Summary
本論文では、静止画、蛍光画像、高解像度透過電子顕微鏡画像を用いて研究されたクリプトコッカス細胞とアメーバの共培養を調製するためのプロトコルについて詳しく述べたい。次に示すように、定量的データがこのような定性的情報を補完する方法について説明します。
Abstract
クリプトコッカス感染をシミュレートするために、環境中のクリプトコッカス細胞の自然捕食者であるアメーバをマクロファージのモデルとして使用することができます。この捕食生物は、マクロファージと同様に、内在細胞を殺すために食細胞細胞症を採用している。共焦点レーザー走査顕微鏡の助けを借りて、クリプトコッカス細胞とアメーバの間のインタラクティブな瞬間を描いた画像がキャプチャされます。電子顕微鏡の分解能はまた、アメーバ食品の真空中に閉じ込められたときにクリプトコッカス細胞の超構造的な詳細を明らかにするのに役立ちます。咽頭症は連続的なプロセスであるため、定量的なデータを分析に統合して、画像がキャプチャされた時点で何が起こるかを説明します。具体的には、クリプトコッカス細胞の内部化におけるアメーバの効率を定量するために相対蛍光単位が読み取られる。この目的のために、クリプトコッカス細胞は、食品真空の酸性環境の中に一度閉じ込められた蛍石を作る色素で染色されます。このような技術を通じて収集された情報は、アメーバによって内部化された場合、および場合によっては他の食細胞によって細胞の挙動と運命に関する結論を導き出すのに役立つ重要な情報を提供することができます。
Introduction
微生物は、土壌と水の開いた物理的境界などの異なる生態学的ニッチを占有し、繁栄するために時間をかけて進化してきました。これらのニッチでは、微生物はしばしば限られた資源のための直接競争に従事します。重要なことは、彼らが拡大する人口2、3を収容するために必要な成長または空間をサポートするために使用する栄養素のために。特定の例では、アメーバのようないくつかのホロゾニック生物は、バイオマス4、5から栄養素を抽出する方法としてクリプトコッカス細胞に先行することさえある。その結果、このような生物は、獲物の個体数を制御することにより、領土の支配を確立することができます。この捕食圧のために、一部の獲物は、圧力の負の影響を和らめるために、クリプトコッカスカプセル6などの微生物因子を生成するために選択されてもよい。しかし、この圧力の意図しない結果として、一部の微生物は、種の障壁を越え、栄養素が豊富で理想を持つ人体の限られた空間のように、7を植民地化するための新しいニッチを探し出すことを可能にする因子を獲得する。条件。後者は、クリプトコッカスのような地上微生物がどのように説明するか(C.)ネオフォーマンは病原性に変容する可能性があります。
そのためには、クリプトコッカス細胞がアメーバと共に持つ可能性のある初期接触と、これが病原性になるためにそれらを選択する方法を研究することが重要です。より具体的には、これは、感染中にマクロファージによって作用したクリプトコッカス細胞がどのように動作するかの手がかりを与える可能性があります。アメーバは、研究室8でアメーバの培養を比較的安価で維持しやすいため、マクロファージのモデルとして選ばれたのはこのためです。興味深いのは、クリプトコッカス二次代謝産物viz.3−ヒドロキシ脂肪酸9、10がアメーバとクリプトコッカス細胞との相互作用にどのように影響するかを調べることであった。
アメーバとその獲物と肉眼との相互作用を知覚する簡単な方法は、寒天プレートとスポットアメーバの表面に獲物を使用して芝生を作成することです。寒天プレート上のプラークまたはクリアゾーンの視覚化は、アメーバが獲物に餌を与えた可能性のある領域を示しています。しかし、このマクロレベルでは、プロセスの結果のみが指摘され、咽頭細胞症が機械化される過程は観察できない。したがって、細胞間ベースでプロセスを評価するために、11、12を使用することができるいくつかの顕微鏡的方法がある。例えば、インキュベーションチャンバを有する反転顕微鏡は、咽頭細胞とその標的13との間の事象のタイムラプスを記録するために使用することができる。残念ながら、タイムラプス機能を備えた顕微鏡のコストのために、実験室は、特にリソースの貧弱な設定で、このような顕微鏡を購入することが常に可能であるとは限りません。
上記の制限を回避するために、本研究は、C.ネオフォルマンスviz C.ネオフォルマンスUOFS Y-1378とC.ネオフォルマンスLMPE 046とアカンタモエバ・カステラニとの相互作用を評価する順次探索的設計を提示する。.まず、定量的方法に先行する定性的な方法が用いられる。静止画は、反転蛍光顕微鏡と透過電子顕微鏡を使用して撮影され、アメーバ-クリプトコッカス相互作用を描写します。続いて、プレートリーダーを用いて蛍光を定量し、クリプトコッカス細胞を内部化するアメーバの効率を推定した。データ解釈段階でこれらの方法から得られた結果を調整する場合、これは、咽頭細胞症のタイムラプスビデオを熟読するのと同じくらい重要な情報を明らかにする可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
クリプトコッカスネオフォーマンといくつかのアカントアメーバカステラニ株は、バイオセーフティレベル2(BSL-2)病原体とみなされます。したがって、研究者は、これらの生物を扱う際に適切な予防措置を取る必要があります。例えば、ラボの担当者は、ラボコート、手袋、目の保護などの特定のトレーニングおよび個人用保護具(PPE)を持っている必要があります。生物学的安全キャビネット(レベル2)は、感染を引き起こす可能性のある手順に使用する必要があります14.
