Summary
이 논문에서는 스틸, 형광 이미지 및 고해상도 투과 전자 현미경 이미지를 사용하여 연구되는 크립토코카인 세포 및 아메바의 공동 배양을 준비하기 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 여기에 예시된 것은 정량적 데이터가 이러한 정성적 정보를 보완하는 방법입니다.
Abstract
Cryptococcus 감염을 시뮬레이션하기 위해 환경에서 크립토 코카인 세포의 자연 포식자인 아메바를 대식세포의 모델로 사용할 수 있습니다. 대식세포와 유사한 이 육식 유기체는 식세포증을 사용하여 내면화된 세포를 죽입니다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경의 도움으로 크립토 코카인 세포와 아메바 사이의 대화형 순간을 묘사하는 이미지가 캡처됩니다. 전자 현미경의 분해력은 또한 아메바 식품 액포내부에 갇혀있을 때 크립토 코카인 세포의 초구조적 세부 사항을 밝히는 데 도움이됩니다. 식세포증은 지속적인 과정이기 때문에 정량적 데이터가 분석에 통합되어 이미지가 캡처될 때 시점에서 어떤 일이 발생하는지 설명합니다. 구체적으로, 상대 형광 단위는 크립토 코카인 세포를 내화에 아메바의 효율을 정량화하기 위해 판독된다. 이를 위해 크립토코카인 세포는 염료로 염색되어 식품 액포의 산성 환경 내에 한 번 형광이 가해집니다. 함께 사용 하는 경우, 이러한 기술을 통해 수집 된 정보는 아메바에 의해 내면화 될 때 세포의 행동과 운명에 결론을 도출 하는 데 도움이 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다., 아마도, 다른 식세포 세포에 의해.
Introduction
미생물은 토양과 물의 열린 물리적 경계와 같은 다른 생태 틈새 에서 점유하고 번창하기 위해 시간이 지남에 따라 진화, 다른 사람의 사이에서1. 이러한 틈새 시장에서, 미생물은 종종 제한된 자원에 대한 직접 경쟁에 종사; 중요한 것은, 그들은 증가 인구를 수용 할 필요가 자신의 성장이나 공간을 지원하기위해 사용하는 영양소에 대한 2,3. 어떤 경우에, 아메바와 같은 일부 홀로주체 유기체는 심지어 그들의 바이오 매스에서 영양분을 추출하는방법으로 크립토 코카인 세포에 선행 할 수있다 4,5. 차례로, 이것은 그 먹이의 인구 수를 제어하여 영토 지배를 확립 할 수 있습니다. 이러한 약탈적 압력 때문에, 일부 먹이는 압력의 부정적인 영향을 조정하기 위해크립토코칼 캡슐 6과 같은 미생물 인자를 생성하도록 선택될 수 있다. 그러나, 이 압력의 의도하지 않은 결과로, 몇몇 세균은 종 장벽을 교차하고 영양분이 풍부하고이상적인 인체의 밀폐된 공간 같이 7를 식민지화하는 새로운 틈새 시장을 찾아내는 것을 허용하는 요인을 얻습니다 조건. 후자는 크립토 코커스 (C.) 같은지상파 미생물을 설명 할 수있다. 네오포만은 병원성으로 변할 수 있습니다.
이를 위해, 크립토 코카인 세포가 아메바와 가질 수있는 초기 접촉을 연구하는 것이 중요하고이 병원성이 될 그들을 선택할 수있는 방법. 더 구체적으로, 이것은 감염 도중 대식세포에 의해 행동할 때 cryptococcal 세포가 어떻게 행동하는지에 단서를 줄 수 있습니다. 이러한 이유로 아메바는 상대적으로 저렴하고 실험실에서 아메바의 문화를 유지하기 쉽기 때문에 여기에 대식세포의 모델로 선택되었습니다8. 관심의 또한 크립토 코카인 이차 대사 산물 을 조사하는 것이었습니다. 3-하이드록시 지방산9,10 아메바 및 크립토 코카인 세포 사이의 상호 작용에 영향을 미치는.
아메바와 육안으로의 먹이 사이의 상호 작용을 인식하는 간단한 방법은 한천 접시의 표면에 먹이를 사용하여 잔디를 만들고 아메바를 발견하는 것입니다. 한천 판에 플라크 또는 클리어 영역의 시각화는 아메바가 먹이를 먹였을 수 있는 영역을 묘사합니다. 그러나이 매크로 수준에서는 프로세스의 결과만 지적되며 식세포증의 과정은 기계화 될 수 없습니다. 따라서, 세포 대 세포 에 기초하여 과정을 이해하기 위해,11,12를사용할 수 있는 몇 가지 현미경 방법이 있다. 예를 들어, 인큐베이션 챔버를 가진 거꾸로 된 현미경은 식세포와 그 표적13사이의 사건의 시간 경과를 비디오로 기록하는데 사용될 수 있다. 불행히도, 시간 경과 기능을 가진 현미경의 비용으로 인해 실험실이 특히 자원 불량 설정에서 이러한 현미경을 구입하는 것이 항상 가능한 것은 아닙니다.
