbindelser. Presenteres her er en optimalisert protokoll for i vitro generasjon fibrin blodpropp, samt analyse av effekten av Aβ og Aβ-fibrinogen interaksjon hemmere. Blodpropp turbiditet analysen er raske, svært reproduserbare og kan brukes til å teste flere vilkår samtidig, tillater for screening av store mengder Aβ-fibrinogen-hemmere. Hit forbindelser fra dette programmet kan evalueres videre for sin evne til å forbedre Aβ-indusert strukturelle unormale fibrin blodpropp arkitekturen ved hjelp av SEM. Effektiviteten av disse optimalisert protokollene er vist her med TDI-2760, en nylig identifisert Aβ-fibrinogen interaksjon inhibitor.
Introduction
Alzheimers sykdom (AD), en nevrodegenerativ sykdommen fører til kognitiv svikt hos eldre pasienter, hovedsakelig oppstår fra unormal beta-amyloid (Aβ) uttrykk, aggregering og svekket klarering resulterer i nevrotoksisitet1, 2. til tross for godt karakterisert foreningen Aβ aggregater og AD3, presis mekanismene bak sykdom patologi er ikke godt forstått4. Økende bevis antyder at nevrovaskulære underskudd spille en rolle i progresjonen og alvorlighetsgraden av AD5, som Aβ direkte samspill med komponentene av sirkulasjonssystemet6. Aβ har en høy affinitet interaksjon med fibrinogen7,8, som også regionaliserer Aβ innskudd i både AD pasienter og musen modeller9,10,11. Videre, Aβ-fibrinogen interaksjon induserer unormal fibrin-blodpropp dannelse og struktur, samt motstand mot fibrinolyse9,12. En terapeutisk mulighet i behandling av Annonsen, er lindre sirkulasjons underskudd begrenser samspillet mellom Aβ og fibrinogen13,14. Vi har derfor identifisert flere små forbindelser hemme Aβ-fibrinogen interaksjon med høy gjennomstrømning screening og medisinsk kjemi tilnærminger13,14. For å teste effekten av Aβ-fibrinogen interaksjon hemmere, optimalisert vi to metoder for analyse av i vitro fibrin blodpropp formasjon: levre turbiditet analysen og skanning elektronmikroskop (SEM)14.
Blodpropp turbiditet analysen er en rett fram og rask metode for å overvåke fibrin blodpropp formasjon bruker UV-synlig spektroskopi. Som fibrin blodpropp former, lys er stadig spredt og turbiditet løsningen øker. Motsatt, når Aβ, strukturen til fibrin blodpropp endres, og turbiditet av blandingen reduseres (figur 1). Effekten av hemmende forbindelser kan vurderes for potensial til å gjenopprette blodpropp turbiditet fra Aβ-indusert unormalt. Mens turbiditet analysen gir rask analyse av flere vilkår, gir det begrenset informasjon på blodpropp form og struktur. SEM, der topografien massive objekter er avslørt av elektron sonde, tillater analyse av blodpropp15,16,17,18 3D arkitektur og vurdering av hvordan tilstedeværelsen av Aβ og / eller hemmende forbindelser endrer at strukturen9,14. Både massespektrometri og SEM er klassisk laboratorium teknikker som er brukt for ulike formål, for eksempel spectrophotometry brukes for overvåking amyloid aggregering19,20. Tilsvarende er SEM også brukt til å analysere fibrin blodpropp dannet fra plasma av Alzheimers, Parkinson og thromboembolic slag pasienter21,22,23. Protokollene som presenteres her er optimalisert for å vurdere fibrin-blodpropp formasjon i en reproduserbar og rask måte.
