Summary
Dit papier is een protocol voor de voorbereiding van een co-cultuur van crypto Kokken cellen en eencellige die wordt bestudeerd met behulp van stilstaand, fluorescerende beelden en hoge-resolutie transmissie elektronen microscoop beelden. Hier wordt geïllustreerd hoe kwantitatieve gegevens dergelijke kwalitatieve informatie kunnen aanvullen.
Abstract
Om te simuleren Cryptococcus infectie, Amoeba, dat is de natuurlijke roofdier van crypto Kokken cellen in de omgeving, kan worden gebruikt als een model voor macrofagen. Dit roofzuchtige organisme, vergelijkbaar met macrofagen, maakt gebruik van fagocytose om geïnternationaliseerde cellen te doden. Met behulp van een confocale laser scanning microscoop worden beelden van interactieve momenten tussen crypto Kokken cellen en Amoeba gevangen. Het resolutievermogen van de elektronen microscoop helpt ook om de ultrastructurele Details van crypto Kokken cellen te onthullen wanneer ze in het amoeba voedsel vacuole worden gevangen. Aangezien fagocytose een continu proces is, worden kwantitatieve gegevens vervolgens in de analyse geïntegreerd om uit te leggen wat er op het tijdpunt gebeurt wanneer een afbeelding wordt vastgelegd. Om specifiek te zijn, worden relatieve fluorescentie-eenheden gelezen om de efficiëntie van amoeba bij het internaliseren van crypto Kokken-cellen te kwantificeren. Voor dit doel, crypto Kokken cellen worden gekleurd met een kleurstof die maakt ze fluoresceren eenmaal gevangen in het zure milieu van het voedsel vacuole. Bij samengebruik kan informatie die via dergelijke technieken wordt verzameld, kritieke informatie bieden om conclusies te trekken over het gedrag en het lot van cellen wanneer ze geïnternationaliseerd worden door amoeba en, mogelijk, door andere phagocytische cellen.
Introduction
Microben hebben zich in de loop van de tijd ontwikkeld om te bezetten en gedijen in verschillende ecologische niches zoals de open fysieke grenzen van de bodem en het water, onder andere1. In deze niches zijn microben vaak betrokken bij de directe concurrentie voor beperkte middelen; belangrijk, voor voedingsstoffen die ze gebruiken voor de ondersteuning van hun groei of ruimte, die ze nodig hebben om de groeiende bevolking2,3tegemoet te komen. In bepaalde gevallen kunnen sommige holozoïneorganismen zoals amoeba zelfs op crypto Kokken-cellen worden voorgedate als een manier om voedingsstoffen uit hun biomassa te halen4,5. Op hun beurt, dit maakt het mogelijk dergelijke organismen om territoriale dominantie te vestigen via het beheersen van de populatie aantallen van zijn prooi. Vanwege deze roof druk kunnen sommige prooien worden geselecteerd om microbiële factoren te produceren, zoals de crypto Kokken capsule6, om de negatieve effecten van de druk te verzoenen. Echter, als een onbedoelde gevolg van deze druk, sommige microben verwerven factoren die hen in staat stellen om de soort barrière passeren en zoeken naar nieuwe niches te koloniseren7, zoals de besloten ruimten van het menselijk lichaam die rijk zijn aan voedingsstoffen en hebben ideaal Voorwaarden. De laatste kan uitleggen hoe een terrestrische microbe als Cryptococcus (C.) coccus kan transformeren om pathogeen te worden.
Te dit doel, het is belangrijk om te bestuderen van het eerste contact dat crypto Kokken cellen kunnen hebben met amoeba en hoe dit hen kan selecteren om pathogeen te worden. Specifieker, dit kan aanwijzingen geven over hoe crypto Kokken cellen zich gedragen wanneer ze worden opgevolgd door macrofagen tijdens infectie. Het is om deze reden dat amoeba hier werd gekozen als model voor macrofagen, omdat het relatief goedkoop en gemakkelijk is om een cultuur van amoeba in een laboratorium8te handhaven. Van belang was ook onderzoeken hoe crypto Kokken secundaire metabolieten viz. 3-hydroxy vetzuren9,10 invloed op de interactie tussen eencellige en crypto Kokken cellen.
Een eenvoudige manier om de interactie tussen amoeba en zijn prooi met het blote oog te waarnemen, is het creëren van een gazon met behulp van de prooi op het oppervlak van een agar plaat en spot amoeba. De visualisatie van plaques of heldere zones op de agar plaat toont gebieden waar amoeba op zijn prooi kan hebben gevoed. Echter, op dit macroniveau, alleen de uitkomst van het proces wordt opgemerkt, en het proces van fagocytose is gemechaniseerd kan niet worden waargenomen. Daarom, om het proces op een cel-naar-cel-basis te waarderen, zijn er verschillende microscopische methoden die11,12kunnen worden gebruikt. Een omgekeerde Microscoop met een incubatie kamer kan bijvoorbeeld worden gebruikt om een timelapse van gebeurtenissen tussen een phagocytische cel en zijn doel13op te nemen. Helaas, vanwege de kosten van een microscoop met een time-lapse-functionaliteit, is het niet altijd mogelijk voor laboratoria om een dergelijke Microscoop te kopen, vooral in bron arme instellingen.
