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Methodenartikel

Transiente Expression in rote Beete einen biopharmazeutischen Kandidat Impfstoff für Typ-1-Diabetes

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DOI:

10.3791/59298

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19. März 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, University of Verona

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine mündliche Impfstoffkandidaten gegen Diabetes Typ1 in eine essbare Pflanze produzieren.

Zusammenfassung

Pflanze molekulare Landwirtschaft ist der Einsatz von Anlagen zur Erzeugung von Molekülen von Interesse. Unter diesem Gesichtspunkt können Pflanzen sowohl als Bioreaktoren für die Produktion und die anschliessende Reinigung des Endprodukts und für die direkte mündliche Übergabe heterologen Proteine verwendet werden, wenn essbare Pflanzenarten zu verwenden. In dieser Arbeit präsentieren wir die Entwicklung von einem Kandidaten Schluckimpfung gegen Typ-1-Diabetes (T1D) in essbare Anlagensysteme mit dekonstruierten Pflanze Virus-basierte rekombinanter DNA-Technologie, geliefert mit Vakuum Infiltration. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine rote Beete geeignet Host für die transiente Expression von einem menschlichen abgeleiteten Autoantigen T1D, als ein viel versprechender Kandidat als T1D Impfstoff zugeordnet ist. Blätter produzieren die Autoantigen zeichneten sich gründlich auf ihre Resistenz gegen Magen Verdauung und für das Vorhandensein der bakteriellen Restladung ihre sekundäre metabolischen Profils, geben einen Überblick über die Prozess-Produktion für den möglichen Einsatz von Anlagen zur mündlichen Direktlieferung von einer heterologen Proteinen. Unsere Analyse ergab fast vollständigen Abbau der gefriergetrockneten Kandidat Schluckimpfung nach einer simulierten Magen Verdauung, was darauf hindeutet, dass eine Kapselung-Strategie bei der Herstellung von pflanzlichen GAD Impfstoff erforderlich ist.

Einleitung

Seit der Pflanze Molekularbiologie Revolution in den 1980er Jahren können als Alternative zu herkömmlichen Systemen basierend auf mikrobielle und Säugetier-Zellen1pflanzliche Systeme für die Produktion von Biopharmazeutika betrachtet werden. Pflanzen zeigen mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Plattformen mit Skalierbarkeit, Wirtschaftlichkeit und Sicherheit werden die relevantesten2. Das rekombinante Produkt kann von transformierte Pflanzengewebe gereinigt und dann verabreicht, entweder parenteral oder oral und darüber hinaus kann transformierten essbare Pflanze direkt zur mündlichen Lieferung verwendet werden. Die orale Verabreichung fördert gleichzeitig Schleimhaut und systemische Immunität, und es entfällt die Notwendigkeit für Nadeln und medizinisches Fachpersonal. Darüber hinaus entfällt mündlichen Lieferung die komplexe Weiterverarbeitung, die normalerweise 80 % der gesamten Herstellungskosten eines rekombinanten Proteins3ausmacht. Diese Vorteile können übersetzt werden Einsparungen in der Produktion, Versorgung und Arbeit, die Reduzierung der Kosten für jede Dosis, das Medikament zu einem Großteil der Weltbevölkerung erschwinglich zu machen.

Für die Produktion rekombinanter Proteine in Pflanzen wurden mehrere Strategien, sowohl für stabile Transformation und transiente Expression entwickelt. Unter anderem bietet eine hochverzinsliche dekonstruiert Virus-basierte Ausdruck der Anlage (z. B. MagnICON) überlegenen Leistung, hohe Erträge von rekombinanten Proteinen über relativ kurze Fristen4führt. Viele Beispiele für transiente Expression mit der Virus-basierte Ausdruck der Anlage in Nicotiana Benthamiana Pflanzen werden gemeldet und den Gold-Standard-Produktions-Server. Allerdings gilt diese Modellpflanze nicht als essbaren Arten aufgrund der Alkaloide und andere toxischen Metaboliten, die in den Blättern angesammelt werden.