Følgende protokollen gir instruksjoner for utarbeidelse av en i vitro fibrin-blodpropp både med og uten Aβ. Det har også detaljer metodene for å analysere effekten av Aβ fibrin blodpropp dannelse og struktur. Effektiviteten av disse to metodene for å måle hemming av Aβ-fibrinogen interaksjon er demonstrert med TDI-2760, en liten hemmende sammensatte14. Disse metodene, tillater både individuelt og sammen, rask og enkel analyse av i vitro fibrin blodpropp formasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av Aβ42 og Fibrinogen for analyse
- Forberede monomerisk Aβ42 fra lyofiliserte pulveret
- Varme Aβ42 pulver til romtemperatur og spinn ned 1500 x g for 30 s.
- Legg til 100 µL av iskalde hexafluoroisopropanol (HFIP) per 0,5 mg av Aβ42 pulver og ruge i 30 min på is.
FORSIKTIG: Vær forsiktig når du håndterer HFIP og utfører alle trinnene i en kjemisk hette. - Forberede 20 µL dele og la filmer luften tørr i kjemisk hette for 2-3 h. filmer kan lagres på 20 ° C.
- Rekonstituer monomerisk Aβ42 filmen i 10 µL av fersk dimethyl sulfoxide (DMSO) av agitasjon en bad sonicator i 10 min ved romtemperatur.
- Legg til 190 µL 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) bufferen (pH 7.4) og Pipetter forsiktig opp og ned.
- Fjerne protein aggregater med sentrifugering 20,817 x g ved 4 ° C i 20 min.
- Inkuber nedbryting på 4 ° C for overnatting og neste dag sentrifuge løsningen på 20,817 x g ved 4 ° C for 20 min forkaste ytterligere protein aggregat.
- Måle Aβ42 konsentrasjon av bicinchoninic syre (BCA) analysen. Seriell fortynne renset bovin serum albumin (BSA) fra 1 mg/mL til 0.0625 mg/mL å produsere en protein-standard, legge 10 µL av hver standard fordelt av en flere godt plate i tre eksemplarer. Fortynn Aβ prøver 1:4 og legger 10 µL brønnene i tre eksemplarer. Bland BCA løsninger A og B og tilsett 200 µL i hver brønn. Inkuber i 30 min på 37 ° C og lese på en plate leser på 562 nm. Holde de gjenværende Aβ løsningen på is og bruke dette preparatet for turbiditet analysen og SEM.
- Forberede Fibrinogen løsning
- Mål 20 mg lyofilisert fibrinogen pulver i en 15 mL tube og å suspendere med forvarmes 2 mL 20 mM hydroxyethylpiperazine etan sulfonsyre (HEPES) buffer (pH 7.4).
- Inkuber i et vannbad 37 ° C i 10 min.
- Filtrere løsning gjennom filtere 0,2 µm sprøyten og lagre på 4 ° C i 30 min. Ta ut løsningen fra 4 ° C og filter igjen gjennom 0,1 µm sprøyte filter fjerner fibrinogen aggregater eller eksisterende fibrin.
- Måle fibrinogen konsentrasjonen av BCA analysen. Følg instruksjonene i trinn 1.1.8. Hold den gjenværende fibrinogen-løsningen på 4 ° C og bruke dette preparatet for turbiditet analysen og SEM.
2. clot turbiditet analysen
- Hver eksperimentelle brønn av 96-brønns plate, Legg 20 µL av 30 µM Aβ42 løsning fra trinn 1.1.8 slik at siste konsentrasjonen er 3.0 µM i 200 µL av bufferen. Legge til den samme mengden 5% DMSO 50 mM Tris buffer (pH 7.4) å bufre kontroll brønner i 96-brønnen plate.
Merk: Den nøyaktige mengden Aβ42 på dette trinnet er ikke viktig. For lav konsentrasjon forberedelser, et høyere volum kan brukes, og volumet av blodpropp formasjon bufferen kan justeres. Det siste bindet bør forbli 200 µL. - Hvis du tester hemmende forbindelser, fortynne sammensatt å arbeide konsentrasjonen som DMSO. Legge til sammensatte eller DMSO alene for en kontroll fordelt med Aβ42 og bland godt.