Om de bovenstaande beperking te omzeilen, presenteert deze studie een sequentieel verkennend ontwerp dat de interactie van C. coccus viz c. coccus uofs Y-1378 en C. coccus lmpe 046 met Acanthamoeba castellani evalueert. . Ten eerste wordt een kwalitatieve methode gebruikt die voorafgaat aan een kwantitatieve methode. Stilstaande beelden worden vastgelegd met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop, evenals een transmissie-elektronen microscoop om amoeba-Cryptococcus interacties weer te geven. Dit werd gevolgd door het kwantificeren van fluorescentie met behulp van een plaat lezer om de efficiëntie van amoeba te schatten om crypto Kokken cellen te internaliseren. Bij het afstemmen van de bevindingen van deze methoden tijdens de Data-interpretatie fase, kan dit net zo veel kritieke informatie onthullen als het gebruik van een fagocytose timelapse-video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cryptococcus coccus en sommige Acanthamoeba castellanii stammen worden beschouwd als bioveiligheid niveau-2 (BSL-2) pathogenen; Zo moeten onderzoekers gepaste voorzorgsmaatregelen nemen bij het werken met deze organismen. Laboratoriumpersoneel moet bijvoorbeeld specifieke training en persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) hebben, zoals Labjassen, handschoenen en oogbescherming. Een biologische veiligheidskast (niveau-2) moet worden gebruikt voor procedures die infectie kunnen veroorzaken14.
1. teelt en standaardisatie van schimmelcellen (gewijzigd van Madu et al. 15 )
- Streak de test schimmel stammen (d.w.z. c. coccus uofs Y-1378 en c. coccus lmpe 046) uit stamculturen (niet ouder dan 9 maanden) op gist-peptone-dextrose (ypd) agar-platen. Informatie over de ingrediënten van YPD agar is te vinden in tabel 1.
Opmerking: c. coccus uofs Y-1378 is aangetoond dat zij 3-hydroxy vetzuren produceren, terwijl C. coccus lmpe 046 geen 3-hydroxy vetzuren produceert. Raadpleeg aanvullend bestand 1 voor informatie over hoe de aanwezigheid van deze moleculen wordt bepaald. - Inbroed de agar-platen voor 48 uur bij 30 °C.
Opmerking: een plaat kan maximaal 2 maanden bij 4 °C worden bewaard voordat deze kan worden weggegooid of gebruikt voor het maken van een voorraad cultuur16. - Schrael een lus van crypto Kokken-cellen (c. coccus uofs Y-1378 of c. coccus lmpe 046) van de 48 h-oude plaat en inoculeren in een erlenmeyer van 250 ml met 100 ml van de chemisch gedefinieerde YNB Bouillon (6,7 g/L) aangevuld met 4% ( w/v) glucose. Informatie over de ingrediënten van YNB Broth u vinden in tabel 2.
- Inincuberen de kolven bij 30 °C gedurende 24 uur, terwijl ze op een roterende shaker met 160 rpm worden geagiterend.
- Tel na een incubatieperiode van 24 uur de schimmelcellen met behulp van een hemocytometer en pas het celgetal aan op 1 x 106 cellen/ml met PBS bij pH 7,4.
Opmerking: de bereide c. coccus uofs Y-1378 entmateriaal werd gebruikt in stappen 3,1 en 3,2, terwijl C. coccus lmpe 046 entmateriaal alleen werd gebruikt in stap 3,2.
2. teelt en standaardisatie van amoeba-cellen (gewijzigd van Madu et al. 15 )
- Een voorraad cultuur van Acanthamoeba castellanii ontdooien en op kamertemperatuur brengen (RT).
Opmerking: amoeba werd bereid op basis van de gewijzigde protocollen van Axelsson-Olsson et al.8 en Schuster17. - Pipetteer 1 mL van de ontdooide kweek en beënt het in een centrifugebuis van 50 mL met 15 mL ATCC medium 712. In tabel 3vindt u informatie over de ingrediënten van ATCC medium 712.
- Schud het handmatig zachtjes en Centrifugeer gedurende 5 minuten onmiddellijk bij 400 x g en 30 °c.
- Aspireren het supernatant.
- Respendeer de cellen in 15 mL ATCC medium 712 en inbroed de tube gedurende 14 dagen bij 30 °C.
Opmerking: Controleer periodiek de cellen, met behulp van een eenvoudige lichte Microscoop, om te bepalen of ze in een trophozoite staat. Zodra ze in een trophozoite staat, start een nieuwe cultuur. - Pipetteer 1 mL van een kweek die cellen in een trophozotische toestand weergeeft en gebruik het om een steriele centrifugebuis van 50 mL te gebruiken met 15 mL vers, steriel ATCC-medium 712.
- Inbroed de buis bij 30 °C gedurende 1 week, terwijl de sonde met 160 rpm op een roterende Shaker wordt geagiterend.
- Na een week, Tel de amoeba-cellen met behulp van een hemocytometer en pas het celgetal aan 1 x 107 cellen/ml met vers, steriel ATCC-medium 712.
- Voer een levensvatbaarheid test uit met een trypan blauwe vlek zoals beschreven door Strober18. Ga verder met de culturen die ten minste 80% levensvatbaarheid vertonen.