In dieser Arbeit beschreiben wir den Vergleich zwischen zwei essbare Anlagensysteme, rote Beete (Beta Vulgaris cv Moulin Rouge) und Spinat (Spinacea Oleracea cv Industria), für den Ausdruck von zwei Kandidaten der 65 kDa Isoform von Glutaminsäure Decarboxylase (GAD65), durchgeführt von der Pflanze, die Virus-basierte Vektoren5. GAD65 ist eine große Autoantigen, Typ 1 Diabetes (T1D) zugeordnet und es wird derzeit in klinischen Studien am Menschen zu verhindern oder zu verzögern T1D durch Induktion Toleranz6untersucht. Die Produktion von GAD65 in Pflanzen wurde ausgiebig im Modell Pflanzenarten wie Nicotiana Tabacum und N. Benthamiana4,5,6,7untersucht. Hier beschreiben wir die Verwendung von essbaren Pflanzen für die Herstellung des Moleküls in Geweben, die für eine mündliche Direktfahrt gemeint sein kann. Aus technischer Sicht wir studierten und das System für die Pflanze Agroinfiltration und essbare Pflanze Plattform für GAD65 Produktion durch die Auswertung verschiedener Parameter ausgewählt: die rekombinante Proteinexpression Ebenen, die mikrobielle Restladung im Werk Gewebe für die mündlichen Lieferung, den Widerstand der GAD65, der Magen Verdauung und die Bioäquivalenz der transformierten Pflanzen mit dem Wildtyp.

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Protokoll

1. rote Rüben und Spinat Anbau

  1. Rote Beete wachsen (B. Vulgaris cv Moulin Rouge) und Spinat (S. Oleracea cv Industria) Pflanzen in einer Kammer Wachstum mit 150 µE Lichtintensität, 65 % Relative Luftfeuchtigkeit, 12 h hell/dunkel-Zyklus am 23/21 ° C, beziehungsweise.
  2. Nach der Keimung der Samen Düngen der Pflanzen zweimal wöchentlich mit einer Lösung von 1 g/L von einem handelsüblichen Dünger (Table of Materials). Verwenden Sie für Agroinfiltration fünf Wochen altes Baby Spinat und rote Beete sechs Wochen alten Pflanzen.

(2) transiente Expression durch die dekonstruierten Virus-basierte Anlagentechnik