1. 真菌細胞の培養と標準化(Maduら15から改変)
- 酵母ペプトンデキストロース(YPD)寒天プレート上のストック培養(9ヶ月未満)から試験真菌株(すなわち、C.ネオフォルマンスUOFS Y-1378およびC.ネオフォルマンスLMPE 046)をストリークアウト。YPD寒天の成分に関する情報は、表1に示されています。
注:C.ネオフォルマンスUOFS Y-1378は3-ヒドロキシ脂肪酸を産生することが示されているが、C.ネオフォルマンスLMPE 046は3-ヒドロキシ脂肪酸を産生しない。これらの分子の存在がどのように決定されるかについては、補足ファイル1を参照してください。 - 寒天プレートを30°Cで48時間インキュベートします。
注:プレートは、廃棄またはストックカルチャー16を作るために使用する前に、4 °Cで最大2ヶ月間保存することができます。 - クリプトコッカス細胞(C.ネオフォルマンスUOFS Y-1378またはC.ネオフォルマンズLMPE 046)のループを削り取り、化学的に定義されたYNBブロス(6.7 g/L)の100mLを含む250 mLの円錐フラスコに接種する(w/v)ブドウ糖。YNBスープの成分に関する情報は表2に示されています。
- ロータリーシェーカーで160rpmで攪拌しながら、フラスコを30°Cで24時間インキュベートします。
- 24時間のインキュベーション期間の後、ヘモサイトメーターを使用して真菌細胞をカウントし、pH 7.4でPBSで細胞数を1 x 106細胞/mLに調整します。
注:調製されたC.ネオフォルマンスUOFS Y-1378接種はステップ3.1および3.2で使用され、C.ネオフォルマンスLMPE 046接種はステップ3.2でのみ使用された。
2. アメーバ細胞の培養と標準化(Maduら15から改変)
- アカンタモエバ・カステラニのストック培養を解凍し、室温(RT)にします。
注:アメーバは、アクセルソン・オルソンら8とシュースター17の修正されたプロトコルに基づいて調製されました。 - 解凍培養のピペット1mLを、ATCC培地712の15mLを含む50mL遠心管に接種する。ATCC培地712の成分に関する情報は、表3に示されています。
- 400 x gと30°Cで5分間、手動で軽く、すぐに遠心分離機を振ります。
- 上清を吸引する。
- ATCC培地712の15mLで細胞を再中断し、14日間30°Cでチューブをインキュベートする。
注:定期的に、単純な光顕微鏡を使用して、細胞がトロフォゾイテ状態であるかどうかを判断するために、細胞をチェックします。彼らはトロポゾイテ状態になったら、新鮮な文化を開始します。 - ピペット1mLをトロポゾイテ状態で細胞を示し、それを用いて、新鮮な無菌ATCC培地712の15mLを含む無菌50mL遠心管を接種する。
- ロータリーシェーカーで160rpmで攪拌しながら、チューブを30°Cで1週間インキュベートします。
- 1週間後、血球計を用いてアメーバ細胞をカウントし、新鮮な無菌ATCC培地712で細胞数を1 x 107細胞/mLに調整する。
- ストロバー18によって詳述されているように、トリパンブルーの染みを使用して生存率アッセイを行う。少なくとも 80% の生存率を示すカルチャをさらに進めます。
3. 食欲細胞症を研究する細胞の蛍光染色(Madu et al. 15から改変)
- 蛍光顕微鏡を用いて定性データを収集
注:アカンタモエバ・カステラニとC.ネオフォルマンスUOFS Y-1378でこのアッセイを行います。- 標準化されたアメーバ(ATCC培地712の1x 107細胞/mL)の200μL懸濁液を付着スライドのチャンバーウェルに分配し、細胞が表面に付着するために30°Cで2時間インキュベートする。
- アメーバ細胞が付着している間、1.5 mLのプラスチックチューブにフルオレセインイソチオシアネートの1 μLで1 x 106細胞/mL(PBSの999 μL)に調整された標準化されたC.ネオフォルマンスUOFS Y-1378細胞を染色する。
注:アセトンの1mLにフルオレセインイソチオシアネートの1mgを溶解することにより、汚れを調えます。 - Rtと暗闇で2時間50rpmに設定された軌道シェーカー上のC.ネオフォルマンUOFS Y-1378細胞を穏やかに攪拌する。
- 2時間後、遠心分離機を960xgで30°Cで5分間ペレット化する。
- 上清を吸引して、汚れでPBSを除去します。
- セルペレットを洗浄するためのチューブに1 mLのPBSを追加します。ゆっくりとピペッティングして細胞を洗います。
- 30°Cで5分間960 x gで細胞を遠心分離します。上清を捨てます。洗浄手順をもう一度繰り返します。
- 洗浄した細胞を1mLのPBSで再中断する。
- 染色されたC.ネオフォルマンスUOFS Y-1378細胞の200 μL懸濁液を、未染色アメーバ細胞を含むチャンバーウェルに分配する。
- さらに2時間の期間、30°Cで調製した共培養をインキュベートする。