위의 한계를 피하기 위해, 이 연구는 C. 네오포르만스 비즈 C. 네오포르만스 UOFS Y-1378 및 C. 네오포르만스 LMPE 046아칸타모에바 카스텔라니의 상호작용을 평가하는 순차적 탐구 설계를 제시한다. . 첫째, 정량적 방법 앞에 정성적 방법이 사용됩니다. 정지 심상은 반전된 형광 현미경, 뿐만 아니라 아메바-Cryptococcus 상호 작용을 묘사하는 전송 전자 현미경을 사용하여 캡처됩니다. 이어서 플레이트 리더를 사용하여 형광을 정량화하여 아메바의 효율을 추정하여 크립토코카인 세포를 내화시켰다. 데이터 해석 단계에서 이러한 방법의 결과를 조정할 때 식세포증 시간 경과 비디오를 정독하는 것만큼 중요한 정보를 똑같이 드러낼 수 있습니다.
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Protocol
크립토코커스 네오포르만 및 일부 아칸타모에바 카스텔라니 균주는 생체 안전성 수준-2(BSL-2) 병원체로 간주된다; 따라서, 연구원은 이 유기체로 일할 때 적당한 예방 조치를 취해야 합니다. 예를 들어, 실험실 직원은 실험실 코트, 장갑 및 눈 보호와 같은 특정 교육 및 개인 보호 장비 (PPE)가 있어야합니다. 생물학적 안전 캐비닛(레벨 2)은 감염을 일으킬 수 있는 절차에 사용되어야합니다(레벨 2).14.
1. 곰팡이 세포의 재배 및 표준화 (Madu 등에서 수정 15)
- 효모-펩톤-덱스트로스(YPD) 한천 플레이트에서 스톡 배양물(9개월 이상 없음)에서 시험 곰팡이 균주(즉, C. neoformans UOFS Y-1378 및 C. neoformans LMPE 046)를 줄무늬. YPD 한천의 성분에 대한 정보는 표1에서 찾을 수 있습니다.
참고: C. neoformans UOFS Y-1378은 3-하이드록시 지방산을 생산하는 것으로 나타났으며, C. neoformans LMPE 046은 3-하이드록시 지방산을 생성하지 않습니다. 이러한 분자의 존재가 결정되는 방법에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1을 참조하십시오. - 30 °C에서 48 시간 동안 한천 판을 배양합니다.
참고: 플레이트는 4°C에서 최대 2개월 동안 보관할 수 있으며 폐기하거나 스톡배양(16)을 만드는 데 사용할 수 있다. - 48h-old plate에서 크립토코칼 세포(C.neoformans UOFS Y-1378 또는 C. neoformans LMPE 046)를 긁어내고 화학적으로 정의된 YNB 국물(6.7 g/L)의 100mL를 함유한 250 mL 원추형 플라스크로 접종합니다(6.7 g/L). w /v) 포도당. YNB 국물 재료에 대한 정보는 표2에서 찾을 수 있습니다.
- 플라스크를 30°C에서 24시간 동안 배양하고 회전식 셰이커에서 160 rpm에서 교반합니다.
- 24 시간 배양 후, 혈세포계를 사용하여 곰팡이 세포를 계산하고 pH 7.4에서 PBS로 세포 수를 1 x 106 세포 / mL로 조정합니다.
참고: 준비된 C. neoformans UOFS Y-1378 접종은 단계 3.1 및 3.2에서 사용되었고, C. neoformans LMPE 046 접종은 3.2 단계에서만 사용되었습니다.
2. 아메바 세포의 재배 및 표준화 (Madu 등에서 수정 15)
- 아칸타모에바 카스텔라니의 주식 문화를 해동하고 실온 (RT)에 가져.
참고: 아메바는 악셀슨-올슨 외8 및 슈스터17의수정된 프로토콜에 기초하여 제조되었다. - 해동 배양액의 피펫 1 mL을 ATCC 배지(712)의 15 mL를 함유하는 50 mL 원심분리기 튜브로 접종하였다. ATCC 배지 712의 성분에 대한 정보는 표3에서 확인할 수 있습니다.
- 400 x g 및 30 °C에서 5 분 동안 원심 분리기를 부드럽게 즉시 흔들어 줍니다.
- 상급자 흡인.
- ATCC 배지 712의 15 mL에서 세포를 재중단하고 14일 동안 30°C에서 튜브를 배양한다.
참고 : 주기적으로 간단한 빛 현미경을 사용하여 세포를 확인하여 트로포 조이트 상태에 있는지 확인하십시오. 일단 그들이 trophozoite 상태에, 신선한 문화를 시작. - 피펫 1 mL은 트로포조이트 상태에서 세포를 나타내고 이를 사용하여 신선하고 멸균된 ATCC 배지 712의 15 mL를 함유하는 멸균 50 mL 원심분리튜브를 접종하는데 사용한다.
- 회전 쉐이커에서 160 rpm에서 교반하면서 1 주일 동안 30 °C에서 튜브를 배양합니다.
- 1주일 후, 혈세포계를 사용하여 아메바 세포를 계산하고 신선하고 멸균된 ATCC 배지 712로 세포 수를 1 x 107 세포/mL로 조정합니다.
- 스트로버18에의해 상세한 대로 트라이팬 블루 얼룩을 사용하여 생존 분석을 수행합니다. 적어도 80% 생존가능성을 보여주는 문화권으로 더 나아가보라고 한다.