3. fluorescentie kleuring van cellen om phagocytose te bestuderen (gewijzigd van Madu et al. 15 )
- Het verzamelen van kwalitatieve gegevens door het gebruik van fluorescentiemicroscoop
Opmerking: Voer deze test uit met Acanthamoeba castellanii en C. coccus uofs Y-1378.- Breng een 200-μL suspensie van gestandaardiseerd eencellige (1 x 107 cellen/ml in ATCC medium 712) in de kamer putten van een hecht glaasje aan en incuberen gedurende 2 uur bij 30 °c om cellen aan het oppervlak te hechten.
- Terwijl amoeba cellen zich vestigen om te hechten, vlek de gestandaardiseerde C. coccus uofs Y-1378 cellen die zijn aangepast aan 1 x 106 cellen/ml (in 999 μL PBS) met 1 μL fluoresceïne isothiocyanaat in een plastic buis van 1,5 ml.
Opmerking: bereid de vlek voor door 1 mg fluoresceïne isothiocyanaat in 1 ml aceton op te lossen. - Roer de C. coccus uofs Y-1378-cellen zachtjes op een rondschudapparaat met 50 rpm voor 2 uur bij RT en in het donker.
- Na 2 uur Centrifugeer bij 960 x g gedurende 5 minuten bij 30 °c om de cellen te pellet.
- Zuig de supernatant op om de PBS met de vlek te verwijderen.
- Voeg 1 mL PBS toe aan de buis voor het wassen van de celpellet. Was de cellen door zachtjes te pipetteren.
- Centrifugeer de cellen bij 960 x g gedurende 5 minuten bij 30 °c. Gooi het supernatant weg. Herhaal de wasstap nog een keer.
- Respendeer de gewassen cellen in 1 mL PBS.
- Breng een suspensie van 200 μL van de gekleurde C. coccus uofs Y-1378 cellen aan op kamer putten die de niet-bevlekte amoeba-cellen bevatten.
- Inbroed de bereide co-cultuur bij 30 °C gedurende een extra periode van 2 uur.
Opmerking: de co-cultuur kan voor verschillende tijdspunten worden geïnineerd om het doel van het experiment aan te passen. - Aan het einde van de coincubatie periode, aspireren de inhoud van de putten.
- Voeg 300 μL PBS aan de putjes toe om de kamer putjes te wassen en eventuele niet-afhankelijke co-gekweekte cellen te verwijderen. Doe dit door voorzichtig pipetten. De inhoud van de putten aspireren. Herhaal de wasstap nog een keer.
- Bereid de 3% Glutaaraldehyde oplossing door 3 mL Glutaaraldehyde toe te voegen aan 97 mL gedistilleerd water.
- Fixeer de co-gekweekte cellen door toevoeging van 250 μL 3% oplossing aan de kamer putten en incuberen gedurende 1 uur.
- Aspireren de fixeer en was de kamer putten zoals beschreven uit stap 3.1.13.
- Ontmantelen van de kamer putten met behulp van een gereedschap dat bij de kamer glaasjes werd meegeleverd.
- Voeg een druppel van de anti fade compound, 1, 4-diazabicyclo-[2.2.2]-Octane toe aan de dia om automatisch bleken te voorkomen. Bedek met een dekslip en sluit de zijkanten af met een nagellak om verdamping te voorkomen.
- Bekijk de co-gekweekte cellen met behulp van de 100x objectief lens (met olie) van een confocale laser scanning microscoop.
Opmerking: het is belangrijk om Foto's te nemen in helder-veld en fluorescentie om de interactie tussen amoeba en crypto Kokken cellen te bekijken. Waar mogelijk kan de fluorescentie worden opgedrongen op de heldere veld beelden. Amoeba-cellen zijn meestal groter in grootte (d.w.z. 45-60 μm) en de trophozotische cellen hebben een onregelmatige vorm. Cryptococcal cellen zijn 5-10 μm in diameter en hebben een globose tot eivormige vorm. Wanneer blootgesteld aan een laser, is het mogelijk dat Onbevlekte amoeba cellen auto-fluorescentie kunnen uitzenden. Zie Beisker en Dolbeare19 en Clancy en cauller20 voor methodes om de autofluorescentie te verminderen.
- Kwantitatieve gegevens verkrijgen door gebruik van fluorescentie plaat lezer
Opmerking: Voer deze test uit met Acanthamoeba castellanii en c. coccus uofs Y-1378 of c. coccus lmpe 046.- Breng een suspensie van 100 μL gestandaardiseerd eencellige (aangepast aan 1 x 107 cellen/ml in ATCC medium 712) in een zwarte, hecht 96 goed microtiterplaat.
- Inbroed de plaat gedurende 2 uur bij 30 °C, zodat de amoeba-cellen zich aan het oppervlak kunnen hechten.
- Terwijl amoeba cellen zich vestigen om te hechten, vlek de gestandaardiseerde C. coccus uofs Y-1378 cellen die zijn aangepast aan 1 x 106 cellen/ml (in 999 μL PBS) met 1 μL phrodo groene zymosan a biopartikelen in een micro centrifugebuis van 1,5 ml. Stain C. coccus lmpe 046 cellen ook in een aparte buis.
