Summary
Este papel detalha um protocolo para preparar uma cocultura de pilhas e de amebas criptocócica que é estudado usando imagens imóveis, fluorescentes e imagens de alta resolução do microscópio de elétron da transmissão. Ilustrados aqui é como os dados quantitativos podem complementar tais informações qualitativas.
Abstract
Para simular a infecção por Cryptococcus , a ameba, que é o predador natural das células criptocócicas no ambiente, pode ser usada como um modelo para macrófagos. Este organismo predatório, semelhante aos macrófagos, emprega fagocitose para matar células internalizadas. Com o auxílio de um microscópio confocal da laser-exploração, as imagens que descrevem momentos interativos entre pilhas e ameba criptocócica são capturadas. O poder da definição do microscópio de elétron igualmente ajuda a revelar o detalhe ultrastructural de pilhas criptocócica quando prendido dentro do vacuole do alimento do ameba. Como a fagocitose é um processo contínuo, os dados quantitativos são então integrados na análise para explicar o que acontece no momento em que uma imagem é capturada. Para ser específico, as unidades relativas da fluorescência são lidas a fim quantificar a eficiência do ameba em internalizantes pilhas criptocócica. Para esta finalidade, as pilhas criptocócica são manchadas com um corante que os faça fluorescência uma vez prendido dentro do ambiente ácido do vacuole do alimento. Quando utilizados em conjunto, as informações recolhidas através de tais técnicas podem fornecer informações críticas para ajudar a tirar conclusões sobre o comportamento e o destino das células quando internalizada pela ameba e, possivelmente, por outras células fagocíticas.
Introduction
Os micróbios evoluíram ao longo do tempo para ocupar e prosperar em diferentes nichos ecológicos, como os limites físicos abertos do solo e da água, entre outros1. Nesses nichos, os micróbios muitas vezes se envolvem na concorrência direta por recursos limitados; importante, para os nutrientes que eles usam para apoiar o seu crescimento ou espaço, que eles precisam para acomodar a população em expansão2,3. Em certos casos, alguns organismos holozoicos como a ameba podem até mesmo antecedem em células criptocócicas como uma forma de extrair nutrientes de sua biomassa4,5. Por sua vez, isso permite que tais organismos estabeleçam a dominância territorial através do controle dos números populacionais de suas presas. Devido a essa pressão predatória, algumas presas podem ser selecionadas para produzir fatores microbianos, como a cápsula criptocócica6, para conciliar os efeitos negativos da pressão. No entanto, como consequência não intencional desta pressão, alguns micróbios adquirem fatores que lhes permitem atravessar a barreira das espécies e procurar novos nichos para colonizar7, como os espaços confinados do corpo humano que são ricos em nutrientes e têm o ideal Condições. Este último pode explicar como um micródon terrestre como Cryptococcus (C.) neoformans pode se transformar para se tornar patogénico.
Para este fim, é importante estudar o contato inicial que as células criptocócicas podem ter com ameba e como isso pode selecioná-los para se tornarem patogênicos. Mais especificamente, isso pode dar pistas sobre como as células criptocócicas se comportam quando agiram por macrófagos durante a infecção. É por esta razão que a ameba foi escolhida como um modelo para os macrófagos aqui, pois é relativamente barata e fácil manter uma cultura de ameba em um laboratório8. Do interesse era examinar igualmente como Metabolites secundário criptocócica viz. os ácidos graxos 3-hydroxy9,10 influenciam a interação entre amebas e pilhas criptocócica.
Uma maneira simples de perceber a interação entre a ameba e sua presa a olho nu é criar um gramado usando sua presa na superfície de uma placa de ágar e ameba local. A visualização de placas ou zonas claras na placa de agar retrata áreas onde a ameba pode ter alimentado sua presa. No entanto, neste nível macro, apenas o resultado do processo é observado, e o processo de fagocitose é mecanizado não pode ser observado. Portanto, para apreciar o processo em uma base célula a célula, existem vários métodos microscópicos que podem ser usados11,12. Por exemplo, um microscópio invertido com uma câmara de incubação pode ser usado para gravar um lapso de tempo de eventos entre uma célula fagocítica e seu alvo13. Infelizmente, devido ao custo de um microscópio com uma funcionalidade de lapso de tempo, nem sempre é possível para os laboratórios para comprar tal microscópio, especialmente em recursos pobres-configurações.