注:共培養は、実験の目的に合わせて異なるタイムポイントに対してインキュベートすることができる。 - 共同インキュベーション期間の終了時に、井戸の内容物を吸引する。
- 300 μLのPBSをウェルに加えて、チャンバーウェルを洗浄し、非結合共培養細胞を除去します。穏やかなピペッティングによってこれを行います。井戸の中身を吸引する。洗浄手順をもう一度繰り返します。
- 蒸留水の97 mLにグルタルアルデヒドの3 mLを加えることによって3%グルタルアルデヒド溶液を調べます。
- チャンバーウェルに250μLの3%溶液を加え、1時間インキュベートして共培養細胞を固定します。
- 固定剤を吸引し、ステップ3.1.13から詳細に部屋の井戸を洗います。
- チャンバースライドを備えたツールを使用してチャンバーウェルを解体します。
- 自動漂白を防ぐために、アンチフェード化合物、1,4-ジアザビクロ-[2.2.2]-オクタンをスライドに一滴加します。カバースリップでカバーし、蒸発を防ぐためにマニキュアで側面を密封します。
- 共焦点レーザー走査顕微鏡の100倍対物レンズ(油付き)を用いて共培養細胞を見る。
注:アメーバとクリプトコッカス細胞の相互作用を見るためには、明るいフィールドと蛍光で写真を撮ることが重要です。可能な限り、蛍光は明視野画像に超押し付けることができます。アメーバ細胞は、典型的にはサイズが大きくなり(すなわち、45〜60μm)、トロホゾイテ細胞は不規則な形状を持っています。クリプトコッカス細胞は直径5〜10μmであり、球状形状を持っています。レーザーにさらされると、染色されていないアメーバ細胞が自動蛍光を放出する可能性があります。自己蛍光を低減する方法については、ベイスカーとドルベア19とクランシーとコーラー20を参照してください。
- 蛍光プレートリーダーを用いて定量データを取得
注:アカンタモエバ・カステラニとC.ネオフォルマンスUOFS Y-1378またはC.ネオフォルマンスLMPE 046でこのアッセイを行います。- 標準化されたアメーバの100 μL懸濁液(ATCC培地712で1x107セル/mLに調整)を黒い、付着性96ウェルマイクロチタープレートに分配します。
- アメーバ細胞が表面に付着できるように、プレートを30°Cで2時間インキュベートします。
- アメーバ細胞が付着している間、標準化されたC.ネオフォルマンスUOFS Y-1378細胞を1 x 106細胞/mL(PBSの999 μL)に1μLのpHrodo Green Zymosan A生体粒子を1.5mLマイクロセントリフュージチューブで染色する。染色C.ネオフォルマンスLMPE 046細胞も別のチューブに入っています。
注:色素は、FITCとは異なり、咽頭細胞21、22の酸性環境内に閉じ込められた細胞を選択的に染色する。この技術のためには、中性pH(PBS)およびアメーバを含む培地中のクリプトコッカス細胞を中性pH(ATCC培地712)を含む培地中に維持することが重要である。酸性環境を有する培地は、相対蛍光単位の誤検知値を生み出し、より多くのクリプトコッカスが内部化されたことを示唆する。 - RTと暗闇で2時間50rpmに設定された軌道シェーカー上でクリプトコッカス細胞を穏やかに攪拌する。
- 2時間後、微小遠心管を960xgで遠心分離し、30°Cで5分間遠心分離し、細胞をペレットする。 上清を吸引して、汚れでPBSを除去します。
- チューブに1 mLのPBSを加え、ペレット化した細胞を洗浄します。穏やかなピペッティングで細胞を洗います。
- 30°Cで5分間960 x gで細胞を遠心分離します。上清を捨てます。洗浄手順をもう一度繰り返します。
- 洗浄した細胞のペレットを1mLのPBSで再中断する。
- 染色されていないアメーバ細胞を含むウェルに染色されたクリプトコッカス細胞の100 μL懸濁液を分配する。
- さらに2時間の期間、30°Cで調製した共培養をインキュベートする。
注:共培養は、実験の目的に合わせて異なるタイムポイントに対してインキュベートすることができます。 - 共インキュベーション期間の終了時に、マイクロプレートリーダー上の蛍光を測定する。対数シグナルを相対蛍光単位に変換します。
注:染料の励起は492 nmで、放出は538 nmである。自己蛍光を低減する方法については、ベイスカーとドルベア19とクランシーとコーラー20を参照してください。
4. 透過電子顕微鏡を用いて遠足細胞症を研究する(ヴァン・ワイクとウィングフィールド23から改変)
- アメーバエの5 mL懸濁液(ATCC培地712で1x 107セル/mLに調整)を15mL遠心管に加え、30°Cで30分間沈着させます。
- 標準化されたアメーバ細胞の5 mLを含む同じ遠心管にC.ネオフォルマンスUOFS Y-1378細胞(PBSで1x106細胞/mLに調整)の5 mL懸濁液を追加します。
- 30°Cで2時間チューブスタンドを許可します。