Opmerking: de kleurstof, in tegenstelling tot FITC, vlekken selectief cellen die zijn gevangen in het zure milieu van een fagocytische cel21,22. Voor deze techniek is het belangrijk om de crypto Kokken-cellen in een medium met een neutrale pH (PBS) en amoeba in een medium met een neutrale pH (ATCC-medium 712) te behouden. Een medium met een zure omgeving zal resulteren in een vals-positieve lezing van de relatieve fluorescentie-eenheden, wat impliceert dat een groter aantal crypto Kokken is geïnternationaliseerd. - Zachtjes schudden crypto Kokken cellen op een orbitale Shaker ingesteld op 50 rpm voor 2 h op rt en in het donker.
- Centrifugeer na 2 uur de microcentrifuge buis bij 960 x g gedurende 5 minuten bij 30 °c om de cellen te pellet. Zuig de supernatant op om PBS met de vlek te verwijderen.
- Voeg 1 ml PBS toe aan de buis om de cellen van de gepileerde te wassen. Was de cellen door voorzichtig pipetteren.
- Centrifugeer de cellen bij 960 x g gedurende 5 minuten bij 30 °c. Gooi het supernatant weg. Herhaal de wasstap nog een keer.
- Respendeer de pellet van gewassen cellen in 1 mL PBS.
- Doseer een suspensie van 100 μL van gekleurd crypto Kokken cellen in putjes met Onbevlekte amoeba-cellen.
- Inbroed de bereide co-cultuur bij 30 °C gedurende een extra periode van 2 uur.
Opmerking: de co-cultuur kan worden geïnineerd voor verschillende tijdspunten die passen bij het doel van het experiment. - Meet de fluorescentie op een microplaat lezer aan het einde van de coincubatie periode. Zet logaritmische signalen om in relatieve fluorescentie-eenheden.
Let op: de kleurstof excitatie is bij 492 nm en de emissie is 538 nm. Raadpleeg Beisker en Dolbeare19 en Clancy en cauller20 voor methodes om de auto fluorescentie te verminderen.
4. gebruik van transmissie elektronenmicroscopie om phagocytose te bestuderen (gewijzigd van van Wyk en Wingfield 23 )
- Voeg een 5 ml suspensie van eencellige (aangepast aan 1 x 107 cellen/ml in ATCC medium 712) toe aan een centrifugebuis van 15 ml en laat ze 30 minuten op 30 °c zitten.
- Voeg een 5 ml suspensie van C. coccus uofs Y-1378 cellen (aangepast aan 1 x 106 cellen/ml in PBS) toe aan dezelfde centrifugebuis die 5 ml gestandaardiseerde amoeba-cellen bevat.
- Laat de tube standaard 2 uur bij 30 °C staan.
- Centrifugeer de buis bij 640 x g gedurende 3 minuten bij 30 °c om de co-gekweekte cellen te pellet. Aspireren het supernatant. Was de co-gekweekte cellen niet.
- Repareer de co-gekweekte cellen door de pellet opnieuw op te schorten in 3 mL 1,0 M (pH = 7,0) natriumfosfaatgebufferd 3% Glutaaraldehyde voor 3 uur.
- Centrifugeer de buis bij 1.120 x g gedurende 5 minuten bij 30 °c om de co-gekweekte cellen te pellet. Aspireren het supernatant.
- Voeg 5 ml natriumfosfaat buffer toe aan de centrifugebuis om de gepileerde cellen te wassen. Was door het zachtjes pipetteren van de inhoud van de buis gedurende 20 sec.
- Centrifugeer de buis bij 1.120 x g gedurende 5 minuten bij 30 °c om de co-gekweekte cellen te pellet.
- Herhaal stap 4.8-4.10. Aspireren het supernatant.
- Bevestig de co-gekweekte cellen opnieuw door de pellet in 3 mL 1,0 M (pH = 7,0) natriumfosfaatgebufferd 1% osmium tetroxide voor 1,5 h te resuspenden.
- Verwijder de fixeer (osmium tetroxide) door het wassen van de co-gekweekte cellen op een vergelijkbare manier te verwijderen 3% glutaraldehyde.
- Dehydraat het TEM-materiaal (ook bekend als de co-gekweekte cellen) in een gesorteerde acetoneseries van 30%, 50%, 70%, 95% en twee veranderingen van 100% voor respectievelijk 15 min. Om dit te doen, voeg 3 ml aceton oplossing toe aan de cellen van de gepileerde en laat het 15 min staan. Centrifugeer vervolgens met 200 x g gedurende 10 minuten bij RT het supernatant en voeg het hogere percentage van de aceton oplossing toe.
- Bereid de epoxy van de normale consistentie volgens het protocol door Spur24.
Opmerking: de epoxy hars wordt gebruikt voor het snijden. - Sluit het TEM-materiaal in de vers bereide epoxy hars. Hiertoe volgt u de onderstaande stappen.
- Voeg 3 mL van de vers bereide epoxy toe aan een buis die het TEM-materiaal bevat dat is geresuspendeerd in 3 mL 100% oplossing van aceton. Laat de buis voor 1 uur staan.