3. 식균증을 연구하는 세포의 형광 염색 (Madu 등에서 수정 15)
- 형광 현미경을 사용하여 정성적 데이터 수집
참고 : 아칸타모에바 카스텔라니와 C. 네오포르만스 UOFS Y-1378이 분석작업을 수행합니다.- 표준화된 아메바(ATCC 배지 712에서 1 x 107 셀/mL)의 200 μL 현탁액을 부착 슬라이드의 챔버 웰에 분배하고 30°C에서 2시간 동안 배양하여 세포가 표면에 부착하도록 합니다.
- 아메바 세포가 부착하기 위해 침전되는 동안, 1 x 106 세포 /mL (PBS의 999 μL)으로 조정 된 표준화 된 C. neoformans UOFS Y-1378 세포를 1.5 mL 플라스틱 튜브에서 1 μL의 플루오레세이세이토시오시아네이트로 얼룩지게합니다.
참고: 아세톤 1 mL에 1 mg의 플루오레세인 이소티오냐네이트를 용해시켜 얼룩을 준비합니다. - Rt와 어둠 속에서 2 시간 동안 50 rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 C. neoformans UOFS Y-1378 세포를 부드럽게 교반하십시오.
- 2시간 후, 960 x g에서 원심분리기를 30°C에서 5분 동안 펠렛세포에.
- 상급체를 흡인하여 얼룩으로 PBS를 제거한다.
- 셀 펠릿을 세척하기 위해 튜브에 PBS 1 mL을 추가합니다. 부드럽게 파이펫팅하여 세포를 씻으십시오.
- 30°C에서 5분 동안 960 x g에서 세포를 원심분리한다. 상급제는 버리십시오. 세탁 단계를 한 번 더 반복하십시오.
- 세척된 세포를 PBS의 1 mL에서 다시 중단합니다.
- 염색된 C. 네오포르만스 UOFS Y-1378 세포의 200 μL 현탁액을 얼룩지지 않은 아메바 세포를 함유하는 챔버 웰에 분배한다.
- 제조된 공동 배양액을 30°C에서 추가로 2시간 동안 배양한다.
참고: 공동 배양은 실험의 목적에 맞게 서로 다른 시간 지점에 대해 배양될 수 있다. - 공동 잠복기가 끝나면 우물의 내용을 흡인합니다.
- 300 μL의 PBS를 웰에 추가하여 챔버 웰을 세척하고 결합되지 않은 공동 배양 세포를 제거합니다. 부드러운 파이펫팅으로 이 작업을 수행합니다. 우물의 내용을 흡인합니다. 세탁 단계를 한 번 더 반복하십시오.
- 97 mL의 증류수에 3 mL의 글루타랄데히드를 추가하여 3% 글루타랄데히드 용액을 준비합니다.
- 챔버 웰에 250 μL의 3% 용액을 추가하고 1 시간 동안 배양하여 공동 배양 된 세포를 고정시.
- 3.1.13 단계에서 자세히 설명된 바와 같이 고정제를 흡인하고 챔버 웰을 세척한다.
- 챔버 슬라이드와 함께 제공된 도구를 사용하여 챔버 웰을 해체합니다.
- 안티페이드 화합물, 1,4-디아자비시클로-[2.2.2]-옥탄을 슬라이드에 추가하여 자동 표백을 방지합니다. 커버슬립으로 덮고 증발을 방지하기 위해 매니큐어로 측면을 밀봉합니다.
- 공초점 레이저 스캐닝 현미경의 100x 대물렌즈(오일 포함)를 사용하여 공동 배양된 세포를 봅니다.
참고 : 아메바와 크립토 코카인 세포 사이의 상호 작용을 보기 위해 밝은 필드와 형광으로 사진을 찍는 것이 중요합니다. 가능한 경우 형광을 밝은 필드 이미지에 슈퍼 부과할 수 있습니다. 아메바 세포는 전형적으로 크기가 더 크며(즉, 45-60 μm), 트로포조이트 세포는 불규칙한 형상을 갖는다. 크립토코카인 세포는 직경이 5-10 μm이고 난형 형상에 글로보스를 갖는다. 레이저에 노출되면 얼룩이 없는 아메바 세포가 자동 형광을 방출할 수 있습니다. 자동 형광을 줄이는 방법은 비스커와 돌베레19, 클랜시와 콜러20을 참조하십시오.
- 형광 플레이트 리더를 사용하여 정량적 데이터 수집
참고 : 아칸타모에바 카스텔라니와 C. 네오포르만스 UOFS Y-1378 또는 C. 네오포르만스 LMPE 046으로 이 분석작업을 수행합니다.- 표준화된 아메바(ATCC 배지 712에서 1 x 107 셀/mL로 조정)의 100 μL 현탁액을 검정부착형 96웰 마이크로티터 플레이트에 분배합니다.
- 아메바 세포가 표면에 부착 할 수 있도록 30 °C에서 2 시간 동안 플레이트를 배양.
- 아메바 세포가 부착하기 위해 침전되는 동안, 표준화된 C. neoformans UOFS Y-1378 세포를 1 x 106 세포/mL(PBS 의 999 μL)으로 1 μL의 pHrodo Green Zymosan A BioParticles 1.5 mL 마이크로 센트리 퓨저 튜브에 장착했습니다. 스테인 C. 네오포만LMPE 046 세포뿐만 아니라 별도의 튜브.