Merk: Aβ42 løsningen bør danne et diskret slippverktøy på bunnen av brønnen, sammensatte eller DMSO bør være pipetted direkte i midten av slippverktøyet. - Fortynn fibrinogen lager løsningen fra trinn 1.2.4 blodpropp formasjon buffer (20 mM HEPES buffer (pH 7.4), 5 mM CaCl2og 137 mM NaCl) og legge den til Aβ42 som inneholder og kontroll brønner i 96-brønnen platen. Juster volumet på den fibrinogen løsningen slik at siste konsentrasjonen blir 1,5 µM i totalt 200 µL reaksjon volum. Pipetter løsningen sakte og unngå danner bobler. Inkuber platen ved romtemperatur for 30 min rister på en roterende plattform.
Merk: Volumet av fibrinogen løsning kan variere avhengig av lager konsentrasjonen, men det totale volumet i hver vel bør være 170 µL mens inkubasjon. - Klargjør trombin løsning ved oppløsning kommersielt renset trombin pulver i ddH2O å en lager løsning av 50 U/mL. Fortynne 5 U/mL arbeider løsningen i 20 mM HEPES buffer (pH 7.4) direkte før bruk.
- Etter 30 min med inkubering, Legg 30 µL trombin løsning (5 U/mL) i fibrinogen-løsninger i 96-brønnen platen fra trinn 2.3 bruke flerkanals pipette. Tillegg av trombin vil umiddelbart starte blodpropp dannelse. Derfor legge trombin direkte i midten av den fibrinogen løsningen med forsiktighet for å unngå danner bobler.
Merk: Aktiviteten til trombin kan variere mellom eksperimentelle forhold, samt trombin massevis. Riktig konsentrasjon kreves for å produsere robust clots må bestemmes empirisk. - Les absorbansen av i vitro blodpropp på en plate leser umiddelbart etter trombin tillegg. Måle absorbansen på 350 nm i løpet av 10 min, hver 30-60 s. Utfør hele analysen ved romtemperatur.
Merk: Noen hemmer forbindelser kan endre løsning absorbansen på 350 nm, som tilfellet turbiditet kan måles ved 405 nm.
3. skanning elektronmikroskop
- Utarbeidelse av blodpropp, fiksering og vask
- Silikoniserte sted rent glass sirkel dekke lysbilder (12 mm) i en 12-godt eller 24-vel plate ved hjelp av pinsett.
- Forberede fibrinogen blodpropp formasjon buffer. Se protokollen trinn 1.2 for detaljer.
- For å evaluere effekten av Aβ-fibrinogen interaksjon hemmere på fibrin blodpropp struktur, følger du instruksjonene for inkubasjon som turbiditet analysen (trinn 2). Alltid inkludere kontroll brønner som inneholder fibrinogen i fravær av både Aβ og hemmere.
- Pipetter 80 µL av fibrinogen blandingen fra trinn 3.1.3 på dekselet lysbildene. Forsiktig spre løsningen slik at den fordeles jevnt på dekselet lysbildet.
- Fortynne trombin lager (50 U/mL) til 20 mM HEPES bufret saline til en siste konsentrasjon av 2,5 U/mL og legge til 20 µL direkte i midten av fibrinogen løsningen uten blanding.
Merk: Hvis nødvendig, en høyere trombin arbeider konsentrasjon (5 U/mL) brukes. - Dekkramme 12-vel med plast lokk og la den ved romtemperatur for 30-60 minutter.
- Mens clotting reaksjon kjører, forberede dehydrering og fiksering løsninger. Forberede natrium cacodylate buffer (0.1 M, pH 7.4). Fortynne 10% glutaraldehyde lagerløsning natrium cacodylate buffer (0.1 M, pH 7.4) å gjøre en 2% arbeider løsning av glutaraldehyde. Holde alle disse løsningene på is. Fersk utvannet glutaraldehyde (2%) bør brukes innen 1 uke, når skal oppbevares i kjøleskap på 4 ° C.