- チューブを640 x gで3分間3分間遠心分離し、共培養細胞をペレットする。上清を吸引する。共培養細胞を洗浄しないでください。
- 1.0M(pH=7.0)の3mLでペレットを再濁させて共培養細胞を固定し(pH=7.0)リン酸ナトリウム3%グルタルアルデヒドを3時間固定する。
- チューブを1,120 x gで30°Cで5分間遠心分離し、共培養細胞をペレット化する。上清を吸引する。
- 遠心管にリン酸ナトリウムバッファーの5 mLを追加し、ペレット化した細胞を洗浄します。チューブの内容物を20sに優しくピペッティングして洗います。
- チューブを1,120 x gで30°Cで5分間遠心分離し、共培養細胞をペレット化する。
- 手順 4.8-4.10 を繰り返します。上清を吸引する。
- 1.0M(pH=7.0)の3mLでペレットを再増止し、1.5時間のリン酸ナトリウム1%の四酸化オスミウムを再び固定する。
- 3%グルタルアルデヒドを除去するのと同様の方法で共培養細胞を洗浄することにより、固定性(四酸化オスミム)を除去します。
- それぞれ15分間に30%、50%、70%、95%および2つの変化の等級付けされたアセトン系列でTEM材料(共培養細胞とも呼ばれる)を脱水する。そのために、ペレット細胞にアセトン溶液の3 mLを加え、15分間放置します。次いで、RTで10分間200xgで遠心分離機を上清を捨て、アセトン溶液のより高い割合を加える。
- Spur24によるプロトコルに従って正常な一貫性のエポキシを準備する。
注:エポキシ樹脂は断面に使用されます。 - 新たに調製したエポキシ樹脂にTEM材料を埋め込む。この操作を行うには、次の手順に従います。
- アセトンの100%溶液の3mLで再懸濁したTEM材料を含むチューブに、新たに調製したエポキシの3mLを添加する。チューブを1時間放置します。
- 30°Cで10分間200 x gでチューブを遠心分離します。エポキシアセトン溶液を吸引する。
- チューブ内のペレットに作りたてのエポキシの6mLを追加します。チューブを1時間放置します。
- 遠心分離機 200 x gで 30 °C で 10 分。すべてのエポキシアセトン溶液を吸引する。
- チューブに作りたてのエポキシの3 mLを追加します。チューブを8時間放置します。
- 遠心分離機 200 x gで 30 °C で 10 分。すべてのエポキシ溶液を吸引する
- チューブに作りたてのエポキシの3 mLを追加します。TEM材料をエポキシ溶液中に一晩真空デシケータに保管してください。
注意:エポキシ樹脂は放射性物質です。PPEを使用してエポキシ樹脂を処理します。エポキシ樹脂はまた、ヒュームフードで処理する必要があります。研究者は、各国が定める物品を廃棄するための安全規則に従うべきである25。
- 70°Cで8時間TEM材料を重合する。
- ウルトラマイクロトームでは、エポキシ埋め込み材料から約0.1mm x 0.1 mm、厚さ約60nmの小さなセクションを取り付けたガラスナイフでトリムします。グリッド上にセクションを組み立て、染色する前にTEMサンプルホルダーボックスにグリッドを配置します。
- 暗闇の中で10分間6%のウラニル酢酸の滴でセクションを汚します。セクションが完全にカバーされていることを確認します。
注:蒸留水の100 mLで汚れ(6g)を再構成します。
注意:酢酸ウランは放射性物質です。PPEを使用して酢酸ウラネルを処理します。ウラニル酢酸塩もヒュームフードで処理する必要があります。研究者は、各国が定める物品を廃棄するための安全規則に従うべきである25。 - 100mLの蒸留水を含むビーカーに5回浸漬して切片をすすいでください。
注:蒸留水は酢酸ウラネルの痕跡が含まれているので、それに応じて処分する必要があります。 - 暗闇の中で10分間ク硝酸鉛の滴でセクションを汚します。セクションが完全にカバーされていることを確認します。
注:鉛クレートは、Reynold26によってプロトコルに従って準備する必要があります。 - 100mLの蒸留水を含むビーカーに5回浸漬して切片をすすいでください。
- TEMサンプルホルダーボックスに染色されたセクションを使用してグリッドを個別に組み立てます。
- 透過型電子顕微鏡で断面を表示します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
微生物は肉眼では知覚できない微生物です。しかし、その影響は、皮膚感染症などの観察可能な臨床的に明らかな病気をもたらす可能性があります。微生物の形態、副産物、相互作用に至るまで、微生物の特定の側面を研究する際に、絵画やビデオの証拠を提供できることが最も重要です。