참고 : 염료는 FITC와 달리 식세포21,22의산성 환경 내에 갇혀있는 세포를 선택적으로 얼룩지게합니다. 이 기술의 경우, 중성 pH(ATCC medium 712)를 가진 배지에서 중성 pH(PBS) 및 아메바를 가진 배지에서 크립토코카인 세포를 유지하는 것이 중요하다. 산성 환경을 가진 매체는 상대 형광 단위의 거짓 양성 판독을 초래할 것이며, 이는 더 많은 수의 크립토코커스가 내면화되었음을 암시합니다. - RT와 어둠 속에서 2 시간 동안 50 rpm으로 설정된 궤도 셰이커에서 크립토 코칼 세포를 부드럽게 교반하십시오.
- 2시간 후, 960 x g에서 미세원심분리튜브를 30°C에서 5분 동안 펠렛세포로 하였다. 상급체를 흡인하여 얼룩으로 PBS를 제거합니다.
- 튜브에 1 mL의 PBS를 추가하여 펠릿 세포를 세척합니다. 부드러운 파이펫팅으로 세포를 씻으하십시오.
- 30°C에서 5분 동안 960 x g에서 세포를 원심분리한다. 상급제는 버리십시오. 세탁 단계를 한 번 더 반복하십시오.
- PBS의 1 mL에 세척 된 세포의 펠릿을 다시 중단.
- 염색되지 않은 아메바 세포를 함유하는 우물에 염색된 크립토코카인 세포의 100 μL 현탁액을 분배합니다.
- 제조된 공동 배양액을 30°C에서 추가로 2시간 동안 배양한다.
참고: 실험 목적에 맞게 서로 다른 타임포인트에 대해 공동 배양양을 배양할 수 있습니다. - 공동 배양 기간이 끝나면 마이크로 플레이트 리더에서 형광을 측정합니다. 로그신호를 상대형광 단위로 변환합니다.
참고 : 염료의 흥분은 492 nm이며 방출은 538 nm입니다. 자가형광을 줄이는 방법은 비스커와 돌베레19, 클랜시와 콜러20에 문의하십시오.
4. 식균증을 연구하기 위해 투과 전자 현미경 검사법의 사용 (반 와이크와 윙 필드 23에서 수정)
- 아메바의 5 mL 현탁액(ATCC 배지 712에서 1 x 107 세포/mL로 조정)을 15 mL 원심분리기 튜브에 넣고 30°C에서 30분 동안 정착할 수 있도록 합니다.
- 표준화된 아메바 세포 5 mL을 포함하는 동일한 원심분리관에 C. neoformans UOFS Y-1378 셀(PBS에서 1 x 106 세포/mL로 조정)의 5 mL 현탁액을 추가합니다.
- 튜브 스탠드를 30°C에서 2시간 동안 두십시오.
- 튜브를 640 x g에서 30°C에서 3분 동안 탄환을 공동 배양된 세포를 펠렛한다. 상급자 흡인. 공동 배양 된 세포를 세척하지 마십시오.
- 3.0 M (pH = 7.0) 나트륨 인산염 완충제 3% 글루타랄데히드 3 시간 동안 펠렛을 3 mL로 재중단시킴으로써 공동 배양 된 세포를 고정시.
- 튜브를 1,120 x g에서 30°C에서 5분 동안 탄환을 펠렛하여 공동 배양된 세포를 펠렛한다. 상급자 흡인.
- 원심분리기 튜브에 인산나트륨 완충제 5 mL를 추가하여 펠릿 세포를 세척합니다. 튜브의 내용물20s를 부드럽게 파이펫팅하여 세척합니다.
- 튜브를 1,120 x g에서 30°C에서 5분 동안 탄환을 펠렛하여 공동 배양된 세포를 펠렛한다.
- 4.8-4.10 단계를 반복합니다. 상급자 흡인.
- 1.5 시간 동안 1%의 오스뮴 테트옥사이드를 1%로 완충한 인산나트륨 1.0 m(pH= 7.0)의 3 mL에서 펠릿을 다시 중단하여 공동 배양 된 세포를 다시 고정시.
- 3% 글루타랄데히드를 제거하는 유사한 방식으로 공동 배양 된 세포를 세척하여 고정제 (오스뮴 테트옥사이드)를 제거하십시오.
- 각각 30%, 50%, 70%, 95%, 100%의 2가지 변화(공동 배양 세포라고도 함)에서 TEM 물질(공동 배양 세포라고도 함)을 탈수한다. 이렇게 하려면, 아세톤 용액 3 mL를 펠릿 된 세포에 넣고 15 분 동안 방치하십시오. 그런 다음 RT에서 10 분 동안 200 x g의 원심 분리기를 폐기하고 아세톤 용액의 높은 비율을 추가하십시오.
- Spur24에의한 프로토콜에 따라 정상 일관성의 에폭시를 준비합니다.
참고 : 에폭시 수지는 단면화에 사용됩니다. - 갓 제조된 에폭시 수지에 TEM 물질을 내장한다. 이렇게 하려면 아래 단계를 따르십시오.