Para contornar a limitação acima, este estudo apresenta um delineamento exploratório sequencial que avalia a interação de c. neoformans Viz c. neoformans uofs Y-1378 e c. neoformans Lmpe 046 com Acanthamoeba Castellani . Em primeiro lugar, é utilizado um método qualitativo que precede um método quantitativo. As imagens ainda são capturadas usando um microscópio de fluorescência invertido, bem como um microscópio eletrônico de transmissão para descrever ameba-interaçõesCryptococcus . Isto foi seguido quantificando a fluorescência usando um leitor da placa para estimar a eficiência do ameba para internalizar pilhas criptocócica. Ao reconciliar os achados desses métodos durante a fase de interpretação de dados, isso pode revelar igualmente tanta informação crítica quanto a utilização de um vídeo de lapso temporal de fagocitose.
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Protocol
Cryptococcus neoformans e algumas cepas de Acanthamoeba Acanthamoeba são consideradas patógenos de nível 2 de biossegurança (BSL-2); assim, os investigadores devem tomar precauções apropriadas ao trabalhar com estes organismos. Por exemplo, o pessoal de laboratório deve ter treinamento específico e equipamentos de proteção individual (EPI), como casacos de laboratório, luvas e proteção ocular. Um armário de segurança biológico (Level-2) deve ser usado para os procedimentos que podem causar a infecção14.
1. cultivo e padronização de células fúngicas (modificada de Madu et al. 15 )
- Estica as cepas fúngicas de teste (i.e., c. neoformans Uofs Y-1378 e c. neoformans lmpe 046) de culturas de estoque (não mais de 9 meses) em placas de agar de levedura-peptona-dextrose (YPD). As informações sobre os ingredientes do agar YPD podem ser encontradas na tabela 1.
Nota: c. neoformans Uofs Y-1378 foi mostrado para produzir 3-hydroxy ácidos graxos, enquanto C. neoformans lmpe 046 não produz 3-hidroxi ácidos graxos. Refira o arquivo suplementar 1 para obter informações sobre de como a presença destas moléculas é determinada. - Incubar as placas de agar para 48 h a 30 ° c.
Nota: uma placa pode ser armazenada por até 2 meses a 4 ° c antes de poder ser descartada ou usada para fazer uma cultura de estoque16. - Raspar um alçada de células criptocócicas (c. neoformans uofs Y-1378 ou c. neoformans lmpe 046) da placa 48 h-Old e inoculado em um balão cônico de 250 ml contendo 100 ml do caldo ynb quimicamente definido (6,7 g/L) suplementado com 4% ( w/v) glicose. As informações sobre os ingredientes do caldo YNB podem ser encontradas na tabela 2.
- Incubar as garrafas a 30 ° c durante 24 h enquanto agitando a 160 RPM em um agitador rotativo.
- Após um período de incubação de 24 h, contar as células fúngicas usando um hemociômetro e ajustar o número da célula para 1 x 106 células/ml com PBS em pH 7,4.
Nota: o inoculante c. neoformans Uofs Y-1378 preparado foi utilizado nas etapas 3,1 e 3,2, enquanto o inuso de c. neoformans lmpe 046 foi utilizado apenas na etapa 3,2.
2. cultivo e padronização de células de ameba (modificadas de Madu et al. 15 )
- Descongelar uma cultura de estoque de Acanthamoeba Acanthamoeba e trazê-lo para a temperatura ambiente (RT).
Nota: a Amoeba foi preparada com base nos protocolos modificados de Axelsson-Olsson et al.8 e Schuster17. - Pipetar 1 mL da cultura descongelada e inoculá-lo num tubo de centrifugação de 50 mL contendo 15 mL de meio ATCC 712. As informações sobre os ingredientes do ATCC Medium 712 podem ser encontradas na tabela 3.
- Agitar manualmente suavemente e imediatamente centrifugar por 5 min a 400 x g e 30 ° c.
- Aspirar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 15 mL do meio ATCC 712 e incubar o tubo a 30 ° c durante 14 dias.
Nota: periodicamente verificar as células, usando um simples microscópio de luz, para determinar se eles estão em um estado trophozoite. Uma vez que eles estão em um estado trophozoite, iniciar uma cultura fresca. - Pipetar 1 mL de uma cultura que mostre células em um estado de trophozoite e use-a para inocular um tubo de centrífuga estéril de 50 mL contendo 15 mL de meio ATCC fresco e estéril 712.
- Incubar o tubo a 30 ° c durante 1 semana enquanto agitando a 160 RPM em um agitador rotativo.
- Após uma semana, conte as células da ameba usando um hemocitômetro e ajuste o número da pilha a 1 x 107 Cells/ml com o meio fresco, estéril ATCC 712.
- Realize um ensaio de viabilidade usando uma mancha azul de Tripan conforme detalhado por Strober18. Prosseguir com as culturas que mostram pelo menos 80% de viabilidade.