- Centrifugeer de buis bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 30 °c. De oplossing van epoxy-aceton aspireren.
- Voeg 6 mL van de vers bereide epoxy toe aan de pellet in de buis. Laat de buis voor 1 uur staan.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 30 °c. Aspirate alle epoxy-aceton oplossing.
- Voeg 3 mL van de vers bereide epoxy toe aan de buis. Laat de buis staan voor 8 h.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 30 °c. Aspirate alle epoxy oplossing
- Voeg 3 mL van de vers bereide epoxy toe aan de buis. Houd het TEM-materiaal in de epoxy oplossing 's nachts in een vacuümexsiccator.
Let op: epoxy hars is een radioactief materiaal. Gebruik PBM om het epoxy hars te behandelen. De epoxy hars moet ook worden behandeld in een rook afzuigkap. Onderzoekers moeten de veiligheidsvoorschriften volgen voor het verwijderen van dergelijk materiaal zoals gespecificeerd door elk land25.
- Polymeriseer het TEM-materiaal voor 8 uur bij 70 °C.
- Trim op de ultramicrotome kleine delen van ongeveer 0,1 mm x 0,1 mm en 60 Nm dikte van het met epoxy ingesloten materiaal met een gemonteerd glazen mes. Monteer secties op een rooster en plaats de roosters in een TEM-monsterhouder voor het vlekken.
- Beits de delen met een druppel van 6% ammoniumuranylcarbonaat acetaat gedurende 10 min in het donker. Zorg ervoor dat de secties volledig bedekt zijn. |
NB: Reconstitueer de vlek (6 g) in 100 mL gedistilleerd water.
Let op: uranyl acetaat is een radioactief materiaal. Gebruik PBM om ammoniumuranylcarbonaat acetaat te behandelen. Uranyl acetaat moet ook worden behandeld in een rook afzuigkap. Onderzoekers moeten de veiligheidsvoorschriften volgen voor het verwijderen van dergelijk materiaal zoals gespecificeerd door elk land25. - Spoel de delen door ze vijf keer te dippen in een bekerglas dat 100 mL gedistilleerd water bevat.
Let op: het gedistilleerd water moet dienovereenkomstig worden afgevoerd, omdat het sporen van ammoniumuranylcarbonaat acetaat bevat. - Vlek de sectie met een druppel citraat voor 10 min in het donker. Zorg ervoor dat de secties volledig bedekt zijn.
Opmerking: de lood citraat moet volgens het protocol worden bereid door Reynold26. - Spoel de delen door ze vijf keer te dippen in een bekerglas dat 100 mL gedistilleerd water bevat.
- Monteer de roosters individueel met bevlekte delen op een TEM-monsterhouder doos.
- Bekijk secties met een transmissie elektronen microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microben zijn microscopische organismen die niet met het blote oog kunnen worden waargenomen. Echter, hun effect kan resulteren in waarneembare klinisch evidente ziekten, zoals huidinfecties. Bij het bestuderen van bepaalde aspecten van microben, variërend van hun morfologie, bijproducten, en interacties, zijnde kundig voor picturale en video-bewijs is van het allergrootste belang.
We eerst geprobeerd om de interactie tussen crypto Kokken cellen en Amoeba visualiseren. Voor dit doel werden helder-veld beelden die toonden 2 h co-geïnfiltreerde cellen eerst bestudeerd. Een afbeelding onthulde een crypto Kokken-cel die in de nabijheid van amoeba was. Een van de amoeba-cellen werd gezien met verlengde pseudopodia om een crypto Kokken-cel vast te leggen (Figuur 1a). Vervolgens werd een corresponderende afbeelding in fluorescentie vastgelegd voor verwijzing (Figuur 1b). De groene fluorescentie op het oppervlak van de bevlekte cellen geholpen bij het bevestigen van de aanwezigheid van crypto Kokken cellen. De Onbevlekte amoeba ook automatisch fluoresceerd. Dit, naast de schijnbare verschil grootte en morfologie, assisteerde bij het verder onderscheiden van de twee celtypen.
Auto fluorescentie is een kwaliteit die vaak wordt waargenomen wanneer biologische structuren natuurlijk licht uitzenden dat ze hebben geabsorbeerd (bijv. na blootstelling aan een laser tijdens confocale laser scanning microscopie)27. In figuur 1cwerden crypto Kokken-cellen genoteerd (op hetzelfde tijdpunt van 2 uur) die al werden geïnternationaliseerd door amoeba. Het corresponderende beeld in fluorescentie werd ook vastgelegd voor verwijzing (figuur 1d). Op basis van het bewijsmateriaal bij de hand, is het verleidelijk om te concluderen dat de amoeba de twee gevangen cellen doodde. Echter, fagocytose is een dynamisch proces waarbij de gastheer, roofdier en pathogeen, en prooi gebruik maken van verschillende strategieën om te vernietigen of te ontwijken elkaar28. De wet van crypto Kokken cellen die fagocytische cellen ontwijken, wordt elegant gedemonstreerd door vomocytosis29,30, wat een niet-lytisch verwijderingsproces is van ingesloten cellen uit macrofagen. Deze gewaagde beweging is vastgelegd in timelapse-Video's29,30. Helaas, dit benadrukt de beperking van het bestuderen van stilstaande beelden van vaste cellen, zoals in onze studie, om een dynamisch proces zoals fagocytose te verhelderen. Tot het punt, een onderzoeker kan het interval missen wanneer een cel ontsnapt uit de deelnemer.