- 아세톤의 100% 용액의 3 mL에 재중단된 TEM 물질을 포함하는 튜브에 갓 제조된 에폭시의 3 mL를 추가한다. 튜브가 1시간 동안 방치합니다.
- 30°C에서 10분 동안 200 x g에서 튜브를 원심분리한다. 에폭시-아세톤 용액을 흡인한다.
- 갓 준비한 에폭시 6 mL을 튜브의 펠릿에 넣습니다. 튜브가 1시간 동안 방치합니다.
- 200 x g에서 30 °C에서 10 분 동안 원심 분리기. 모든 에폭시-아세톤 용액을 흡인합니다.
- 갓 준비한 에폭시 3 mL을 튜브에 넣습니다. 튜브가 8시간 동안 방치합니다.
- 200 x g에서 30 °C에서 10 분 동안 원심 분리기. 모든 에폭시 용액 흡입
- 갓 준비한 에폭시 3 mL을 튜브에 넣습니다. TEM 물질을 진공 건조기에서 하룻밤 동안 에폭시 용액에 보관하십시오.
주의: 에폭시 수지는 방사성 물질이다. PPE를 사용하여 에폭시 수지 처리합니다. 에폭시 수지도 연기 후드에서 처리해야합니다. 연구원은 각 국가25에의해 지정된 것과 같은 물질을 폐기하기위한 안전 규정을 따라야한다.
- 70 °C에서 8 시간 동안 TEM 물질을 중합.
- 울트라 마이크로톤에서는 에폭시 내장 소재에서 약 0.1mm x 0.1mm 및 60nm 두께의 작은 부분을 장착된 유리 나이프로 다듬습니다. 그리드에서 단면을 조립하고 얼룩을 지키기 전에 TEM 샘플 홀더 상자에 그리드를 놓습니다.
- 어둠 속에서 10 분 동안 6 % 우라일 아세테이트의 방울로 섹션을 얼룩. 섹션이 완전히 덮여 있는지 확인합니다.|
참고: 증류수 100 mL에서 얼룩(6g)을 재구성합니다.
주의: 우라벨 아세테이트는 방사성 물질입니다. PPE를 사용하여 우라릴 아세테이트를 처리하십시오. 우라날 아세테이트는 또한 연기 후드에 처리해야합니다. 연구원은 각 국가25에의해 지정된 것과 같은 물질을 폐기하기위한 안전 규정을 따라야한다. - 100 mL의 증류수를 함유한 비커에 5번 찍어 섹션을 헹굽니다.
참고 : 증류수는 우라벨 아세테이트의 흔적이 포함되어 있으므로 그에 따라 폐기해야합니다. - 어둠 속에서 10 분 동안 납 구연산염 한 방울로 섹션을 얼룩지게하십시오. 섹션이 완전히 덮여 있는지 확인합니다.
참고 : 납 구연산염은 레이놀드26에의해 프로토콜에 따라 준비되어야한다. - 100 mL의 증류수를 함유한 비커에 5번 찍어 섹션을 헹굽니다.
- TEM 샘플 홀더 박스에 스테인드 섹션으로 그리드를 개별적으로 조립합니다.
- 전송 전자 현미경으로 섹션을 볼 수 있습니다.
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Representative Results
미생물은 육안으로 인식할 수 없는 현미경 유기체입니다. 그러나, 그들의 충격은 피부 감염과 같은 관찰 가능한 임상으로 명백한 질병 귀착될 수 있습니다. 미생물의 특정 측면을 공부 할 때, 자신의 형태에 이르기까지, 부산물, 상호 작용, 회화 및 비디오 증거를 제공 할 수있는 것은 가장 중요하다.
우리는 먼저 크립토 코카인 세포와 아메바 사이의 상호 작용을 시각화하기 위해 노력했습니다. 이를 위해, 2시간 공동 배양 세포를 나타낸 밝은 필드 이미지를 먼저 연구하였다. 한 이미지는 아메바에 가까운 곳에 있던 크립토 코카인 세포를 공개했습니다. 아메바 세포 중 하나는 크립토코카인 세포를 포획하기 위해 확장된 의사포디아로 보였다(도1A). 다음으로, 참조를 위해 형광에 상응하는 이미지를 캡처하였다(도1B). 염색된 세포의 표면에 녹색 형광은 크립토코커스 세포의 존재를 확인하는 데 도움을 주었다. 얼룩지지 않은 아메바도 자동 형광을 가했습니다. 이는 명백한 차이 크기 및 형태에 더하여, 두 세포 유형을 더욱 구별하는 데 도움을 주었다.
자가형광은 생물학적 구조가 흡수한 빛을 자연적으로 방출할 때 종종 관찰되는 품질(예를 들어, 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사법 동안 레이저에 노출)27. 도1C에서, 크립토코카인 세포는 이미 아메바에 의해 내화되었다 (2 시간의 동일한 시점에서) 지적되었다. 형광의 해당 이미지는 참조를 위해 캡처되었습니다(도1D). 손에 증거에 따라, 그것은 아메바가 두 갇힌 세포를 죽였다는 결론을 유혹. 그러나 식균증은 숙주, 포식자 및 병원균, 및 먹이가 서로를파괴하거나 회피하기 위해 상이한 전략을 사용하는 것을 여기서 동적 과정이다 28. 식세포세포를 회피하는 크립토코칼세포의 행위는 대식세포로부터 포획된 세포의 비용해 추방 과정인 vomocytosis29,30에의해 우아하게 입증된다. 이 대담한 움직임은 타임 랩스 비디오29,30에서캡처되었습니다. 불행하게도, 이것은 식세포증 같이 역동적인 프로세스를 해명하기 위하여, 우리의 연구 결과에서와 같이, 고정된 세포의 정지 심상을 공부의 한계를 강조합니다. 요점에, 연구원은 세포가 그것의 포획자에서 탈출할 때 간격을 놓칠 수 있습니다.