3. coloração por fluorescência de células para estudo da fagocitose (modificada de Madu et al. 15 )
- Coleta de dados qualitativos através do uso de microscópio de fluorescência
Nota: realize este ensaio com Acanthamoeba Acanthamoeba e C. neoformans uofs Y-1378.- Dispensar uma suspensão de 200 μL de amebas padronizadas (1 x 107 células/ml em meio atcc 712) em poços de câmara de um slide aderente e incubar por 2 h a 30 ° c para as células aderirem à superfície.
- Enquanto as células da ameba estão se estabelecendo para aderir, manchar as células C. neoformans Uofs Y-1378 padronizadas que foram ajustadas para 1 x 106 células/ml (em 999 μL de PBS) com 1 μL de isotiocianato de fluoresceína em um tubo de plástico de 1,5 ml.
Nota: Prepare a mancha dissolvendo 1 mg de isotiocianato de fluoresceína em 1 mL de acetona. - Agitar suavemente as células C. neoformans Uofs Y-1378 em um agitador orbital fixado em 50 rpm por 2 h em RT e no escuro.
- Após 2 h, centrifugue em 960 x g por 5 min a 30 ° c para pellet as células.
- Aspirar o sobrenadante para remover o PBS com a mancha.
- Adicione 1 mL de PBS ao tubo para lavar o pellet celular. Lave as células introduzindo suavemente a pipetagem.
- Centrifugue as células a 960 x g durante 5 min a 30 ° c. Descarte o sobrenadante. Repita a etapa de lavagem mais uma vez.
- Ressuscitem as células lavadas em 1 mL de PBS.
- Dispensar uma suspensão de 200 μL das células C. neoformans Uofs Y-1378 manchadas para poços de câmara contendo as células de ameba não manchadas.
- Incubar a cocultura preparada a 30 ° c por um período adicional de 2 horas.
Nota: a cocultura pode ser incubada para diferentes pontos de tempo para atender à finalidade do experimento. - No final do período de coincubação, aspirar o conteúdo dos poços.
- Adicione 300 μL de PBS aos poços para lavar os poços da câmara e para remover todas as células cocultivadas não acopladas. Faça isso por pipetagem suave. Aspirar o conteúdo dos poços. Repita a etapa de lavagem mais uma vez.
- Prepare a solução de glutaraldeído a 3% adicionando 3 mL de glutaraldeído a 97 mL de água destilada.
- Fixar as células cocultivadas adicionando 250 μL de solução de 3% aos poços da câmara e incubando por 1 h.
- Aspirar o fixador e lavar os poços da câmara como detalhado da etapa 3.1.13.
- Desmontar os poços de câmara usando uma ferramenta que foi fornecida com as lâminas da câmara.
- Adicione uma gota do composto de Antifade, 1,4-diazabicyclo-[2.2.2]-octano à corrediça para impedir o auto-branqueamento. Cubra com uma lamínula e sele os lados com um esmalte para evitar a evaporação.
- Veja as células cocultivadas usando a lente objetiva 100x (com óleo) de um microscópio de varredura de laser confocal.
Nota: é importante tirar fotos em campo brilhante e fluorescência para ver a interação entre ameba e células criptocócicas. Sempre que possível, a fluorescência pode ser superimposta para as imagens de campo brilhante. As pilhas de Amoeba são tipicamente maiores no tamanho (isto é, 45-60 μm), e as pilhas do trophozoite têm uma forma irregular. Células criptocócicas são 5-10 μm de diâmetro e têm uma forma globosa a ovóide. Quando exposto a um laser, é possível que as células de ameba não manchadas podem emitir fluorescência automática. Refira Beisker e Dolbeare19 e Clancy e cauller20 para métodos para reduzir o autofluorescence.
- Aquisição de dados quantitativos através do uso de leitor de placas de fluorescência
Nota: realize este ensaio com Acanthamoeba Acanthamoeba e c. neoformans uofs Y-1378 ou c. neoformans lmpe 046.- Dispensar uma suspensão de 100 μl de amebas padronizadas (ajustadas a 1 x 107 células/ml em meio ATCC 712) em uma placa de de microtitulação bem preta, aderente 96.
- Incubar a placa por 2 h a 30 ° c para permitir que as células da ameba aderem à superfície.
- Enquanto as células da ameba estão se estabelecendo para aderir, manchar o padronizado C. neoformans Uofs Y-1378 células que foram ajustadas para 1 x 106 células/ml (em 999 μL de PBS) com 1 ΜL de Phrodo verde Zymosan a biopartículas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mancha C. neoformans lmpe 046 células, bem como em um tubo separado.