  1. Bau der Pflanze Expressionsvektoren
    1. Einführung der Vektoren - das 5'-Modul (pICH20111), die 3' Module (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut und pICH7410.eGFP), als zuvor beschriebenen1,2,7vorbereitet und der Integrase-Modul (pICH14011)- in Agrobacterium Tumefaciens GV3101 Belastung verwenden standard-Techniken. Wachsen Sie auf LB-Medium mit 50 μg/mL Rifampicin und entsprechenden Vektor-spezifische Antibiotika (50 μg/mL Carbenicillin für pICH20111, pICH14011 und pICH7410.eGFP), 50 μg/mL Kanamycin für pICH31070 für 2 Tage bei 28 ° C.
    2. Bildschirm der Kolonien von Colony PCR unter Verwendung der folgenden spezifischen Zündkapseln für jeden Vektor: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' und 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3 "für die 3'-Module pICH31070.GAD65mut und pICH31070.∆87G65mut, mit einer annealing-Temperatur von 55 ° C und eine Dehnung mal 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' und 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3 "für die dritte 3' Modul pICH7410.eGFP, mit einer Anlasstemperatur von 53 ° C und einer Dehnung-Zeit von 30 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' und 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3" für das 5'-Modul mit einer Anlasstemperatur von 53 ° C und eine Dehnung von 20 s und 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3' und 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3 "für die Integrase-Modul mit einer Anlasstemperatur von 57 ° C und einer Dehnung Zeit von 45 s.
    3. Durchführung der PCR-Reaktion in einem Gesamtvolumen von 20 μl mit Hilfe der folgenden spezifischen Reaktionszyklus: erste Denaturierung 5 min bei 95 ° C, 35 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 30 s bei der Anlasstemperatur und der Dehnung Schritt bei 72 ° C (Temperatur und Dehnung Glühen eine Re spezifisch für jedes Paar Grundierung) und eine endgültige Dehnung Schritt 7 min bei 72 ° C.
  2. Spritze agroinfiltration
    1. Die drei A. Tumefaciens Transformanten in 50 mL LB Medium mit 50 μg/mL Rifampicin und die folgenden entsprechenden Vektor-spezifische Antibiotika zu impfen: 50 μg/mL Carbenicillin für A. Tumefaciens verwandelt mit pICH20111, pICH14011 oder pICH7410.eGFP oder 50 μg/mL Kanamycin für A. Tumefaciens mit pICH31070 verwandelt. Wachsen Sie durch Schütteln über Nacht bei 28 ° C.
    2. Pellet-Übernachtung Bakterienkulturen durch Zentrifugation bei 4.500 X g für 20 min und Aufschwemmen sie in 100 mL (oder zwei Bände der ersten bakterielle Kultur) der Infiltration Puffer mit 10 mM 4-Morpholineethanesulfonic Säure (MES; pH 5,5) und 10 mM MgSO4, ohne Rücksicht auf die OD600. Inkubieren Sie die Suspensionen bei Raumtemperatur (RT) für 3 h.
    3. Mischen Sie gleiche Volumina von bakteriellen Suspensionen, eines der drei Module, GAD65mut, ∆87GAD65mut oder eGFP 3', 5' Modul und Integrase Modul enthalten. Verwenden Sie die Federung-Mischung für Spritze Infiltration von roten Rüben und Spinat Blätter.
    4. Platz 5 mL der Suspension in einer Spritze ohne Nadel. Drücken Sie die Spitze der Spritze gegen die Unterseite des Blattes für Spinat und rote Beete Pflanzen, und inzwischen wenden Sie einen sanften Gegendruck auf die andere Seite des Blattes.
    5. Die ersten drei komplett erweiterte Blätter ab der Spitze für jede Pflanze zu infiltrieren. Beschriften Sie die Agroinfiltrated Blätter mit einem Papier-Tag auf dem Blattstiel. Die Pflanzen in einer Kammer Wachstum unter Standardbedingungen zurück.
      Hinweis: Aus Gesundheits- und Sicherheitsgründen, tragen Sie Schutzbrille und Handschuhe während Infiltrationsprozess.
    6. Sammle Agroinfiltrated Blätter von 4 bis 14 Tage nach Infektion (dpi) und Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Store Pflanzengewebe bei-80 ° C.
  3. Vakuum agroinfiltration
    1. Wachsen Sie einzeln die drei A. Tumefaciens Transformanten in 50 mL LB-Medium mit 50 μg/mL Rifampicin und entsprechenden Vektor-spezifische Antibiotika durch Schütteln über Nacht bei 28 ° C.
    2. Pellet über Nacht Bakterienkulturen durch Zentrifugation bei 4.500 X g für 20 min. Aufschwemmen das Pellet in 1 L des Infiltration-Puffer auf eine OD600 von 0,35 und inkubieren Sie die Aufhängungen bei RT für 3 h.
    3. Jede Aussetzung 0,01 % V/V des Waschmittels (Polysorbat 20) hinzufügen. Mischen Sie gleiche Volumina von bakteriellen Suspensionen, eines der drei Module, GAD65mut, ∆87GAD65mut oder eGFP 3', 5' Modul und Integrase Modul enthalten.
    4. Legen Sie eine Pflanze (sechs Wochen alte rote Beete zu Pflanzen, siehe Abschnitt 1) in der Halterung. Invertieren des Inhabers und legen auf einen Becher mit der Infiltration Bad (2 L), die Blätter in der Infiltration Suspension eintauchen.
      Hinweis: Sicherstellen Sie, dass alle Blätter in der Bakteriensuspension vollständig eingetaucht sind. Das Niveau mit dem Zusatz von zusätzlichen Infiltration Federung, bei Bedarf.
    5. Übertragen der Infiltration Bad mit dem untergetauchten Werk zur Infiltration Kammer und schließen Sie es. Schalten Sie die Vakuumpumpe und öffnen Sie das Vakuum Einlassventil auf die Infiltration Kammer zu.
    6. Sobald der Druck in der Kammer Infiltration bis 90 Mbar reduziert hat, halten dem Vakuum für 3 min. Release das Vakuum für 45 s. Sobald die Infiltration Kammer auf den atmosphärischen Druck zurückgekehrt ist, öffnen Sie die Kammer und entfernen Sie die infiltrierte Pflanze aus dem bakteriellen Bad.
    7. Die Pflanzen in einer Kammer Wachstum unter Standardbedingungen zurück.
    8. Agroinfiltrated Blätter mit der maximalen Ausdruck dpi, je nach das rekombinante Protein zu sammeln und Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Store Pflanzengewebe bei-80 ° C.