まず、クリプトコッカス細胞とアメーバとの相互作用を可視化することを目指しました。この目的のために、2時間共インキュベートされた細胞を示す明視野画像を最初に研究した。ある画像は、アメーバに近接していたクリプトコッカス細胞を明らかにした。アメーバ細胞の1つは、クリプトコッカス細胞を捕捉するために拡張擬似ポジアで見られた(図1A)。次に、蛍光中の対応する画像を参照用に撮影した(図1B)。染色された細胞の表面上の緑色蛍光は、クリプトコッカス細胞の存在を確認するのを助けた。染色されていないアメーバも自動蛍石化した。これは、見かけの差異サイズおよび形態に加えて、2つの細胞タイプをさらに区別するのに助けた。
自己蛍光は、生物学的構造が吸収した光を自然に放出する場合にしばしば観察される品質である(例えば、共焦点レーザー走査顕微鏡中にレーザーにさらされた後)27。図1Cでは、アメーバによって既に内部化されたクリプトコッカス細胞(2時間の同時時点)が注目された。蛍光中の対応する画像も参照用に撮影した(図1D)。手元の証拠に基づいて、アメーバが閉じ込められた2つの細胞を殺したと結論付けるのが魅力的です。しかし、食細胞症は、宿主、捕食者および病原体、および獲物が互いを破壊または回避するために異なる戦略を採用する動的なプロセスである28。食細胞を回避するクリプトコッカス細胞の作用は、マクロファージから捕らわれた細胞の非溶解性追放プロセスである発虫細胞症29、30によってエレガントに実証される。この大胆な動きは、タイムラプスビデオ29、30でキャプチャされています.残念ながら、これは我々の研究のように、固定細胞の静止画を研究することの限界を強調し、食細胞症のような動的なプロセスを解明する。要するに、研究者は、細胞が捕獲者から脱出する間隔を逃すかもしれません。
以上を補償するために、相対蛍光単位の読み取りが検討された。今回の研究では、2時間の共同インキュベーション期間の後に測定値を採取し、2つの試験クリプトコッカス株(すなわち、3-ヒドロキシ脂肪酸を産生する1つ)とそうでない他の(C.Neoformans UOFS Y-1378)の応答を比較するのに役立った。ネオフォーマンズLMPE 046)]。3-ヒドロキシ脂肪酸は、アメーバによる食細胞症を含むクリプトコッカス細胞の取り込みを損なうウイルス決定要因として作用する可能性があると仮定された。アメーバに対する3-ヒドロキシ脂肪酸の影響の詳細については、Madu et al.15,31を参照することをお勧めします。図2は、蛍光単位の読み取りに基づいて内部化されたクリプトコッカス細胞の量を示す。2つのクリプトコッカス単離物を比較すると、3-ヒドロキシ脂肪酸を産生しない細胞と比較して、3-ヒドロキシ脂肪酸を産生する細胞の内部化頻度が低いことが明らかになった。
定性データを増強するために、透過電子顕微鏡を分析に含有した(図3A)。ここで、3-ヒドロキシ脂肪酸を産生する菌株(C.ネオフォルマンスUOFS Y-1378)は、カプセル上にスパイク状の突起を有していたことが指摘された(図3B)。
データ(図1、図3)は、クリプトコッカス細胞の運命を内部化され、殺/咽頭化されていないものとして伝える点に注意することが重要です。細胞が食道イベントを生き延びたかどうかを判断するために、研究者がアメーバ細胞を溶解し、クリプトコッカスコロニー形成単位(CFU)を列挙するために広がりプレート寒天を調作する追加のアッセイを含めるのが推奨されます。CFOを数えることによって、Madu et al.15は、3-ヒドロキシ脂肪酸を産生するクリプトコッカス細胞も、内部化後のアメーバの食細胞作用に対して耐性であったと報告した。したがって、これらの細胞は、3−ヒドロキシ脂肪酸を産生しない細胞と比較して有意に高い生存率を得た。
図4は、TEMサンプル調製および検査の重要性を示す。この場合、C.ネオフォルマンスUOFS Y-1378セクションは意図的に電子爆撃にさらされ過ぎていた。最後に、キャプチャされた画像は、推測可能な情報の品質を損なうため、使用できません。得られた情報を組み合わせることで、研究者はアメーバと共培養した際にクリプトコッカス細胞の運命を決定するのに十分な情報を推測できることを示している。
| 成分 | 量 |
| 細菌学的ペプトン | 20 グラム/L |
| 酵母エキス | 10グラム/L |
| グルコース | 20 グラム/L |
| 寒天 | 15グラム/L |
表1:YPD寒天を作るための成分。必要量を1Lの水に加えます。材料を完全に溶解するために攪拌しながら熱します。一度使用する前にオートクレーブを行った。
| 成分 | 量 |
| 硫安 | 5グラム/L |
| ビオチン | 2 μg/L |
| パントネートカルシウム | 400 μg/L |
| 葉酸 | 2 μg/L |
| イノシトール | 2000 μg/L |
| ナイアシン | 400 μg/L |
| p-アミノベンゾン酸 | 200 μg/L |
| 塩酸ピリドキシン | 400 μg/L |
| リボフラビン | 200 μg/L |
| 塩酸チアミン | 400 μg/L |
| ホウ酸 | 500 μg/L |
| 硫酸銅 | 40 μg/L |
| ヨウ化カリウム | 100 μg/L |
| 塩化鉄 | 200 μg/L |