Nota: a tintura, ao contrário de FITC, seletivamente mancha as pilhas que são prendidas dentro do ambiente ácido de uma pilha fagocitária21,22. Para esta técnica, é importante manter as células criptocócicas em um meio com um pH neutro (PBS) e ameba em um meio com um pH neutro (ATCC médio 712). Um meio com um ambiente ácido resultará em uma leitura falsa positiva das unidades de fluorescência relativa, implicando que um maior número de criptococos foram internalizados. - Agitar suavemente as células criptocócicas em um agitador orbital fixado em 50 rpm por 2 h em RT e no escuro.
- Após 2 h, centrifugue o tubo do microcentrifugador em 960 x g por 5 minutos em 30 ° c para aglomerar as pilhas. Aspirar o sobrenadante para remover PBS com a mancha.
- Adicione 1 mL de PBS ao tubo para lavar as células peletizadas. Lave as células por pipetagem suave.
- Centrifugue as células a 960 x g durante 5 min a 30 ° c. Descarte o sobrenadante. Repita a etapa de lavagem mais uma vez.
- Ressuscitem o pellet de células lavadas em 1 mL de PBS.
- Dispensar uma suspensão de 100 μL de células criptocócicas manchadas a poços contendo células de ameba não manchadas.
- Incubar a cocultura preparada a 30 ° c por um período adicional de 2 horas.
Nota: a cocultura pode ser incubada para diferentes temporais para atender à finalidade do experimento. - No final do período de coincubação, meça a fluorescência em um leitor de microplacas. Converta sinais logarítmicos em unidades de fluorescência relativa.
Nota: a excitação do corante está em 492 nm e a emissão é de 538 nm. Consulte Beisker e Dolbeare19 e Clancy e cauller20 para métodos para reduzir a autofluorescência.
4. uso da microscopia eletrônica de transmissão para estudo da fagocitose (modificada de Van Wyk e Wingfield 23 )
- Adicione uma suspensão de 5 ml de amebas (ajustada a 1 x 107 Cells/ml no meio ATCC 712) a um tubo de centrifugação de 15 ml e permita-os de estabelecer-se por 30 minutos em 30 ° c.
- Adicione uma suspensão de 5 mL de células C. neoformans Uofs Y-1378 (ajustadas a 1 x 106 células/ml em PBS) ao mesmo tubo de centrifugação que contenha 5 ml de células de ameba padronizadas.
- Deixe o suporte do tubo para 2 h a 30 ° c.
- Centrifugue o tubo em 640 x g por 3 min a 30 ° c para pellet as células cocultivadas. Aspirar o sobrenadante. Não lave as células cocultivadas.
- Fixar as células cocultivadas por ressuscita o pellet em 3 mL de 1,0 M (pH = 7,0) fosfato de sódio-tamponado 3% glutaraldeído por 3 h.
- Centrifugue o tubo em 1.120 x g por 5 min a 30 ° c para pellet as células cocultivadas. Aspirar o sobrenadante.
- Adicionar 5 mL de tampão fosfato de sódio ao tubo de centrifugação para lavar as células peletizadas. Lave suavemente a pipetagem do tubo durante 20 s.
- Centrifugue o tubo em 1.120 x g por 5 min a 30 ° c para pellet as células cocultivadas.
- Repita os passos 4.8-4.10. Aspirar o sobrenadante.
- Fixar as células cocultivadas novamente por ressuscita o pellet em 3 mL de 1,0 M (pH = 7,0) fosfato de sódio-tampão de ósmio 1% tetroxida para 1,5 h.
- Remova o fixador (tetroxida do ósmio) lavando as pilhas cocultivadas em uma maneira similar a remover o glutaraldehyde de 3%.
- Desidratar o material TEM (também conhecido como as células cocultivadas) em um acetoneseries classificados de 30%, 50%, 70%, 95% e duas alterações de 100% para 15 min cada, respectivamente. Para isso, adicione 3 mL da solução de acetona às células peletizadas e deixe-a ficar por 15 min. Em seguida, centrifugue a 200 x g por 10 min em RT descarte o sobrenadante e acrescente a maior porcentagem da solução de acetona.
- Prepare o epóxi de consistência normal de acordo com o protocolo por Spur24.
Nota: a resina epóxi é usada para seccionamento. - Incorpore o material de TEM na resina de cola Epoxy recentemente preparada. Para fazer isso, siga as etapas abaixo.
- Adicionar 3 mL da epoxi recém-preparada a um tubo que contenha o material TEM ressuspensão em 3 mL de solução de 100% de acetona. Deixe o tubo ficar por 1 h.