(3) rekombinante Protein Expressionsanalyse

  1. Insgesamt lösliche Protein (TSP) Extraktion
    1. Schleifen Sie die Spritze oder Vakuum infiltriert rote Rüben und Spinat Blätter, gesammelt in den Schritten 2.2.6 und 2.3.8, zu feinen Pulver in flüssigem Stickstoff mit Mörser und Stößel. Übertragen Sie das Pulver in 15 mL-Kunststoff-Rohre und speichern Sie das Material bei-80 ° C.
    2. 300 mg Blattpulver 900 µL Extraktionspuffer (50 mM Natriumphosphat pH 8.0, 20 mM Natrium Metabisulphite) hinzufügen.
      Hinweis: Die gewählte Verhältnis zwischen pflanzlichen Gewebe Gewicht (mg), Puffervolumen (µL) ist 1:3.
    3. Die Mischung durch Vortexen für 1 min zu homogenisieren, dann Zentrifugieren bei 30.000 X g für 40 min bei 4 ° C.
    4. Sammeln Sie den Überstand in ein sauberes Röhrchen und speichern Sie es bei-80 ° C.
  2. EGFP Anlagenvisualisierung und Quantifizierung
    1. Laden Sie 100 µL der einzelnen TSP-Extrakt aus eGFP Blätter in drei technischen Wiederholungen auf einer 96-Well-Platte zum Ausdruck zu bringen.
    2. Die 96-Well-Platte in ein Fluoreszenz-Leser und starten Sie die Messung. Verwenden Sie die 485/535 nm Filtersatz für eGFP Fluoreszenz-Detektion erforderlich.
    3. Für die absolute Quantifizierung in der gleichen Platte vorbereiten einer Kalibrationskurve laden verschiedene Mengen (62,5, 125, 500, 750 und 1000 ng) der gereinigten eGFP.
  3. Bicinchoninic Säure (BCA) Assay für TSP Quantifizierung
    1. 50 Teile des Reagenz A (Table of Materials) mit 1 Teil des Reagenz B (Table of Materials) mischen. Die Proben untersucht werden und die Kalibrierstandards bereiten Sie ausreichendes Volumen an frischer BCA Tanklösung vor.
      Hinweis: Die Lautstärke des BCA funktionierende Lösung für jede Probe erforderlich ist 1,9 mL. Für das Standardverfahren mit 9 Normen (einschließlich Leerzeichen) ist 17,1 mL BCA Arbeitslösung erforderlich.
    2. Pipette 0,1 mL jedes Standard (einschließlich Leerzeichen) und TSP-Extrakte in eine beschriftete Röhrchen.
      Hinweis: Als Kalibrierstandards, bereiten eine neue Reihe von Rinderserumalbumin (BSA) Normen im 10-1.000 μg/mL-Bereich, vorzugsweise mit dem gleichen Verdünnungsmittel als Proben, wie Wasser. Der Blank besteht aus 0,1 mL das Verdünnungsmittel für Kalibrierstandard und Probenvorbereitung verwendet.
    3. 1,9 mL BCA Arbeitslösung und mischen Sie gründlich. Die Röhren zu decken und bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
    4. Cool die Rohre nach RT. Maß der Extinktion bei 562 nm aller Proben innerhalb von 10 Minuten.
      Hinweis: Auch bei RT weiter die Farbentwicklung. Keine signifikanten Fehler soll eingeführt werden, wenn die Extinktion Messungen alle Rohre innerhalb von 10 min fertig sind.
    5. Subtrahieren Sie den 562 nm Absorption Wert des Rohlings aus den Lesungen des Standards und der TSP-Extrakte.
    6. Handlung der Blank-korrigierte 562 nm Lektüre für jeden Standard auf seine Konzentration. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration jede TSP-Extrakt.
  4. Führen Sie wie zuvor beschrieben in Gecchele Et Al.8Färbung Coomassie-Gel.
  5. Western-Blot Analyse
    1. Führen Sie die western-Blot Analyse in Gecchele Et Al.8wie oben beschrieben.
    2. Übertragen Sie nach der elektrophoretischen Trennung von Proteinen sie auf eine Nitrocellulose-Membran mit standard-Techniken. Bereiten Sie die blockierende Lösung durch Mischen von 4 % Milch Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7.4. Blockieren Sie die Membran mit 10 mL der blockierenden Lösung bei RT für 1 h.
    3. Bereiten Sie die Kaninchen Primärantikörper bei 1: 10.000 für die Anti-GAD65/67 und Anti-LHCB2, und bei 1: 20.000 für die Anti-eGFP in 5 mL blockierende Lösung mit 0,1 % Waschmittel. Inkubieren Sie die Membran mit den vorbereiteten Primärantikörper Lösungen über Nacht bei 4 ° C oder 4 h bei RT mit ständiger Bewegung.
    4. Entsorgen Sie den primären Antikörper und waschen Sie die Membran 3 Mal für 5 min mit blockierenden Lösung mit 0,1 % Waschmittel.
    5. Bereiten Sie den Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierte Anti-Kaninchen-Antikörper bei 1: 10.000 in blocking-Lösung mit 0,1 % Waschmittel. Inkubieren Sie die Membran für 1,5 h bei RT mit ständiger Bewegung.
    6. Verwerfen Sie der Sekundärantikörper und waschen Sie die Membran 5 Mal für 5 min mit PBS-T (PBS ergänzt mit 0,1 % Waschmittel).
    7. Inkubieren Sie die Membran mit einer handelsüblichen Luminol-Lösung nach den Anweisungen des Herstellers. Erkennen Sie das Signal mit Hilfe eines Chemilumineszenz imaging Systems.

