Summary
Denne protokol demonstrerer metoder til en musemodel af åben-kraniet traumatisk hjerneskade og transplantation af dyrkede menneskeskabte pluripotente stamcelle-afledte celler i skadestedet. Adfærdsmæssige og histologiske tests af resultaterne fra disse procedurer er også beskrevet i korte træk.
Abstract
Traumatisk hjerneskade (TBI) er en førende årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan. Sygdoms patologi på grund af TBI skrider frem fra den primære mekaniske fornærmelse mod sekundære skade processer, herunder apoptose og inflammation. Dyre modellering har været værdifuld i søgningen til at afdække skade mekanismer og evaluere potentielle neuroprotektive terapier. Denne protokol beskriver den kontrollerede kortikale virkning (CCI) model af fokal, Open-Head TBI. Specifikt er parametre for fremstilling af en mild ensidig kortikal skade beskrevet. Adfærdsmæssige konsekvenser af CCI analyseres ved hjælp af tape fjernelse test af bilateral sensorimotor integration. Med hensyn til eksperimentel behandling for TBI-patologi illustrerer denne protokol også en proces til transplantation af dyrkede celler i hjernen. Neurale cellekulturer afledt af menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSCs) blev valgt for deres potentiale til at vise overlegen funktionel restaurering hos humane TBI-patienter. Kronisk overlevelse af hiPSCs i værten mus hjernevæv detekteres ved hjælp af en modificeret DAB immunohistokemiske proces.
Introduction
Traumatisk hjerneskade (TBI) er en generel betegnelse for den erhvervede skade på hjernen på grund af enten indirekte mekaniske kræfter (rotations acceleration/deceleration eller kontra kup) fra slag til hovedet eller direkte skader fra genstande eller blast bølger. TBI er blevet anslået til at være årsag til omkring 9% af verdensomspændende dødsfald og observeret i en anslået 50.000.000 tilfælde pr. år1,2. En 2017 rapport fra centre for Disease Control og forebyggelse anslås, at i 2013, der var i alt 2.800.000 hospitalsbesøg og dødsfald på grund af TBI i USA3. Mange mildere TBIs gå urapporteret hvert år. Alvorlig TBI kan føre til livslang svækkelse af kognition, motorisk funktion, og generelle livskvalitet. Konsekvenserne af mild TBI, især gentagne sport-relaterede TBI, har været først for nylig værdsat for deres snigende sundhedsmæssige effekter4,5.
Præklinisk modellering er en vital komponent i udviklingen af ny mekanistisk indsigt og potentiel genoprettende terapi for TBI. Den kontrollerede kortikale effekt (CCI) model af TBI er en Open-Head model af mekanisk kontusion skade på cortex. Effektparametrene kan ændres til at producere CCI-skader, der spænder fra mild til svær6. CCI skader er fokale snarere end diffuse, som det ses med andre lukkede hovedmodeller af TBI. CCI kan udføres for at fremkalde en ensidig skade, således at den kontralaterale cortex kan tjene som en intern Komparator. Denne protokol viser egenskaberne ved en mild CCI til en del af cortex, der omfatter primære somatosensoriske og motoriske regioner. Dette kortikale område blev valgt for sit engagement i sensorimotor adfærd, som mange adfærd tests kan afsløre skade-induceret underskud7. Adfærdsmæssige forbedringer på grund af terapeutiske interventioner for TBI kan påvises, samt.