상기를 보완하기 위해, 상대형광단위의 판독을 고려하였다. 현재 연구에서, 판독값은 2시간 공동 잠복기 후에 취해진 두 개의 시험 크립토코카인 균주[즉, 3-하이드록시 지방산(C.neoformans UOFS Y-1378)을 생성하는 것[즉, 1개의 시험 크립토코칼 균주의 반응을 비교하는 데 도움이되었다(C. 네오포만스 LMPE 046)]. 그것은 3-hydroxy 지방산은 아메바에 의한 식세포증을 포함하여 크립토 코칼 세포의 섭취를 손상시키는 독성 결정요인으로 작용할 수 있다는 가설을 세웠다. 아메바에 3-하이드록시 지방산의 영향에 대한 자세한 내용은 Madu 외15,31을참조하는 것이 좋습니다. 도 2는 형광 단위의 판독에 기초하여 내중화된 크립토코칼 세포의 양을 나타낸다. 2개의 크립토코칼 분리제를 비교할 때, 3-하이드록시 지방산을 생산하는 세포가 3-하이드록시 지방산을 생성하지 않는 세포에 비해 덜 자주 내재화되었다는 것이 분명했다.
정성적 데이터를 향상시키기 위해, 투과 전자 현미경을 분석(도3A)에포함하였다. 여기서, 3-하이드록시 지방산(C.neoformans UOFS Y-1378)을 생성하는 균주가 캡슐 상에서 뾰족한 protuberances를 가졌다는 점에 주목하였다(도3B),이는 세포가 외부 환경에 3-하이드록시 지방산을 방출하는데 사용될 수 있다.
데이터(그림 1,그림 3)는 크립토코칼 세포의 운명을 내재화되고 죽이지 않고 가사화되지 않은 것으로 전달하는 것이 중요합니다. 세포가 식세포 사건에서 살아남았는지 확인하기 위해, 연구원이 아메바 세포를 용해시키고 크립토 코카인 콜로니 형성 단위 (CFU)를 열거하기 위해 스프레드 플레이트 한천을 준비하는 추가 분석기를 포함하는 것이 좋습니다. CFUs를 계산함으로써, Madu 등15 는 3-하이드록시 지방산을 생산하는 크립토 코카인 세포가 내재화 후 아메바의 식세포 작용에 도 강하다고 보고했다. 따라서, 이들 세포는 3-하이드록시 지방산을 생성하지 않는 세포에 비해 상당히 높은 생존율을 산출하였다.
도 4는 TEM 시료 준비 및 검사의 중요성을 나타낸다. 이 경우, C. 네오포르만스 UOFS Y-1378 섹션은 의도적으로 전자 포격에 과도하게 노출되었다. 결국 캡처된 이미지는 추론할 수 있는 정보의 품질을 손상하므로 사용할 수 없습니다. 종합하면, 얻은 정보는 이러한 다른 기술을 결합함으로써, 연구원은 아메바와 공동 배양 할 때 크립토 코카인 세포의 운명을 결정하기에 충분한 정보를 추론 할 수 있음을 보여줍니다.
| 성분 | 수량 |
| 세균학적 펩톤 | 20 g/L |
| 효모 추출물 | 10 g/L |
| 포도 당 | 20 g/L |
| Agar | 15 g/L |
표 1: YPD 한천을 만들기 위한 성분. 필요한 양을 물 1L에 모든 재료를 추가합니다. 재료를 완전히 녹이면서 가열합니다. 일단 사용 하기 전에 오토 클레이브를 완료 합니다.
| 성분 | 수량 |
| 황산 암모늄 | 5 g/L |
| 비오 틴 | 2 μg/L |
| 칼슘 판토텐산 | 400 μg/L |
| 엽산 | 2 μg/L |
| 이노시톨 | 2000 μg/L |
| 니 아 신 | 400 μg/L |
| p-아미노벤조산 | 200 μg/L |
| 피리독신 염산염 | 400 μg/L |
| 리 보 플 라빈 | 200 μg/L |
| 티아민 염산염 | 400 μg/L |
| 붕산 | 500 μg/L |
| 구리 황산염 | 40 μg/L |
| 요오드화 칼륨 | 100 μg/L |
| 페레릭 염화물 | 200 μg/L |
| 망간 황산염 | 400 μg/L |
| 몰리브다테 나트륨 | 200 μg/L |
| 황산 아연 | 400 μg/L |
| 모노포타슘 인산염 | 1 g/L |
| 황산 마그네슘 | 0.5 g/L |
| 염화나트륨 | 0.1 g/L |
| 염화칼슘 | 0.1 g/L |
표 2: YNB 국물을 만들기 위한 성분. 필요한 양을 물 1L에 모든 재료를 추가합니다. 재료를 완전히 녹이면서 가열합니다. 일단 사용 하기 전에 오토 클레이브를 완료 합니다.