4. Anlage Materialbearbeitung

  1. Ernte die Vakuum Agroinfiltrated ∆87GAD65mut exprimierenden rote Rübe Blätter an der Spitze der Ausdruck (11 dpi) und Einfrieren in flüssigem Stickstoff.
  2. Lyophilize die gefrorenen Blätter für 72 h bei-50 ° C und 0,04 Mbar. Speichern sie bei-80 ° C.
  3. Mahlen Sie die Blätter zu feinen Pulver und bewahren sie bei RT in einem verschlossenen Behälter mit Kieselgel, die Feuchtigkeit auszuschließen.

5. Magen Verdauung Simulation und Zelle Integritätsanalyse

  1. Magen Verdauung simulation
    1. 100 mg geschliffen Gefriergetrocknete Rote Rübe Blätter wiegen und in 6 mL PBS (pH 7,4) aufzuwirbeln.
    2. Stellen Sie den pH-Wert der Probe 2 mit 6 M HCl.
    3. Fügen Sie 4 mg/mL Pepsin aus Schweinen Magenschleimhaut in 10 mM HCl, eine endgültige Pepsin-Konzentration von 1 mg/mL oder ein Verhältnis von 01:20, insgesamt lösliche Proteine zu erhalten. Schütteln Sie die Probe bei 37 ° C für 120 min.
    4. Passen Sie die Proben bis pH 8 mit 1 M NaOH, das Pepsin zu inaktivieren.
    5. Zentrifugieren Sie 750 µL-Aliquots jeder Probe bei 20.000 X g für 20 min bei 4 ° C. Überstand getrennt zu sammeln und das Pellet in einem Überstand Band der Ladepuffer Aufschwemmen (1,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 3 % SDS, 15 % Glycerin und 4 % 2-Mercaptoethanol).
      Hinweis: Aus Gesundheits- und Sicherheitsgründen, Handschuhe tragen und arbeiten unter Abzug für die Probenvorbereitung.
    6. Der Überstand und die resuspendierte Pellet durch western-Blot Analyse8zu analysieren.
  2. Zellanalyse Integrität
    1. Bereiten Sie zwei Proben von 100 mg geschliffen Gefriergetrocknete Rote-Bete-Blätter und Aufschwemmen Sie sowohl in 6 mL PBS (pH 7,4).
    2. Stellen Sie den pH-Wert des nur eine Probe bis 2 mit 6 M HCl. Schütteln beide Proben bei 37 ° C für 120 min.
    3. Zentrifugieren Sie 750 µL-Aliquots jeder Probe bei 20.000 X g für 20 min bei 4 ° C. Überstand getrennt zu sammeln und das Pellet in einem Überstand Band der Ladepuffer Aufschwemmen.
    4. Der Überstand und die resuspendierte Pellet durch western-Blot Analyse analysieren.

6. die Keimbelastung assay

  1. Wiegen Sie 100 mg Gefriergetrocknete Rote Rübe Blätter. Das Pulver in 8 mL sterilem PBS (pH 7,4) und Vortex für 1 min aufzuwirbeln.
  2. Bereiten Sie die LB-Medium ohne Antibiotika oder (i) 50 µg/mL Rifampicin, (Ii) 50 µg/mL von Rifampicin und Carbenicillin, (Iii) 50 µg/mL von Rifampicin und Kanamycin oder (iv) 50 µg/mL von Rifampicin, Carbenicillin und Kanamycin enthält.
  3. Platte 1 mL jedes gefriergetrocknete Blatt Homogenat in eines der 5 Selektivmedien LB.
  4. Inkubieren Sie alle Teller für 3 Tage bei 28 ° c
  5. Zählen Sie die Agrobacterium Kolonien gewachsen auf jeder Platte.
  6. Berechnen Sie und definieren Sie die bakterielle Restladung als die Anzahl der Kolonie bildende Einheiten (KBE) pro mL gefriergetrocknete Blatt Homogenat (KBE/mL).