Om het bovenstaande te compenseren, werd de lezing van relatieve fluorescentie-eenheden overwogen. In de huidige studie, metingen werden genomen na een 2 h co-incubatieperiode en hielp om de reactie van de twee test crypto Kokken stammen vergelijken [d.w.z., een die produceert 3-hydroxy vetzuren (c. coccus uofs Y-1378) en de andere die niet (c. coccus lmpe 046)]. Het was veronderstelde dat 3-hydroxy vetzuren kan fungeren als een virulentie determinant die afbreuk doen aan de opname van crypto Kokken cellen, met inbegrip van phagocytose door amoeba. Voor meer informatie over de invloed van 3-hydroxy vetzuren op amoeba, is het aangeraden om te verwijzen naar Madu et al.15,31. Figuur 2 toont de hoeveelheid crypto Kokken cellen die geïnternationaliseerd zijn op basis van het lezen van fluorescentie-eenheden. Bij het vergelijken van de twee crypto Kokken-isolaten was het duidelijk dat cellen die de 3-hydroxy-vetzuren produceren, minder vaak werden geïnternationaliseerd in vergelijking met cellen die geen 3-hydroxy-vetzuren produceren.
Om de kwalitatieve gegevens te verbeteren, werd transmissie elektronenmicroscopie opgenomen in de analyse (Figuur 3a). Hier werd opgemerkt dat de stam die 3-hydroxy vetzuren produceert (C. coccus uofs Y-1378) stekelige uitstulpingen op de capsule (Figuur 3b) had, die door de cel kunnen worden gebruikt om 3-hydroxy vetzuren vrij te geven aan de buitenomgeving.
Het is belangrijk op te merken dat de gegevens (in Figuur 1, Figuur 3) het lot van crypto Kokken cellen als geïnternationaliseerd en niet gedood/fagocytized overbrengen. Om te bepalen of de cellen het fagocytische voorval overleefden, is het aanbevolen om een aanvullende test in te nemen waarin de onderzoeker de amoeba-cellen lyseert en een verspreidings plaat agar voorbereidt om de crypto Kokken kolonie vormende eenheden (CFU) te inventariseren. Door het tellen van CFUs, Madu et al.15 gemeld dat crypto coccal cellen produceren 3-hydroxy vetzuren waren ook resistent tegen de fagocytische werking van amoeba na internalisatie. Zo leverden deze cellen een significant hogere overlevingskans in vergelijking met cellen die geen 3-hydroxy-vetzuren produceren.
Figuur 4 toont het belang van de voorbereiding en het onderzoek van tem-monsters. In dit geval werden C. coccus uofs Y-1378-secties doelbewust overbelicht aan het elektronen bombardement. Aan het einde, het vastgelegde beeld kan niet worden gebruikt, omdat het afbreuk doet aan de kwaliteit van de informatie die kan worden afgeleid. Samen genomen, de verkregen informatie blijkt dat door het combineren van deze verschillende technieken, een onderzoeker kan afleiden voldoende informatie om te bepalen van het lot van crypto Kokken cellen wanneer co-gekweekte met amoeba.
| Ingrediënt | Hoeveelheid |
| bacteriologische pepton | 20 g/L |
| Gistextract | 10 g/L |
| Glucose | 20 g/L |
| Agar | 15 g/L |
Tabel 1: ingrediënten voor het maken van YPD agar. Voeg de benodigde hoeveelheid alle ingrediënten toe in 1 liter water. Verwarm tijdens het roeren om de ingrediënten volledig op te lossen. Eenmaal gedaan autoclaaf voorafgaand aan het gebruik.
| Ingrediënt | Hoeveelheid |
| ammoniumsulfaat | 5 g/L |
| Biotine | 2 μg/L |
| calcium pantothenaat | 400 μg/L |
| Foliumzuur | 2 μg/L |
| Inositol | 2000 μg/L |
| Niacine | 400 μg/L |
| p-aminobenzoinezuur | 200 μg/L |
| pyridoxine hydrochloride | 400 μg/L |
| Riboflavine | 200 μg/L |
| thiamine hydrochloride | 400 μg/L |
| Boorzuur | 500 μg/L |
| kopersulfaat | 40 μg/L |
| Kaliumjodide | 100 μg/L |
| ijzer chloride | 200 μg/L |
| mangaan sulfaat | 400 μg/L |
| natriummolybdaat | 200 μg/L |
| Zinksulfaat | 400 μg/L |
| Monokalium fosfaat | 1 g/L |
| magnesiumsulfaat | 0,5 g/L |
| Natriumchloride | 0,1 g/L |
| calciumchloride | 0,1 g/L |
Tabel 2: ingrediënten voor het maken van YNB Broth. Voeg de benodigde hoeveelheid alle ingrediënten toe in 1 liter water. Verwarm tijdens het roeren om de ingrediënten volledig op te lossen. Eenmaal gedaan autoclaaf voorafgaand aan het gebruik.