- Fortynne absolutt etanol (100%) i dobbel destillert vann (80%, 50% og 20% etanol). Holde disse etanol løsninger og absolutt etanol (100%) på is.
Forsiktig: Vær forsiktig når du håndterer natrium cacodylate og glutaraldehyde, utføre trinnene i en kjemisk hette. - Etter 30 min, forsiktig vaske clots med iskald natrium cacodylate buffer (0.1 M) to ganger. Tilsett 2 mL bufferen hver brønn slik at blodpropp er helt dekket. Dekk godt platen med et lokk og la det i 2 minutter ved romtemperatur. Etter 2 min, Fjern bufferen bruker 1 mL pipette eller smale stilk overføring pipette. Gjentas én gang.
- Fiks clots med iskald glutaraldehyde (2%). Holde godt plate is, legge til rundt 2-3 mL 2% glutaraldehyde i hver brønn. Kontroller at clots helt senkes. Dekk og la platen på is 30 min.
- Etter 30 min, forsiktig fjerne glutaraldehyde fra hver brønn og vask clots med natrium cacodylate buffer (0.1 M) som beskrevet ovenfor (2 min, to ganger). Hold godt plate is.
- Seriell dehydrering blodpropp og kritisk punkt tørking
- Tørke clots i en gradert rekke iskaldt etanol vasker i trinn 3.1.8 (20%, 50%, 80%, 100% og again100%) i 5 min. Legge til 2-3 mL, gjør at clots senkes Serienavn etanol. Dekk og ruge på is.
- Etter hvert etanol trinn, kan du fjerne etanol løsningen bruker 1 mL pipette eller disponibel pipette dropper. Ikke Fjern etanol helt. Kontroller at blodpropp overflaten ikke utsettes for luft.
Merk: Dehydrering i absolutt etanol (100%) skal utføres to ganger. - Samtidig prøven senkes i de siste 100% etanol, overføre til et kritisk punkt tørketrommel (CPD). Bruk CPD eksempel innehaver eller en cover slip holder med en skive for overføring lysbildene i CPD kammeret. Legg til minst én gummiskive mellom hvert lysbilde.
- Ta dekselet lysbildet fra CPD kammeret og montere den på en SEM spire med karbon tape.
- Spraking belegg og bildebehandling
- Overføre alle prøvene med SEM stub til frese belegg kammeret.
- Frese pels mindre enn 20 nm gull/palladium eller andre ledende materialer som karbon, bruker et vakuum frese coater.
Merk: Vi har brukt 18 nm i gull/palladium belegg. Frese belegget ble utført for 45 s og belegg hastigheten var 4 Å / s. frese belagt prøver er stabilt når holdt riktig i tørre omgivelser ved romtemperatur for ukene. SEM analyse kan utføres når som helst. - Hente bilder på en scanning elektron mikroskop utstyrt med SE2 detektoren på 4 kV.
Merk: Pixel bildestørrelsen i dette bildet angi fra 13 nm-31 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vitro clotting (turbiditet) analysen kløyver enzym trombin fibrinogen, noe som resulterer i dannelsen av fibrin nettverk24. Denne fibrin blodpropp formasjon fører til spredning av lyset passerer gjennom løsningen, noe som resulterer i økt turbiditet (figur 1), plateauing før slutten av lesing perioden (figur 2, grønn). Når fibrinogen var ruges i nærvær av Aβ42, turbiditet løsningen redusert med kurven nå en maksimal høyde på omtrent halvparten av fibrinogen alene (figur 2A, blå). I en fersk publikasjon, var en serie av Aβ aggregering blokkere syntetisert og vurdert for sin evne til å hemme Aβ-fibrinogen samhandling, identifisere de sammensatte TDI-276014. Vi har brukt TDI-2760 i vår studie blokkere Aβ-fibrinogen interaksjon. Som rapportert tidligere, i nærvær av TDI-2760, effekten av var Aβ ameliorated, som turbiditet var høyere enn med Aβ alene (figur 2A, rød). Effekten av TDI-2760 vises ikke av bakgrunnen turbiditet som sammensatte ikke endre fibrin blodpropp turbiditet da Aβ var fraværende (figur 2A, lilla). Den i vitro clotting turbiditet analysen beskrevet her er en rask og enkel metode av hvilke fibrin-blodpropp dannelse og faktorer som kan attenuere prosessen kan være observert. GPRP, som er kjent for å forstyrre fibrin polymerisasjon via forstyrrer fibrin monomer knott-hulls interaksjoner18,25 kan brukes som en positiv for turbiditet analysen (figur 2B). Samsvar med tidligere rapporter25, med tilstedeværelse av GPRP peptid, fibrin blodpropp turbiditet ble betydelig redusert i forhold til fibrin blodpropp dannelse med sitt fravær (figur 2B, blå vs grønn).