(7) Metabolit Extraktion

  1. Primäre Metabolit Extraktion
    1. Wiegen Sie 30 mg von-80 ° C gelagert, Vakuum-Agroinfiltrated ∆87GAD65mut exprimierenden rote-Bete-Blattpulver in 2 mL Kunststoffhülse.
    2. Fügen Sie 750 µL kalter 70/30 (V/V) Methanol/Chloroform und Vortex für 30 S. Inkubation bei-20 ° C für 2 h.
      Hinweis: Alle Lösungsmittel und Zusatzstoffe müssen LC-MS-Klasse sein.
    3. Fügen Sie 600 µL von kaltem Wasser und Zentrifuge bei 17.900 X g bei 4 ° C für 10 min. sammeln und Transfer der oberen wässrige Phase in eine neue 2-mL-Tube. Entsorgen Sie die untere chloroformic Phase und der Interphase.
    4. Setzen Sie die Proben in einem Vakuum Konzentrator für 3 h die Lösungsmittel verdunsten.
    5. Das Pellet gewonnenen Schritt 7.1.4 in 300 µL 50/50 (V/V) Acetonitril/Wasser auflösen und die Proben 3 min beschallen.
    6. Die Lösungen durch 0,2 μm-Membranfilter und steckte sie in eine transparente feste 300 µL einfügen Glasröhren.
  2. Sekundären Metaboliten Extraktion
    1. Wiegen Sie 300 mg von-80 ° C gelagert, Vakuum-Agroinfiltrated ∆87GAD65mut exprimierenden rote-Bete-Blattpulver in 15 mL Kunststoffhülse.
    2. Geben Sie 3 mL Methanol, Wirbel für 30 s, und bei 40 kHz für 15 min beschallen.
      Hinweis: Alle Lösungsmittel und Zusatzstoffe müssen LC-MS-Klasse sein.
    3. Zentrifugieren Sie die Proben bei 4.500 X g bei 4 ° C für 10 min und übertragen Sie die Überstände in neue 15 mL-Tuben.
    4. Verdünnte 100 µL 1:3 (V/V) mit Wasser zu extrahieren und die Lösung durch ein 0,2 μm-Membranfilter.
    5. Setzen Sie die Lösung in eine transparente feste Glasrohr 300 µL einfügen.
  3. Polare Lipid-Extraktion
    1. Wiegen Sie 200 mg von-80 ° C gelagert, Vakuum-Agroinfiltrated ∆87GAD65mut exprimierenden rote-Bete-Blattpulver in 15 mL Kunststoffhülse.
    2. Fügen Sie 200 µL Wasser und dann 2 mL Methanol, und dann auf Eis für 1 h halten.
      Hinweis: Alle Lösungsmittel und Zusatzstoffe müssen LC-MS-Klasse sein.
    3. Wirbel für 30 s und bei 40 kHz für 15 min beschallen.
    4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 4.500 X g bei 4 ° C für 25 min. sammeln und Transfer der Chloroform-Phase in 2 mL Röhrchen. Entsorgen Sie die obere wässrige Phase und der Interphase.
    5. Setzen Sie die Proben in einem Vakuum Konzentrator für 3 h das Lösungsmittel verdunstet.
    6. Lösen Sie die Pellets aus Schritt 7.3.5 mit 600 µL Methanol gewonnen.
    7. Verdünnte 100 µL 1:5 (V/V) mit Methanol extrahiert und ein 0,2-μm-Membranfilter die Lösung durchlaufen.
    8. Setzen Sie die Lösung in eine transparente feste Glasrohr 300 µL einfügen.

8. Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie Analyse und Datenverarbeitung