| 파트 1: 기초 매체. | |
| 성분 | 수량 |
| 프로테오스 펩톤 | 20 g/L |
| 효모 추출물 | 1 g/L |
| 한천 (필요한 경우) | 20 g/L |
| 파트 II: 보충제. | |
| 성분 (재고 솔루션) | 수량 |
| 0.05 M CaCl2 | 8mL |
| 0.4 M MgSO4 x 7H2O | 10 ml |
| 0.25 M Na2HPO4 x 7H2O | 10 mlL |
| 0.25 M KH2PO4 | 10 mL |
| 나 시레이트 x 2H2O | 1 g |
| 0.005 M Fe(NH 4)2(SO 4)2 x 6H2O | 10 mL |
표 3: ATCC 매체 712를 만들기 위한 성분. 900 mL의 물에 기초 매체를 준비하십시오. 보충제를 별도로 준비하고 기저 매체에 추가하십시오. 일단 1 N HCl 또는 1 N NaOH 및 오토클레이브로 pH를 7.4로 조정합니다. 2M 포도당(18 g/50 mL)의 50 mL 용액을 살균하고 사용하기 전에 완전한 배지에 무균처리하여 추가하십시오.
그림 1 : 아메바를 보여주는 밝은 필드 및 해당 형광 현미경 -Cryptococcus 대화 형 순간. (a) C. 네오포르만스 UOFS Y-1378 세포에 근접한 아메바 세포를 볼 수 있다. 상응하는 형광 화상은 (B)에 도시된다. (C) 아메바 식품 액포올 내부에 갇혀 있는 2개의 C. 네오포르만UOFS Y-1378 세포의 묘사. 상응하는 형광화상은 (D)에도시된다. 이 그림은 Madu 외15에서수정되었습니다. A = 아메바; C = C. 네오포만 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 아메바와 함께 배양된 크립토코카인 세포의 내재화 분석의 결과. 상대 형광 단위의 판독은 C. 네오포만UOFS UOFS Y-1378 및 C. 네오포만LMPE 046을 내면화하기 위해 아메바의 효율성을 해석하고 비교할 수 있게 한다. 오류 막대는 세 가지 생물학적 복제에 따라 계산된 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림은 Madu 외15에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 아메바를 보여주는 투과 전자 현미경- 크립토 코커스 상호 작용. TEM 현미경(A, B)은 도 1C에서관찰을 확인한 결과, D. (A) 아메바 식품 액포올 내부에 갇힌 C. 네오포만스 UOFS Y-1378 세포이며, (B)는 도 3A의 클로즈업 뷰입니다. . 이 그림은 Madu 외15에서수정되었습니다. A= 아메바 셀; C = C. 네오포만스 셀. 빨간색 화살표는 캡슐형 프로튜브런스를 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 투과 전자 현미경 C. 네오포만스 UOFS Y-1378 세포. 세포가 손상되어 의미 있는 데이터를 제공할 수 없습니다. 빨간색 화살표는 단면이 찢어진 점을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
논문에서, 아메바가 크립토 코카인 세포와 상호 작용할 때 발생할 수있는 가능한 결과를 밝히기 위해 다른 기술이 성공적으로 사용되었습니다. 또한, 우리는 Cryptococcus-amoeba 상호 작용의 결과에 3-하이드록시 지방산의 효과를 보여주기 위해 관심이 있었습니다.
사용된 첫번째 기술은 정지 심상을 렌더링하는 공초점 현미경 검사법이었습니다. 이 기술의 주요 단점은 특정 시간대에 만 제한된 정보를 제공했다는 것입니다. 결과에 기초하여 그려질 수 있는 모든 결론은 유도적 추론에 빌려주며, 여기서 관찰 세트(32)에 기초하여 결론에 도달할 수있다. 그러나 패턴이 존재하는 몇 가지 상황을 관찰한다고 해서 해당 패턴이 모든 상황에서 사실임을 의미하지는 않습니다. 따라서, 연구에서, 그것은 표시 하 고 아마도 어떻게 이러한 제한 된 정보 근거 없는 결론으로 이어질 수 있습니다 주의. 요점, 모순 또는 지원의 부재, 보완적인 증거, 그것은 내연성 세포의 식세포증으로 이어질 수 있습니다 결론을 내릴 수있다.
화상 진찰에 있는 발달의 속도는 vomocytosis의폭로와 같이 과학적인 발견을 만들기 위하여 새로운 기회를, 29,30를가져옵니다 . 시간 경과 비디오를 기록 할 수있는 현미경을 사용하지 않고이 점을 설명하기 위해이 발견은 가능하지 않았을 것입니다. 따라서 이러한 고급 계측에 대한 액세스 부족은 항상 이러한 프로세스를 밝히는 데 최전선에 있지 않은 리소스 불량 설정에 장애물이 될 것입니다. 이를 극복하는 한 가지 방법은 새로운 협업을 모색하거나 연구 질문을 해결하는 혁신적인 방법을 발견하는 것입니다. 1개의 환영 발달은 여기에서 사용되는 식세포 얼룩과 같은 특수 한 얼룩의 소개 및 적용이었다21,22. 이러한 얼룩은 pH에 민감하고 아메바 식품 액후올(15)의 루멘과 같은산성 환경에서만 형광된다. 얼룩은 세포의 내과화와 관련된 정보만 제공한다는 점을 지적하는 것이 좋습니다. 세포가 추가 실험에서 결국 식세포화되는 지 에 대한 결정은 필요할 수 있다.