- Centrifugue o tubo a 200 x g durante 10 min a 30 ° c. Aspirar a solução de epóxi-acetona.
- Adicione 6 mL da cola Epoxy recentemente preparada à pelota no tubo. Deixe o tubo ficar por 1 h.
- Centrifugar a 200 x g durante 10 min a 30 ° c. Aspirar toda a solução de epóxi-acetona.
- Adicione 3 mL da cola Epoxy recentemente preparada ao tubo. Deixe o tubo ficar por 8 h.
- Centrifugar a 200 x g durante 10 min a 30 ° c. Aspirar toda a solução epóxi
- Adicione 3 mL da cola Epoxy recentemente preparada ao tubo. Mantenha o material de TEM na solução da cola Epoxy durante a noite em um dessecador do vácuo.
Cuidado: a resina epóxi é um material radioativo. Use EPI para manusear a resina epóxi. A resina epóxi também deve ser tratada em uma capa de fumaça. Os pesquisadores devem seguir os regulamentos de segurança para descartar tal material, conforme especificado por cada país25.
- Polimerize o material de TEM para 8 h em 70 ° c.
- No ultramicrotome, corte seções pequenas de aproximadamente 0,1 milímetros x 0,1 milímetros e 60 de espessura do nanômetro do material epóxi-encaixado com uma faca de vidro montada. Monte seções em uma grade e coloc as grades em uma caixa do suporte da amostra do TEM antes de manchar.
- Manchar as secções com uma gota de 6% de acetato de uranilo por 10 min no escuro. Assegure-se de que as secções estão completamente cobertas. |
Nota: reconstituir a mancha (6 g) em 100 mL de água destilada.
PRECAUÇÃO: o acetato de Uranyl é um material radioactivo. Use EPI para manipular acetato de uranilo. O acetato de uranyl também deve ser manuseado numa capa de fumos. Os pesquisadores devem seguir os regulamentos de segurança para descartar tal material, conforme especificado por cada país25. - Enxague as secções mergulhando-as cinco vezes numa taça que contenha 100 mL de água destilada.
Nota: a água destilada deve ser eliminada em conformidade, pois contém vestígios de acetato de uranilo. - Manchar a seção com uma gota de citrato de chumbo por 10 min no escuro. Assegure-se de que as secções estão completamente cobertas.
Nota: o citrato de chumbo deve ser preparado de acordo com o protocolo de Reynold26. - Enxague as secções mergulhando-as cinco vezes numa taça que contenha 100 mL de água destilada.
- Monte individualmente as grades com seções manchadas em uma caixa do suporte da amostra de TEM.
- Veja seções com um microscópio de elétron da transmissão.
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Representative Results
Micróbios são organismos microscópicos que não podem ser percebidos a olho nu. No entanto, o seu impacto pode resultar em doenças observáveis clinicamente evidentes, tais como infecções cutâneas. Ao estudar certos aspectos dos micróbios, variando de sua morfologia, subprodutos e interações, ser capaz de fornecer evidências pictóricas e de vídeo é de extrema importância.
Primeiramente, procurou-se Visualizar a interação entre células criptocócicas e ameba. Para esta finalidade, as imagens do brilhante-campo que mostraram 2 pilhas co-incubadas h foram estudadas primeiramente. Uma imagem revelou uma pilha criptocócica que estivesse na proximidade próxima ao Amoeba. Uma das células da ameba foi observada com pseudópodes estendido para capturar uma célula criptocócica (Figura 1a). Em seguida, uma imagem correspondente em fluorescência foi capturada para referência (Figura 1b). A fluorescência verde na superfície das células manchadas auxiliou na confirmação da presença de células criptocócicas. A ameba não manchada também auto-fluorescente. Isto, além do tamanho e da morfologia aparente da diferença, ajudado em distinguir mais mais os dois tipos da pilha.
A autofluorescência é uma qualidade frequentemente observada quando as estruturas biológicas emitem naturalmente a luz que absorveram (por exemplo, após a exposição a um laser durante a microscopia confocal da exploração do laser)27. Na Figura 1C, as células criptocócicas foram observadas (no mesmo ponto temporal de 2 h) que já foram internalizadas pela ameba. A imagem correspondente em fluorescência também foi capturada para referência (Figura 1D). Com base na evidência em mãos, é tentador concluir que a ameba matou as duas células presas. No entanto, a fagocitose é um processo dinâmico em que o hospedeiro, o predador e o patógeno, e a presa empregam diferentes estratégias para destruir ou fugir uns aos outros28. O ato de pilhas criptocócica que fugir pilhas fagocitária é demonstrado elegantemente pela vomocytosis29,30, que é um processo não-Lytic da expulsão de pilhas prendidas dos macrófagos. Este movimento ousado foi capturado em vídeos de lapso de tempo29,30. Infelizmente, isso destaca a limitação do estudo de imagens fixas de células fixadas, como em nosso trabalho, para elucidar um processo dinâmico como a fagocitose. Até o ponto, um pesquisador pode perder o intervalo quando uma célula escapa de seu capturador.