  1. Das LC-MS-System richten Sie ein, wie durch den Lieferanten empfohlen.
    Hinweis: Die LC-Abschnitt besteht aus einem Autosampler mit HPLC, ausgestattet mit einer C18 Vorsäule (75 x 2,1 mm, Partikel Größe 5 µm) vor eine C18-Säule (150 x 2,1 mm, Partikel Größe 3 µm) für die Analyse von Sekundärmetaboliten und polaren Lipide gekoppelt , während mit einem HILIC Vorsäule (7,5 x 2,1 mm, 3 µm) vor einer HILIC-Spalte (150 x 2,1 mm, Partikel Größe 2,7 µm). Die MS ist eine Ionenfallen-Massenspektrometer mit einer Elektrospray-Ionisation (ESI) oder ein Atmosphärendruck-chemische Ionisation (APCI)-Quellen zur Verfügung gestellt.
  2. Bereiten Sie die geeignete Lösungsmittel für die HPLC-Gradienten. Verwenden Sie für die primäre Metabolit Analyse 20 mM Ammonium-Formiat als Lösungsmittel A; 95 % Acetonitril, 5 % Wasser plus 10 mM Ammonium-Formiat als Lösungsmittel B. Verwenden Sie für die sekundären Metaboliten Analyse Wasser plus 0,05 % Ameisensäure (A) und Acetonitril plus 0,05 % Ameisensäure (B). Verwenden Sie für polare Lipid-Analyse Wasser plus 0,05 % Ameisensäure (A) und 100 % Acetonitril (B).
    Hinweis: Die Lösungsmittel und Zusatzstoffe müssen LC-MS-Klasse sein.
  3. Verwenden Sie die Steigungen, die in Tabelle 1 für Metabolit Elution gemeldet. Satz der Durchflussmenge bei 0,2 mL/min injizieren 10 µL jeder Probe für sekundäre Pflanzenstoffe und polaren Lipide, während Spritzen 5 µL für Hauptmetaboliten.
  4. Bereiten Sie eine Qualitätskontrolle (QC) Probe durch das Mischen von gleicher Teilen der verschiedenen Proben eine repräsentative Mischung aus einzelnen experimentellen Bedingungen haben. Analysieren Sie die QC-Probe während des Experiments Instrument Effizienz überwachen. Speziell, fügen Sie ein QC-Probenanalyse nach jeder 10 Probe-Charge.
  5. Zufällig die Proben um Instrument-gesteuerte Effekte zu vermeiden.
  6. Nach 9 Analysen, fügen Sie eine Spalte Reinigung Methode und eine leere Analyse sofort nach.
    Hinweis: Führen Sie einen langsamen Verlauf zwischen den beiden Lösungsmittel mit einer isokratischen Elution bei hohen Anteil an das stärkste Lösungsmittel. Der Blank besteht aus einer Injektion von reinem Methanol: Wasser (50/50, V/V) Retention Time Reproduzierbarkeit in der folgenden Analyse zu verbessern.
  7. Richten Sie das Instrument Massenspektren in Alternative positive und negative Ionisierung Modi verwenden die in Tabelle 2aufgeführten Parameter zu erwerben.
    Hinweis: Andere Parameter hängen von der spezifischen Plattform.
  8. Führen Sie die nächsten Datenverarbeitung wie Dal Santo Et Al.9erläutert.

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Ergebnisse

In dieser Arbeit wird der Workflow für die Entwicklung einer Schluckimpfung in essbare Pflanzengeweben vorgestellt. Der Schwerpunkt dieser Arbeit ist der Ausdruck ein Zielprotein in einer essbaren Host Pflanzenarten und die Charakterisierung der potenziellen Schluckimpfung.

Der erste Schritt bestand die Bewertung der Eignung von Virus-basierte Ausdruck Anlagentechnik, rekombinante Proteine in essbare Anlagen zu produzieren. Zu d...