Etter samme protokoll og forhold som turbiditet analysen beskrevet ovenfor, fibrin clots ble utarbeidet i tilstedeværelse og fravær av Aβ og/eller TDI-2760. Clots ble deretter behandlet for elektronmikroskop fiksering, dehydrering, kritisk punkt tørking og gull-frese belegg (figur 1). Fibrinogen i nærvær av bare trombin og CaCl2 dannet en fibrin maske, med langstrakt og under Sommer tråder fibrin samt større pakker (figur 3A). Da Aβ var til stede, ble fibrin trådene tynnere, med flere klissete klumper/aggregat som angir Aβ-indusert strukturelle unormalt (figur 3B). Samsvar med analyseresultatene turbiditet, TDI-2760 restaurert delvis strukturen til fibrin blodpropp fra Aβ-induserte endringer, færre klumper var presentere (Figur 3 C). Sammen med turbiditet analysen avslører SEM omfanget og kvaliteten på Aβ-induserte endringer til fibrin blodpropp dannelse og effektiviteten av en hemmende sammensatte, TDI-2760.
Figur 1 : Skjematisk fremstilling av fibrin blodpropp analyse av turbiditet analysen og SEM. Skjematisk viser trinnene involvert i fibrin blodpropp analyse og effekten av Aβ på fibrin blodpropp turbiditet og strukturelle topografi. Skala barer SEM bilder (nederst til venstre) er 2 µm og forstørrelsen er 10 000 X. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Mål Aβ42 på i vitro effekt fibrin blodpropp dannelse av turbiditet analysen. (A) Fibrinogen var ruges i tilstedeværelse og fravær av Aβ42. Blodpropp formasjon ble indusert ved trombin, noe som resulterer i økt turbiditet løsningen (grønn). I nærvær av Aβ42, var fibrin blodpropp unormalt strukturert, noe som resulterer i redusert turbiditet (blå). Den sammensatte TDI-2760 eller DMSO ble inkubert med fibrinogen løsning, både med og uten Aβ42. TDI-2760 restaurert Aβ42-indusert reduksjon av turbiditet (rød) uten å endre normal blodpropp dannelse (lilla). (B) turbiditet av en kjent fibrinolyse hemmer, GPRP ble også målt som en positiv for denne analysen. Fibrinogen var ruges i tilstedeværelse og fravær av 1,5 µM GPRP og turbiditet målt etter trombin. Lik Aβ42, turbiditet av fibrin blodpropp formasjon ble betydelig redusert i nærvær av GPRP (blå versus grønn). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Skanning elektron micrographs av Aβ-indusert unormalt fibrin blodpropp arkitektur. Scanning elektron micrographs fibrin blodpropp struktur innhentet fra renset fibrinogen (A), fibrinogen + Aβ42 (B), fibrinogen + Aβ42 + TDI-2760 (C). Blodpropp formasjon initiert av legge trombin og CaCl2 til blandingen. Strukturelle analysen viste at clots dannet i nærvær av Aβ42 er tynnere og unormalt klumpet seg i forhold til fibrinogen av seg selv. TDI-2760, som er kjent for å hemme Aβ42-fibrinogen interaksjon, rettet delvis Aβ42 indusert strukturelle abnormitet av fibrin blodpropp. Skala bar er 1 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodene som er beskrevet her gir en reproduserbar og rask måte å vurdere fibrin blodpropp formasjon i vitro. I tillegg gjør enkelheten til systemet tolkning av hvordan Aβ påvirker fibrin blodpropp dannelse og struktur relativt rett frem. I dette laboratoriet forrige publikasjonen ble det vist at disse analyser kan brukes til å teste forbindelser for sin evne til å hemme den Aβ-fibrinogen interaksjon13,14. Bruker disse to analyser, en rekke syntetisk forbindelser ble analysert for muligheten til å hemme Aβ-fibrinogen interaksjon. Faktisk, blodpropp turbiditet analysen kan brukes til å begrense utvalget av hit forbindelser til de som har terapeutiske potensial, som ikke alle forbindelser som kan hemme Aβ-fibrinogen samspillet kan også gjenopprette fibrin blodpropp formasjon.