Para compensar o exposto, considerou-se a leitura de unidades de fluorescência relativa. No presente estudo, as leituras foram realizadas após um período de coincubação de 2 h e ajudaram a comparar a resposta das duas cepas criptocócicas de teste [i.e., uma que produz ácidos graxos 3-hidroxi (c. neoformans Uofs Y-1378) e a outra que não (c. neoformans lmpe 046)]. Foi supor que os ácidos graxos 3-hidroxi podem atuar como um determinante de virulência que prejudica a captação de células criptocócicas, incluindo a fagocitose por ameba. Para obter mais informações sobre a influência de ácidos graxos 3-hidroxi na ameba, é aconselhável referir-se a Madu et al.15,16. A Figura 2 mostra a quantidade de células criptocócicas que foram internalizadas com base na leitura de unidades de fluorescência. Ao comparar os dois isolados criptocócicos, ficou claro que as células que produzem os ácidos graxos 3-hidroxi foram internalizadas com menor frequência em comparação às células que não produzem ácidos graxos 3-hidroxi.
Para aprimorar os dados qualitativos, a microscopia eletrônica de transmissão foi incluída na análise (Figura 3a). Aqui, observou-se que a cepa que produz ácidos graxos 3-hidroxi (C. neoformans Uofs Y-1378) apresentava protuberâncias espessas na cápsula (Figura 3B), que pode ser usada pela célula para liberar ácidos graxos 3-hidroxi para o ambiente externo.
É importante notar que os dados (na Figura 1, Figura 3) transmitem o destino das células criptocócicas como sendo internalizados e não mortos/fagocitarizados. Para determinar se as células sobreviveram ao evento fagocítico, recomenda-se incluir um ensaio adicional no qual o pesquisador Lige as células da ameba e prepara um Agar de placa de propagação para enumerar as unidades de formação de colônia criptocócica (CFU). Ao contar com CFUs, Madu et al.15 relataram que as células criptocócicas produtoras de ácidos graxos 3-hidroxi também foram resistentes à ação fagocítica da ameba após a internalização. Assim, essas células produziram uma taxa de sobrevida significativamente maior quando comparadas às células que não produzem ácidos graxos 3-hidroxi.
A Figura 4 mostra a importância da preparação e do exame da amostra do tem. Neste exemplo, as seções de C. neoformans Uofs Y-1378 foram propositalmente superexpostas ao bombardeio de elétrons. No final, a imagem capturada não pode ser usada, pois compromete a qualidade das informações que podem ser dedujas. Tomados em conjunto, a informação obtida mostra que, combinando essas diferentes técnicas, um pesquisador é capaz de deduzir informações suficientes para determinar o destino das células criptocócicas quando cocultivadas com ameba.
| Ingrediente | Quantidade |
| peptona bacteriológica | 20 g/L |
| extrato de levedura | 10 g/L |
| Glicose | 20 g/L |
| Ágar | 15 g/L |
Tabela 1: ingredientes para fazer Agar YPD. Adicione a quantidade necessária todos os ingredientes em 1 L de água. Aqueça enquanto mexendo para dissolver os ingredientes completamente. Uma vez feito autoclave antes do uso.
| Ingrediente | Quantidade |
| sulfato de amônio | 5 g/L |
| Biotina | 2 μg/L |
| pantotenato de cálcio | 400 μg/L |
| ácido fólico | 2 μg/L |
| Inositol | 2000 μg/L |
| Niacina | 400 μg/L |
| ácido p-aminobenzoico | 200 μg/L |
| cloridrato de piridoxina | 400 μg/L |
| Riboflavina | 200 μg/L |
| cloridrato de tiamina | 400 μg/L |
| ácido bórico | 500 μg/L |
| sulfato de cobre | 40 μg/L |
| iodeto de potássio | 100 μg/L |
| cloreto férrico | 200 μg/L |
| sulfato de manganês | 400 μg/L |
| molibdato de sódio | 200 μg/L |
| sulfato de zinco | 400 μg/L |
| Fosfato monopotássico | 1 g/L |
| sulfato de magnésio | 0,5 g/L |
| cloreto de sódio | 0,1 g/L |
| cloreto de cálcio | 0,1 g/L |
Tabela 2: ingredientes para fazer caldo YNB. Adicione a quantidade necessária todos os ingredientes em 1 L de água. Aqueça enquanto mexendo para dissolver os ingredientes completamente. Uma vez feito autoclave antes do uso.