| Deel I: Basaal medium. | |
| Ingrediënt | Hoeveelheid |
| proteose pepton | 20 g/L |
| Gistextract | 1 g/L |
| agar (indien nodig) | 20 g/L |
| Deel II: supplementen. | |
| Ingrediënt (stockoplossingen) | Hoeveelheid |
| 0,05 M CaCl2 | 8 mL |
| 0,4 M MgSO4 x 7h2O | 10 ml |
| 0,25 M na2HPO4 x 7h2O | 10 mlL |
| 0,25 M KH2po4 | 10 mL |
| Na citraat x 2H2O | 1 g |
| 0,005 M Fe (NH4) 2 (zo4) 2 x 6h2O | 10 mL |
Tabel 3: ingrediënten voor het maken van ATCC medium 712. Bereid het basale medium in 900 mL water. Bereid de supplementen afzonderlijk en voeg toe aan het basale medium. Eenmaal gedaan pas de pH op 7,4 met 1 N HCl of 1 N NaOH en autoclaaf. Filter steriliseren 50 mL oplossing van 2 M glucose (18 g/50 mL) en voeg het aseptisch toe aan het volledige medium vóór gebruik.
Figuur 1 : Helder-veld en bijbehorende fluorescerende micro grafieken die amoeba-Cryptococcus interactieve momenten tonen. A) een amoeba-cel in de nabijheid van een cel C. coccus uofs Y-1378 kan worden gezien. Het corresponderende fluorescerende beeld wordt weergegeven in (B). C) afbeelding van twee C. coccus uofs Y-1378-cellen die in het voedsel vacuole van amoeba zijn gevangen. Het corresponderende fluorescerende beeld wordt weergegeven in (D). Dit cijfer is gewijzigd van Madu et al.15. A = amoeba; C = c. coccus. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : De resultaten van de internalisering van crypto Kokken-cellen worden samen met amoeba gekweekt. De aflezing van relatieve fluorescentie-eenheden maakt de interpretatie en vergelijking van de efficiëntie van eencellige mogelijk voor het internaliseren van c. coccus uofs Y-1378 en c. coccus lmpe 046. De foutbalken vertegenwoordigen de berekende standaardfouten op basis van drie biologische replicaten. Dit cijfer is gewijzigd van Madu et al.15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Transmissie elektronen micrografen met amoeba- Cryptococcus interacties. A-micro grafieken (a , B) Bevestig de waarnemingen in figuur 1c, D.a) afgebeeld is een C. coccus uofs Y-1378 cel gevangen in de amoeba voedsel vacuole, terwijl (B) is een close-up weergave van Figuur 3a . Dit cijfer is gewijzigd van Madu et al.15. A = amoeba-cel; C = c. coccus -cel. De rode pijl wijst op een protubertie van de Capsular. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Een transmissie elektronen microscoop C. coccus uofs Y-1378 cellen. De cellen zijn beschadigd en kunnen dus geen zinvolle gegevens opleveren. Rode pijlen geven punten aan waar de sectie wordt gescheurd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend bestand 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het papier, verschillende technieken werden met succes gebruikt om de mogelijke uitkomst die kunnen ontstaan wanneer amoeba interactie met crypto Kokken cellen onthullen. Ook, we waren geïnteresseerd om te laten zien van de effecten van 3-hydroxy vetzuren op het resultaat van de interacties van Cryptococcus-amoeba.
De eerste gebruikte techniek was confocale microscopie, die stilstaande beelden heeft gerenderd. Het grote nadeel van deze techniek was dat het ons alleen informatie gaf die beperkt is tot een bepaald tijdpunt. Elke conclusie die kan worden getrokken op basis van de resultaten leent zich voor inductieve redenering, waarbij men tot een conclusie kan komen op basis van een reeks waarnemingen32. Maar omdat men verschillende situaties opmerkt waarin een patroon bestaat, betekent dat niet dat dit patroon waar is voor alle situaties. Zo wordt in het onderzoek aangetoond en eventueel gewaarschuwd hoe dergelijke beperkte informatie tot ongegronde conclusies kan leiden. Tot het punt, bij afwezigheid van tegenstrijdige of ondersteunende, aanvullend bewijs, kan worden geconcludeerd dat de internalisering kan hebben geleid tot de fagocytose van cellen.
Het tempo van de ontwikkeling in beeldvorming biedt nieuwe mogelijkheden om wetenschappelijke ontdekkingen te doen, zoals het geval was met het afdekken van braakocytose29,30. Om dit punt te illustreren zonder gebruik van een microscoop die timelapse-Video's kan opnemen, zou deze ontdekking niet mogelijk zijn geweest. Daarom is een gebrek aan toegang tot dergelijke high-end instrumentatie altijd een belemmering in de bron arme instellingen die niet in de voorhoede van het ondekken van dergelijke processen. Een manier om dit te overwinnen is om nieuwe samenwerkingen op te zoeken of innovatieve manieren te ontdekken om onderzoeksvragen aan te pakken. Een welkome ontwikkeling is de introductie en toepassing van gespecialiseerde vlekken zoals de phagocytische vlek die hier wordt gebruikt21,22. Deze vlek is pH-gevoelig en fluoresceert alleen in zure omgevingen zoals in het lumen van amoeba Food vacuole15. Het is de moeite waard om erop te wijzen dat de vlek alleen informatie geeft met betrekking tot de internalisering van cellen. Bepaling als cellen uiteindelijk fagocytized in aanvullende experimenten kunnen worden verlangd.