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Diskussion

In dieser Studie haben wir vorläufige Analyse für die Gestaltung der ein Kandidat Schluckimpfung für autoimmune Diabetes gezeigt. Das Zielprotein für dieses Experiment war eine mutierte Form des menschlichen 65 kDa Glutamat-Decarboxylase, welche Produktion und Funktionalität sind leicht nachweisbar und messbar12. Ihren Ausdruck in verschiedenen essbaren Pflanzengeweben wurde durch die Vektoren5, vermittelt die vermitteln eines hohen Maß an rekombinanten Proteinproduktion in...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das gemeinsame Projekt "Die Verwendung von Pflanzen zur Herstellung von essbaren Impfstoff eine autoimmune Diabetes (eDIVA)" (Projekt-ID: 891854) von der Universität von Verona im Rahmen des Aufrufs 2014 finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2-μmu; m Minisart RC4 MembranfilterSartorius-Stedim17764
2– MercaptoethanolSigmaM3148Giftig; 4 % zur Herstellung eines Ladepuffers mit Glycerin, SDS und Tris-HCl
4-Morpholineethansulfonsäure (MES)SigmaM8250pH 5,5
96-Well-PlatteSarstedt833924
EssigsäureSigma27221Korrosives
Acetonitril LC-MS-QualitätSigma34967
AcetosyringonSigmaD134406Toxisch – 0,1 M Vorrat an DMSO-Agar
Bakteriologischer QualitätApplichemA094915 g/L zur Herstellung von LB-Medium (pH 7,5 mit NaOH) mit Hefeextrakt, NaCl und Trypton-Ammoniumformiat
Sigma70221
Anti-eGFP-AntikörperABCamab290
Anti-GAD 65/67 AntikörperSigmaG5163
Anti-LHCB2-AntikörperAgriseraAS01 003
Brilliant Blue R-250SigmaB7920
C18 SäuleGrace    -Alltima HP C18 (150 mm x 2,1 mm; 3 μ m) Spalte
C18 SchutzkolonneGrace    -Alltima HP C18 (7,5 mm x 2,1 mm; 5 μ m) Wache  Kolumne
CalMag GrowerPeter Excel15-5-15Düngemittel
Carbenicillin DinatriumDuchefa BiochemieC0109Toxisches
Chemilumineszenz-BildgebungssystemBioRad1708370ChemiDoc Touch Imaging System
ChloroformSigmaC2432
ReinigungsmittelSigmaP5927Polysorbat 20
Fluoreszenz-LesegerätPerkin-Elmer  1420-011VICTOR Multilabel Gegen-Ameisensäure
LC-MS QualitätSigma94318
GlycerinSigmaG551615 % zur Herstellung von Ladepuffern mit Tris-HCl, SDS und 2– Mercaptoethanol
GoTaq G2 PolymerasePromegaM7841
HClSigmaH1758Korrosive
HILIC-SäuleGrace    -Ascentis Express HILIC (150 mm x 2,1 mm; Partikelgröße 2,7 μ m) Säule
HILIC SchutzsäuleGrace    -Vision HT HILIC (7,5 mm x 2,1 mm; 3 μ m) Wache  Säule
Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierter Anti-Kaninchen-AntikörperSigmaA6154zu oft einfrieren/auftauen
HPLC-AutosamplerBeckman Coulter    -System Gold 508 Autosampler
HPLC SystemBeckman Coulter    -System Gold 128 Solvent Module HPLC
IsopropanolSigma24137Flambable
Kanamycinsulfate SigmaK4000Toxic
KClSigmaP95412 g/L mit NaCl , Na2HPO4 und KH2PO4 zur Herstellung von PBS
KH2PO4 SigmaP97912,4 g/L mit NaCl , Na2HPO4 und KCl zur Herstellung von PBS
Loading Buffer
Luminol-LösungGe HealthcareRPN2232Bereiten Sie die Lösung mit dem kommerziellen Kit ECL Prime Western Blotting System
Lyophilisator5PascalLIO5P0000DGT
MassenspektrometerBruker -Bruker Esquire 6000; das Massenspektrometer war mit einer ESI-Quelle ausgestattet und der Analysator war eine Ionenfalle
MethanolSigma32213
MgSO4SigmaM7506
MilchblocklösungRistora   -3 % in PBS
Na2HPO4SigmaS7907Verwendung mit NaH2PO4 zur Herstellung von Natriumphospatpuffer
NaClSigmaS301480 g/L mit KCl, Na2HPO4 und KH2PO4 zur Herstellung von PBS; 10 g/L zur Herstellung von LB-Medium (pH 7,5 mit NaOH) mit Hefeextrakt, Trypton und Agar bakteriologische Qualität
NaH2PO4SigmaS8282  Verwendung mit Na2HPO4 zur Herstellung von Natriumphospat-Puffer; 14,4 g/L zur Herstellung von PBS
NaOHSigmaS8045
Nitrocellulase-MembranGe Healthcare10600002
Pepsin aus der Magenschleimhaut des SchweinsSigmaP7000
Peroxidase-Substrat ECLGE HealthcareRPN2235Lichtempfindliches Material
Pumpe VakuumpresseVWR111400000098
Reagenz ASigmaB9643Verwenden Sie 50 Teile dieses Reagenzes mit 1 Teil Reagenz B zur Herstellung von BCA-Arbeitslösung
Reagenz BSigmaB9643Verwenden Sie 1 Teil dieses Reagenzes mit 50 Teilen von Reagenz A zur Herstellung von BCA-Arbeitslösung
RifampicinDuchefa BiochemieR0146Toxisch – 25 mg/ml Stamm in DMSO
SDS (Natriumdodecylsulfat)SigmaL3771Brennbar, giftig, korrosiv - 10 % Lagerbestand; 3 % zur Herstellung eines Ladepuffers mit Tris-HCl, Glycerin und 2– mercaptoethanol
NatriummetabisulfitSigma7681-57-4
Sonicator systemSoltec090.003.0003Sonica® 2200 MH; Frequenz 40 khz
SpritzeTerumo    -
Transparent fest 300-& micro; L Einsatz GlasröhrchenThermo Scientific11573680
Trizma BaseSigmaT1503Stellen Sie den pH-Wert mit 1N HCl ein, um Tris-HCl-Puffer herzustellen, verwenden Sie 1,5M Tris-HCl (pH 6,8), um einen Ladepuffer mit SDS, Glycerin und 2– Mercaptoethanol
TryptonFormediumTRP0310 g/L zur Herstellung von LB-Medium (pH 7,5 mit NaOH) mit Hefeextrakt, NaCl und Agar Bakteriologischer
VakuumkonzentratorHeto3878 F1-3Speed-vac System
Wasser LC-MS KlasseSigma39253
HefeextraktSigmaY13335 g/L zur Herstellung von LB-Medium (pH 7,5 mit NaOH) mit Trypton, NaCl und Agar Bakteriologische Qualität
Nicht vor

Referenzen

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