| Parte I: meio basal. | |
| Ingrediente | Quantidade |
| proteose peptona | 20 g/L |
| extrato de levedura | 1 g/L |
| Agar (se necessário) | 20 g/L |
| Parte II: suplementos. | |
| Ingrediente (soluções de estoque) | Quantidade |
| 0, 5 M CaCl2 | 8 mL de |
| 0,4 M MgSO4 x 7h2O | 10 ml de |
| 0,25 M nd2HPO4 x 7h2O | 10 mlL |
| 0,25 M KH2po4 | 10 mL de |
| Na citrato x 2H2O | 1 g de |
| 0, 5 M FE (NH4) 2 (so4) 2 x 6h2O | 10 mL de |
Tabela 3: ingredientes para fazer o meio ATCC 712. Prepare o meio basal em 900 mL de água. Prepare os suplementos separadamente e adicione ao meio basal. Uma vez feito ajustar o pH para 7,4 com 1 N HCl ou 1 N NaOH e autoclave. Filtro esterilizar 50 mL de solução de 2 M de glicose (18 g/50 mL) e adicioná-lo assepticamente ao meio completo antes da utilização.
Figura 1 : Brilhante-campo e correspondente micrografias fluorescentes mostrando ameba-Cryptococcus interativo momentos. (A) uma célula de ameba em estreita proximidade com uma célula de C. neoformans uofs Y-1378 pode ser observada. A imagem fluorescente correspondente é mostrada em (B). (C) representação de duas células C. neoformans uofs Y-1378 que estão presas no interior do vacuol alimentar de ameba. A imagem fluorescente correspondente é mostrada em (D). Este número foi modificado de Madu et al.15. A = ameba; C = c. neoformans. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Os resultados do ensaio da internalização de pilhas criptocócica cocultivadas com Amoeba. A leitura de unidades de fluorescência relativa permite a interpretação e comparação da eficiência de amebas para internalizar c. neoformans uofs Y-1378 e c. neoformans lmpe 046. As barras de erro representam os erros padrão calculados com base em três replicações biológicas. Este número foi modificado de Madu et al.15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Micrografias de elétrons de transmissão mostrando Cryptococcus interações. Micrografias de tem (a, b) confirmam as observações na figura 1C, D. (a) mostrada é uma célula C. neoformans uofs Y-1378 presa dentro do vacuol de alimentos de ameba, enquanto (b) é uma visão de close-up da Figura 3a . Este número foi modificado de Madu et al.15. A = célula de ameba; C = célula c. neoformans . A seta vermelha aponta em uma protuberância capsular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Um micrografia do elétron da transmissão que mostra C. neoformans uofs Y-1378 células. As células estão danificadas e, portanto, não podem fornecer dados significativos. As setas vermelhas indicam pontos onde a seção é rasgada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
No artigo, diferentes técnicas foram empregadas com sucesso para revelar o possível desfecho que pode surgir quando a ameba interage com células criptocócicas. Além disso, estávamos interessados em mostrar os efeitos dos ácidos graxos 3-hidroxi sobre o desfecho das interações Criptococcus-Amoeba.
A primeira técnica utilizada foi a microscopia confocal, que rendeu imagens ainda. A principal desvantagem desta técnica aqui foi que ele só nos deu informações que é limitada a um determinado ponto de tempo. Qualquer conclusão que pode ser desenhada com base nos resultados empresta-se ao raciocínio indutivo, onde se pode chegar a uma conclusão com base em um conjunto de observações32. No entanto, apenas porque se observa várias situações em que existe um padrão não significa que esse padrão é verdadeiro para todas as situações. Assim, no estudo, é demonstrado e possivelmente advertido como tais informações limitadas podem levar a conclusões infundadas. A ponto de, na ausência de evidências contraditórias ou de apoio, complementares, pode-se concluir que a internalização pode ter conduzido à fagocitose das células.