| 硫酸マンガン | 400 μg/L |
| モリブデートナトリウム | 200 μg/L |
| 硫酸亜鉛 | 400 μg/L |
| リン酸一酸化水素 | 1グラム/L |
| 硫酸マグネシウム | 0.5グラム/L |
| 塩化ナトリウム | 0.1グラム/L |
| 塩化カルシウム | 0.1グラム/L |
表2:YNBスープを作るための成分。必要量を1Lの水に加えます。材料を完全に溶解するために攪拌しながら熱します。一度使用する前にオートクレーブを行った。
| パートI:基底媒体。 | |
| 成分 | 量 |
| プロテオス・ペプトン | 20 グラム/L |
| 酵母エキス | 1グラム/L |
| 寒天(必要に応じて) | 20 グラム/L |
| パートII:サプリメント。 | |
| 成分(ストックソリューション) | 量 |
| 0.05 M カクル2 | 8 mL |
| 0.4 Mg SO4 x 7H2O | 10ミリリットル |
| 0.25 M Na2HPO4 x 7H2O | 10 mlL |
| 0.25 M KH2PO4 | 10 mL |
| ナクレート x 2H2O | 1 グラム |
| 0.005 M Fe(NH 4)2(SO 4)2 x 6H2O | 10 mL |
表3:ATCC培地712を作るための成分。900 mLの水で基底培地を準備します。別々にサプリメントを準備し、基底媒体に追加します。.一度行われた1 N HClまたは1 N NaOHおよびオートクレーブでpHを7.4に調整する。フィルターは2 Mグルコース(18 g/50 mL)の50 mL溶液を殺菌し、使用前に完全な培地に無菌的に加えます。
図 1:アメーバを示す明視野および対応する蛍光顕微鏡写真-クリプトコッカスインタラクティブモーメント。(A) C.ネオフォルマンスUOFS Y-1378細胞に近接したアメーバ細胞が見られる。対応する蛍光画像を(B)に示す。(C) アメーバ食品の真空中に閉じ込められた2つのC.ネオフォルマンS UOFS Y-1378細胞の描写。対応する蛍光画像を(D)に示す。この図は、Maduら15.A = アメーバ;C = C. ネオフォルマンス.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:アメーバと共培養したクリプトコッカス細胞の内部化アッセイの結果。相対蛍光単位の読み取りは、C.ネオフォルマンS UOFS Y-1378 および C.ネオフォルマンスLMPE 046 を内部化するアメーバエの効率の解釈と比較を可能にします。誤差バーは、3つの生物学的反復に基づいて計算された標準誤差を表します。この図は、Maduら15.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: アメーバを示す透過電子顕微鏡写真-クリプトコッカス相互作用。TEM顕微鏡写真(A,B)図1Cでの観察を確認する(A)図1C、D.(A)図1Cの観察を確認する(A)示すは、アメーバ食品の真空中に閉じ込められたC.ネオフォルマンS Y-1378細胞であり、(B)は図3Aのクローズアップ図である。.この図は、Maduら15.A = アメーバ細胞;C = C. ネオフォルマンス細胞.赤い矢印は、カプセルの突起を指します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 透過電子顕微鏡写真C. ネオフォルマンス UOFS Y-1378 細胞.セルが破損しているため、意味のあるデータを提供できません。赤い矢印は、断面が破れた点を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 1.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
論文では、アメーバがクリプトコッカス細胞と相互作用する際に生じる可能性のある結果を明らかにするために、さまざまな技術がうまく用いられた。また、クリプトコッカス-アメーバ相互作用の結果に対する3-ヒドロキシ脂肪酸の影響を示すことに興味を持った。
最初に使用された技術は、静止画をレンダリングした共焦点顕微鏡検査でした。ここでのこの手法の主な欠点は、特定のタイムポイントに限定された情報のみを提供してくれたことです。結果に基づいて引き出すことができる結論は、誘導的推論に適しており、一連の観察32に基づいて結論に達することができる。ただし、パターンが存在するいくつかの状況を観察したからといって、そのパターンがすべての状況に当てはまるというわけではありません。したがって、研究では、そのような限られた情報が根拠のない結論につながる可能性があることが示され、おそらく注意が必要です。要するに、矛盾または支持的な、相補的な証拠がない場合、内部化が細胞の咽頭細胞症につながった可能性があると結論付けてもよい。