Det er noen aspekter av turbiditet analysen som kanskje krever problemløsing eller begrense bruken av denne teknikken. Større begrensningen er at det kan være noen variasjoner mellom eksperimenter som kan komplisere tolkning av resultatene. Noe av denne varianten er av trombin aktiviteten. Feilsøk trombin aktivitet kan brukerne teste flere konsentrasjoner av trombin blodpropp-formasjon aktivitet før begynnelsen eksperimentering med Aβ og test forbindelser. Under eksperimentelle forhold presentert her, øker Aβ, i fravær av fibrinogen, ikke turbiditet løsningen over bakgrunnen nivå indikerer som observert turbiditet kurver leies fibrin polymerisasjon. Men Aβ er en samling utsatt peptid og en høyere konsentrasjon av Aβ løsning når holdt for en meget lang tid i romtemperatur eller 37 ° C (flere timer) kan danne fibrillar aggregater som kan resultere i økt turbiditet. Hvis analysere effekten en Aβ løsning som har vært lagret i lengre tid ved romtemperatur eller varmere, kan statusen aggregering av løsningen bestemmes ved overføring elektronmikroskop. I protokollen beskrevet her, brukes ferskt tilberedte Aβ og fibrinogen løsninger, som skal eliminere aggregering problemer. Men for å sikre kvaliteten på disse forberedelser har de vurdert ved overføring elektronmikroskop. Når du bruker nye mange kommersielle Aβ peptid, bør dessuten omfanget av oligomerization og antall oligomers vurderes av overføring elektronmikroskop. Fordi det kan være mange til mange variasjon i peptid kvalitet og forholdet mellom preformed aggregater og monomerisk Aβ, som sikkert påvirker oligomerization hastigheten. Det anbefales å sjekke konsentrasjonen av Aβ løsning (BCA metode) før rugende for oligomerization. For å minimere disse variantene, prøvde vi å bruke minst 0,1 mg/mL Aβ løsning for oligomer dannelse reaksjon.
Fordi denne analysen er følsomme for små miljøendringer som temperatur og bevegelse, bør turbiditet målinger fra ulike eksperimenter ikke analyseres sammen. Dette betyr at antall betingelser som kan sammenlignes med er begrenset av antall brønner som trombin kan samtidig legges til med en flerkanals pipette (dvs., 12). Brukere bør også være klar over at viskositet eller farge i buffere og test forbindelser kan føre til en høy bakgrunn turbiditet, skjule signalet fra fibrin blodpropp og gjør tolkning av eksperimentet vanskelig. Men hvis alle kontrollene er inkludert i hvert eksperiment, bør det være mulig å lett finne hvis bakgrunn signal er å endre turbiditet absorbansen.