O ritmo de desenvolvimento na imagem traz novas oportunidades para fazer descobertas científicas, como foi o caso com a descoberta da vomocitose29,30. Para ilustrar este ponto sem o uso de um microscópio que pode gravar vídeos de lapso de tempo, essa descoberta não teria sido possível. Portanto, a falta de acesso a tal instrumentação high-end será sempre um obstáculo em recursos pobres-configurações que não estão na vanguarda de descobrir tais processos. Uma maneira de superar isso é buscar novas colaborações ou descobrir maneiras inovadoras de abordar questões de pesquisa. Um desenvolvimento bem-vindo tem sido a introdução e aplicação de manchas especializadas, como a mancha fagocítica utilizada aqui21,22. Esta mancha é pH-sensível e fluoresce a somente em ambientes ácidos como no lúmen do vacúolo15do alimento do ameba. Vale ressaltar que a mancha só dá informações relacionadas à internalização das células. Determinação se as células são eventualmente fagocytized em experimentos adicionais podem ser necessários.
Importante, tal mancha igualmente provou ser útil na medida da fluorescência. Este último permitiu a integração de dados quantitativos na tentativa de explicar o que acontece biologicamente em um ponto temporal específico. Aqui, o destino das células foi discersentido (ou seja, foi determinado se a presença de ácidos graxos 3-hidroxi prejudicou ou promoveu a internalização das células) por extrapolando o significado das leituras das unidades de fluorescência relativa.
Diferentemente deste estudo, os pesquisadores também podem optar por medir a fluorescência das células ao longo de um período de tempo. As informações obtidas são úteis para determinar o número de células internalizadas em um ponto de tempo e seguir como a quantidade muda ao longo do período. Da mesma forma, as imagens também podem ser tomadas em pontos de tempo correspondentes.
Este estudo mostra o poder de combinar uma série de métodos para chegar a uma conclusão fundamentada. A abordagem da combinação de múltiplas abordagens para monitorar a fagocitose quer para comparar ou complementar uma técnica inicial não é nova. Por exemplo, Meindl e colegas de trabalho33 compararam três técnicas (análise de imagem, fluorescência e leituras de citometria de fluxo) para investigar como o tamanho de partícula rotulada por fluorescência afeta a fagocitose do macrófago. O estudo provou que das três técnicas, a leitura da placa pode ser a melhor opção para monitorar a fagocitose33.
TEM é particularmente uma ferramenta poderosa, porque fornece uma vista de olho do pássaro no lúmen do vacuole do alimento. Muitas vezes, este nível de detalhe é freqüentemente desperdiçada por microscopia confocal na forma de imagens ainda, incluindo vídeos de lapso de tempo. A este ponto do tem, era interessante Visualizar protuberâncias nas superfícies da cápsula criptocócica. Foi supor previamente que estas estruturas de superfície da pilha estão usadas como uma canaleta para liberar 3 ácidos gordos hydroxy no ambiente circunvizinho para promover possivelmente a sobrevivência da pilha9,10,15, 31. o detalhe na Micrografia tem revela ainda que as protuberâncias na célula internalizada não são distorcidas e mantiveram sua integridade. Assim (dada a integridade das protuberâncias), é possível que eles possam entregar ácidos graxos 3-hidroxi no ambiente de vacuol alimentar e alterar as condições internas, levando à sobrevida celular conforme relatado por Madu et al.15,31. Uma limitação principal de usar o microscópio de elétron é que a preparação da amostra é muito laboriosa. Além disso, para evitar destruir as amostras como visto na Figura 4, o experimentador deve ser bem treinado para operar manualmente o ultramicrotome e o microscópio.
Em conclusão, prevê-se que os pesquisadores serão incentivados pela perspectiva de estudar a fagocitose simplesmente combinando imagens ainda fluorescentes com dados quantitativos. É de confiança que os pesquisadores podem obter informações suficientes deste protocolo e otimizá-lo em seus próprios estudos. Isso pode incluir o desenvolvimento de anticorpos contra metabólitos direcionados e aplicá-lo a estudos de imunofluorescência, incluindo a rotulagem de imuno-ouro durante o exame de Met.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O trabalho foi apoiado por uma subvenção da Fundação Nacional de investigação da África do Sul (número de subvenção: UID 87903) e da Universidade do estado livre. Também estamos gratos aos serviços e assistência oferecidos por Pieter Van Wyk e Hanlie Grobler durante nossos estudos de microscopia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | - |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | - |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | - |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | - |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | - |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | - |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | - |
| Centrifuge | Hermle | - | - |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | - |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | - |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | - |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | - |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | - |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | - |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | - |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | - |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | - |
| Hemocytometer | Boeco | - | - |
| Lead citrate | ALS | R1209 | - |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | - |
| Orbital shaker | Lasec | - | - |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | - |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | - |
| Rotary shaker | Labcon | - | - |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | - |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | - |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | - |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | - |
| Vacuum dessicator | Lasec | - | - |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | - |
| YNB | Lasec | 239210 | - |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | - |
References
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