イメージングの開発のペースは、ボモサイトーシス29、30の発見の場合と同様に、科学的発見を行うための新しい機会をもたらします。タイムラプスビデオを記録できる顕微鏡を使用せずにこの点を説明するために、この発見は不可能であったであろう。したがって、このようなハイエンドのインストルメンテーションへのアクセスの欠如は、常にそのようなプロセスを明らかにする最前線にないリソースの貧弱な設定の障害になります。これを克服する方法の 1 つは、新しいコラボレーションを模索したり、研究の質問に対処する革新的な方法を発見することです。1つの歓迎の開発は、ここで使用される咽熱染色などの特殊な汚れの導入と適用です21,22.この染色はpH感受性であり、アメーバ食品液胞15の内気部のような酸環境でのみ蛍光を発する。染色は細胞の内部化に関連する情報のみを提供することを指摘する価値があります。細胞が最終的に追加の実験で咽頭化されるかどうかの決定が必要な場合がある。
重要なことに、このような汚れは蛍光の測定にも有用であることが証明された。後者は、ある特定の時点で生物学的に何が起こるかを説明する試みで定量的データの統合を可能にしました。ここで、細胞の運命を識別した(すなわち、3−ヒドロキシ脂肪酸の存在が損なわれたか、細胞の内部化を促進したか)、相対蛍光単位の読み取り値から意味を推定することによって決定した。
この研究とは異なり、研究者はまた、一定期間にわたって細胞の蛍光を測定することを選択するかもしれません。取得した情報は、一度に内部化されるセルの数を決定し、その期間の量がどのように変化するかを判断するのに役立ちます。同様に、対応するタイムポイントで画像を撮影することもできます。
この研究は、合理的な結論に達するために、多くの方法を組み合わせる力を示しています。初期技術を比較または補完するために、複数のアプローチを組み合わせてファゴサイト症を監視するアプローチは新しいものではありません。例えば、Meindlと同僚33は、蛍光標識粒子サイズがマクロファージ性細胞症にどのように影響するかを調べた3つの技術(画像解析、蛍光、およびフローサイトメトリー測定値)を比較した。研究は、3つの技術のうち、プレートの読み取りが咽頭細胞症33を監視するための最良の選択肢かもしれないことを証明した。
TEMは、食品の真空の内気に鳥の目のビューを提供するように、特に強力なツールです。多くの場合、このレベルの詳細は、タイムラプスビデオを含む静止画の形で共焦点顕微鏡検査によって見逃されることがよくあります。TEMのこの時点で、クリプトコッカスカプセルの表面上の突起を可視化することは興味深かった。これらの細胞表面構造は、細胞生存9、10、15を促進するために周囲の環境に3-ヒドロキシ脂肪酸を放出するチャネルとして使用されていると以前に仮説されていた。31.TEM顕微鏡写真の詳細は、内部化された細胞上の突起が歪んでおらず、その完全性を維持していることをさらに明らかにする。したがって、(突起の完全性を考えると)、それらは3−ヒドロキシ脂肪酸を食品真空環境に提供し、内部条件を変化させ、Madu et al. 15,31によって報告された細胞生存につながる可能性がある。電子顕微鏡を使用する主な制限は、サンプル調製が非常に面倒である。さらに、図4に見られるようにサンプルの破壊を回避するために、実験者は、手動で超微小トームおよび顕微鏡を操作するための十分な訓練を受けるべきである。
結論として、静止画像と定量的データを組み合わせるだけで、咽頭細胞症を研究する見通しに研究者が励まされることが想定されます。研究者は、このプロトコルから十分な情報を取得し、独自の研究でそれを最適化することができると信じられておりいます。これには、標的代謝産物に対する抗体の開発と、TEM検査中の免疫金標識を含む免疫蛍光研究に適用することが含まれます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。
Acknowledgments
この研究は、南アフリカ国立研究財団(助成番号:UID 87903)と自由国家大学からの助成金によって支援されました。また、顕微鏡検査研究中にピーター・ヴァン・ワイクとハンリー・グロブラーが提供するサービスと支援にも感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | - |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | - |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | - |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | - |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | - |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | - |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | - |
| Centrifuge | Hermle | - | - |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | - |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | - |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | - |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | - |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | - |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | - |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | - |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | - |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | - |
| Hemocytometer | Boeco | - | - |
| Lead citrate | ALS | R1209 | - |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | - |
| Orbital shaker | Lasec | - | - |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | - |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | - |
| Rotary shaker | Labcon | - | - |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | - |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | - |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | - |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | - |
| Vacuum dessicator | Lasec | - | - |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | - |
| YNB | Lasec | 239210 | - |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | - |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality? Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , Caister Academic Press. Nottingham. (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. Cryptococcus Neoformans. , ASM Press. Washington D.C. (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , CAB International. Wallington. (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Unit 9, 31 (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L.
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , Department of Minerals and Energy. Pretoria. (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , Garland Science. New York. (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. Inductive reasoning 2.0. , Wiley Interdisciplinary Review: Cognitive Science. e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