중요한 것은, 이러한 얼룩은 또한 형광의 측정에 유용한 것으로 판명되었습니다. 후자는 하나의 특정 시점에서 생물학적으로 일어나는 일을 설명하기 위해 정량적 데이터의 통합을 허용했습니다. 여기서, 세포의 운명은 상대형 형광 단위의 판독으로부터 의미를 추정함으로써 분별(즉, 3-하이드록시 지방산의 존재가 세포의 내재화를 손상시키거나 촉진했는지 여부를 결정하였다).
이 연구 결과와는 달리, 연구원은 또한 기간 동안 세포의 형광을 측정하도록 선택할 수 있습니다. 얻은 정보는 한 시점에서 내인터페이스되는 셀 수를 결정하고 기간 동안 양이 어떻게 변경되는지를 결정하는 데 유용합니다. 마찬가지로 해당 시점에서 이미지를 촬영할 수도 있습니다.
이 연구는 합리적 결론에 도달하기 위해 여러 가지 방법을 결합하는 힘을 보여줍니다. 초기 기술을 비교하거나 보완하기 위해 식세포증을 모니터링하기 위해 여러 가지 접근법을 결합하는 접근 방식은 새로운 것이 아닙니다. 예를 들어, Meindl 및 동료33은 형광 표지 입자 크기가 대식세포 식세포증에 미치는 영향을 조사하기 위해 세 가지 기술(이미지 분석, 형광 및 유세포 측정 값)을 비교했습니다. 이 연구는 세 가지 기술 중, 판 판독이 식세포증 을 모니터링하는 최선의 선택이 될 수 있음을 증명했다33.
TEM은 특히 강력한 도구입니다, 그것은 음식 액포의 내강으로 조감도를 제공하기 때문에. 종종, 세부 사항의이 수준은 종종 시간 경과 비디오를 포함하여 정지 이미지의 형태로 공초점 현미경 검사법에 의해 놓친다. TEM의 이 시점에, 크립토 코크컬 캡슐의 표면에 protuberances를 시각화하는 것이 흥미로웠습니다. 그것은 이전에 이러한 세포 표면 구조 가능성이 세포 생존을 촉진 하기 위해 주변 환경으로 3-hydroxy지방산을 방출 하는 채널로 사용 되는 가설 9,10,15, 31. TEM 현미경 의 세부 사항은 내부화 된 세포의 protuberances가 왜곡되지 않고 무결성을 유지했다는 것을 더 잘 보여줍니다. 따라서 (protuberances의 무결성을 감안할 때), 그들은 식품 액쿨레 환경으로 3-하이드록시 지방산을 전달하고 내부 조건을 변화시킬 수 있으며, Madu et al.15,31에의해 보고된 바와 같이 세포 생존으로 이어질 수 있다. 전자 현미경을 사용하는 주요 제한사항은 샘플 전처리가 매우 힘들다는 것입니다. 더욱이, 도4에서 볼 수 있듯이 시료를 파괴하는 것을 막기 위해, 실험자는 초음파 및 현미경을 수동으로 조작하도록 잘 훈련되어야 한다.
결론적으로, 연구원은 단순히 정량적인 데이터와 아직도 형광성 심상을 결합해서 식세포증을 공부의 전망에 의해 격려될 것이라는 점을 예상됩니다. 연구원이이 프로토콜에서 충분 한 정보를 얻을 하 고 그들의 자신의 연구에 최적화 수 있습니다 신뢰할 수 있는. 이것은 표적으로 한 대사 산물에 대하여 항체의 발달을 포함하고 TEM 시험 도중 면역 금 표시를 포함하여 면역 형광 연구 결과에 이것을 적용하는.
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Disclosures
저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 남아프리카 공화국의 국립 연구 재단 (보조금 번호 : UID 87903)과 자유 국가의 대학에서 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 또한 우리의 현미경 연구 기간 동안 피터 반 와이크와 핸리 그로블러가 제공하는 서비스와 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | - |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | - |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | - |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | - |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | - |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | - |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | - |
| Centrifuge | Hermle | - | - |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | - |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | - |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | - |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | - |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | - |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | - |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | - |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | - |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | - |
| Hemocytometer | Boeco | - | - |
| Lead citrate | ALS | R1209 | - |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | - |
| Orbital shaker | Lasec | - | - |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | - |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | - |
| Rotary shaker | Labcon | - | - |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | - |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | - |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | - |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | - |
| Vacuum dessicator | Lasec | - | - |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | - |
| YNB | Lasec | 239210 | - |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | - |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality? Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , Caister Academic Press. Nottingham. (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. Cryptococcus Neoformans. , ASM Press. Washington D.C. (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , CAB International. Wallington. (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Unit 9, 31 (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L.
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , Department of Minerals and Energy. Pretoria. (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , Garland Science. New York. (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. Inductive reasoning 2.0. , Wiley Interdisciplinary Review: Cognitive Science. e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