Turbiditet analysen gir informasjon om om dannelsen av fibrin blodpropp hindret av Aβ og videre hvis hemmer forbindelser kan lindre denne effekten. Men det ikke avsløre hvordan strukturen til fibrin blodpropp er endret som svar på Aβ og/eller treffer forbindelser. Dette spørsmålet kan rettes ved SEM, som dette gir direkte visualisering av blodpropp arkitektur. SEM er en veletablert teknikk og brukes rutinemessig for å visualisere blodpropp struktur fra renset fibrinogen eller plasma. Men kan tradisjonelle blodpropp forberedelsesprosessen for SEM analyse være kompliserte og tidkrevende. Videre kan små forskjeller i protokoller mellom forskjellige forskningsgrupper gjøre det utfordrende å gjenskape resultatene24. For å løse disse problemene ble denne optimalisert protokollen utviklet, som effekten av Aβ å indusere tynnere fibrin tråder og klumper av protein kan observeres (Figur 3). Sett med turbiditet analysen, lindrer TDI-2760 effekten av Aβ, gjenopprette typisk strukturen av fibrin bunter (Figur 3).
Det er noen skritt i SEM eksempel utarbeidelse, som også kan kreve feilsøking. Ved svært lave konsentrasjoner av fibrinogen (0,5 µM eller mindre), clots kan ikke være godt festet til av objektglass og kan være skadet/vasket bort under fiksering/vask trinnene. Hvis bruker lave konsentrasjoner av fibrinogen, økes blodpropp formasjon tiden mellom tillegg av trombin og fiksering, opptil flere timer, dette kan øke blodpropp stabiliteten. Også bør brukere ikke bruke høy styrke fosfatbuffer eller fosfat bufret saline for både turbiditet og SEM analyser, som fosfat ioner kan forstyrre kalsium-mediert blodpropp formasjon prosessen. Hvis bruker noen andre høyt saltinnhold som inneholder bufferen for blodpropp dannelse og SEM analyse, etter fiksering, bør vaske trinnene også utføres med kaldt ddH2O.
SEM analyse av ikke-ledende prøver som fibrin clots krever belegg med ladede partikler som gull, palladium, sølv eller karbon. Belegg tykkelse er en viktig faktor i SEM bildebehandling, som det er mulig at en veldig tykt metall belegg kan maskere den ultra-struktur form av fibrin blodpropp. I denne protokollen, tynn gull/palladium belegg (mindre enn 20 nm) brukes til å frese belegg. For å oppnå mindre enn 20 nm tykkelse, den sputtering ble gjort for 45 s med en belegg rate av 4 Å / s. Denne tynne belegg (18 nm) synes ikke å maskere overflaten funksjonene til fibrin montering. Men hvis bekymret maskering ultra-strukturen til blodpropp, kan karbon belegg brukes som et alternativ til gull/palladium, som det vil forlate mindre "holmer" belegg molekyler materiale.
Mens her har vært på den Aβ-fibrinogen interaksjonen, kan denne protokollen endres lett for å analysere samspillet av andre proteiner eller forbindelser med fibrin blodpropp. Etter disse instruksjoner skal etterforskere kunne reprodusere i vitro fibrin blodpropp dannelse og utføre analyse med disse strømlinjeformet blodpropp-turbiditet analysen og SEM protokoller. Som vist her med den tidligere publiserte inhibitor sammensatte TDI-2760, metodene gi verdifull informasjon om fibrin blodpropp formasjon som kan brukes til videre studier både i vitro og i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso og Michael Foley fra Tri-institusjonelle Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York for syntese av Aβ-fibrinogen interaksjon hemmere og deres verdifulle forslag. Forfatterne takker også medlemmer av laboratoriet Strickland nyttig diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av NIH grant NS104386, Alzheimers Drug Discovery Foundation og Robertson terapeutiske Development Fund for ha, NIH gi NS50537, the Tri-institusjonelle Therapeutics Discovery Institute, Alzheimers Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation, og John A. Herrmann for SS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).
- Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
- Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
- Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
- Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
- Ahn, H. J., et al. Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
- Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
- Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
- Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
- Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
- Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
- Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
- Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
- Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
- Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
- Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
- Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
- Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
- Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease. PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).
- Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
- Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).