Belangrijk is dat een dergelijke vlek ook nuttig is gebleken bij de meting van de fluorescentie. De laatstgenoemde liet de integratie van kwantitatieve gegevens toe in een poging om uit te leggen wat biologisch op een bepaald tijdpunt gebeurt. Hier werd het lot van cellen onderscheiden (d.w.z. dat werd vastgesteld of de aanwezigheid van 3-hydroxy vetzuren een verminderde of bevorderde de internalisatie van cellen) door het extrapoleren van de betekenis van de metingen van relatieve fluorescentie-eenheden.
In tegenstelling tot deze studie kunnen onderzoekers ook kiezen om de fluorescentie van cellen over een bepaalde periode te meten. De verkregen informatie is nuttig bij het bepalen van het aantal cellen dat op één tijdstip geïnternationaliseerd is en volgt hoe het bedrag over de periode verandert. Op dezelfde manier kunnen ook afbeeldingen worden genomen op de bijbehorende tijdspunten.
Deze studie toont de kracht van het combineren van een aantal methoden om een gemotiveerde conclusie te bereiken. De aanpak van het combineren van meerdere benaderingen om phagocytose te vergelijken of aan te vullen een initiële techniek is niet nieuw. Meindl en collega's33 vergeleek bijvoorbeeld drie technieken (beeldanalyse, fluorescentie en Flowcytometrie lezingen) om te onderzoeken hoe de fluorescentie-gelabelde deeltjesgrootte de macrofaag fagocytose beïnvloedt. De studie bewees dat van de drie technieken, plaat lezing kan de beste optie zijn om te controleren fagocytose33.
TEM is met name een krachtig hulpmiddel, omdat het een vogel zicht biedt in het lumen van het voedsel vacuole. Vaak wordt dit detailniveau dikwijls gemist door confocale microscopie in de vorm van stilstaande beelden, inclusief timelapse-Video's. Naar dit punt van het tem, het was interessant om te visualiseren van uitstulpingen op de oppervlakken van de crypto Kokken capsule. Het was eerder veronderstelde dat deze celoppervlakte structuren worden gebruikt als een kanaal om 3-hydroxy vetzuren vrij te geven in de omgeving om de overleving van cellen mogelijk te bevorderen9,10,15, 31. uit de details op de TEM-Microscoop blijkt verder dat de uitstulpingen op de geïnternationaliseerde cel niet worden verstoord en hun integriteit hebben gehandhaafd. Dus (gezien de integriteit van de protuberances) is het mogelijk dat zij 3-hydroxy vetzuren kunnen leveren in de vacuole-omgeving van voedsel en de inwendige omstandigheden veranderen, wat leidt tot overleving van de cel zoals gerapporteerd door Madu et al.15,31. Een belangrijke beperking van het gebruik van de elektronen microscoop is dat monstervoorbereiding zeer moeizaam is. Bovendien, om te voorkomen dat de monsters worden vernietigd zoals te zien in Figuur 4, moet de experimenteerder goed getraind zijn om de ultramicrotome en Microscoop handmatig te bedienen.
Concluderend, er wordt gedacht dat onderzoekers zullen worden aangemoedigd door het vooruitzicht van het bestuderen van fagocytose simpelweg door het combineren van stilstaand fluorescerende afbeeldingen met kwantitatieve gegevens. Het is vertrouwd dat onderzoekers genoeg informatie van dit protocol kunnen verkrijgen en te optimaliseren in hun eigen studies. Dit kan de ontwikkeling van antilichamen tegen gerichte metabolieten omvatten en dit toepassen op immunofluorescentie onderzoeken, inclusief immuno-Gold-etikettering tijdens TEM-onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Het werk werd gesteund door een subsidie van de National Research Foundation of South Africa (subsidie nummer: UID 87903) en de Universiteit van de Vrijstaat. We zijn ook dankbaar voor diensten en assistentie aangeboden door Pieter van Wyk en Hanlie Grobler tijdens onze microscopie studies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | - |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | - |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | - |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | - |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | - |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | - |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | - |
| Centrifuge | Hermle | - | - |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | - |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | - |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | - |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | - |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | - |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | - |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | - |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | - |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | - |
| Hemocytometer | Boeco | - | - |
| Lead citrate | ALS | R1209 | - |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | - |
| Orbital shaker | Lasec | - | - |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | - |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | - |
| Rotary shaker | Labcon | - | - |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | - |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | - |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | - |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | - |
| Vacuum dessicator | Lasec | - | - |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | - |
| YNB | Lasec | 239210 | - |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | - |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality? Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , Caister Academic Press. Nottingham. (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. Cryptococcus Neoformans. , ASM Press. Washington D.C. (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , CAB International. Wallington. (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Unit 9, 31 (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L.
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , Department of Minerals and Energy. Pretoria. (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , Garland Science. New York. (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. Inductive reasoning 2.0. , Wiley Interdisciplinary Review: Cognitive Science. e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