Et kendetegn for TBI er udbredt neurale dysfunktion i den skadede region. Sårede neuroner undergår celledød, og neuronal netværksforbindelse afbrydes8,9. TBI forstyrrer rekruttering af endogene stamceller, hvilket fører til yderligere downstream adfærd underskud10,11. Transplantation af neurale stamceller og stamcelle-afledte celler er blevet udforsket som en mulighed for at genoprette funktionen i den skadede hjerne. Ud over potentialet til at genoprette beskadigede neurale kredsløb, transplanterede celler udøve paracrine effekter, der fremmer neuronal overlevelse og funktionelle opsving fra TBI12. En række forskellige celletyper er blevet transplanteret præklinisk at evaluere deres genoprettende potentiale i modeller af neurologiske lidelser13,14,15. Den nylige popularisering af inducerede pluripotente stamcelleteknologi16 har lettet udviklingen af talrige humane stamcellelinjer til eksperimentel brug. Prækliniske test med hiPSC-afledte celler er et vigtigt første skridt til at karakterisere en given celle linjens potentielle terapeutiske virkning mod sygdomme hos mennesker. Dette laboratorium har udviklet protokoller for at differentiere hipscs til neurale fænotyper17 i forfølgelsen af planteres celler til støtte opsving fra traumatisk hjerneskade.
Eksperimenter i denne protokol bruger en ensidig CCI til at inducere TBI til venstre somatosensorisk og motorisk cortex af voksne mus. En mild CCI skade resulterer i en vedvarende funktionelle underskud i højre brystben, der bruges til at spore virkningerne af hipsc-afledte neurale celle engraftment på funktionelle opsving. Forepaw sensorimotor test i denne protokol blev tilpasset fra den metode, der blev fastlagt af Bouet og kolleger18 og demonstreret tidligere af Fleming og kolleger19. Denne protokol skitserer en komplet workflow for at udføre en eksperimentel hjerneskade, terapeutisk transplantation af hofter celler, og adfærdsmæssige og histologisk analyse af eksperimentelle udfald foranstaltninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter, der er beskrevet i denne protokol, er blevet gennemgået og godkendt af det uniformerede service Universitets udvalg for dyrepasning og-brug.
1. craniektomi og kontrolleret kortikal virkning
- Forberedelse af den kontrollerede kortikale effekt enhed og kirurgiske forsyninger.
- Ilæg en 1 mL glide spids sprøjte med 0,5 mL steril saltvand til sårvanding. Fastgør en 25 G nål til sprøjten for at kontrollere kunstvanding.
- Klargør en fortyndet opløsning af CsA i DMSO til den endelige koncentration på 1 mg/mL. Ilæg en anden 1 mL glide spids sprøjte med 0,5 mL Cyclosporin A (CsA)-opløsning til immunsuppression. Fastgør en 25 G nål eller større til CsA-sprøjten.
- Fastgør det kontrollerede kortikale slag stempel til en arm på en stereotaxisk ramme og sat til en vinkel på 15 °. Fastgør en 3 mm slaglegeme sonde til stemplet.
- Indstil virknings hastigheden til 1,5 m/s og indstignings tiden til 0,1 s for at give en mild kortikal skade.
- Udfør en ensidig craniectomy
- Placer musen i en anæstesi induktion kammer forbundet til en isofluran vaporizer med komprimeret ilt kilde. Inducere anæstesi med ~ 3% isofluran ved ~ 0,7 L/min ilt. Check for dybden af anæstesi ved manglende reaktion på tåen knivspids.
- Barberer hovedbunden ved hjælp af elektriske Clippers og tørre væk enhver løs pels.
- Placer musen i en stereotaxisk ramme med vedhæftet bedøvelse levering næse kegle.
- Placer en opvarmnings pude indstillet til 37 °C på den stereo taxiske ramme under musen for at opretholde kropstemperaturen under anæstesi. Fastgør hovedet på plads med øre barer og en bid bar og orientere hovedet sådan, at kraniet frontal benet er vandret. Vedligehold anæstesi på ~ 1.5%-2% isofluran for varigheden af operationen.
- For at udføre præoperativ pleje og aseptisk kirurgisk præparat, anvende antibiotika oftalmologiske salve til øjnene ved hjælp af en steril vatpind. Anvende en jod-baseret løsning på den barberede Hovedbunds område. Fjern dette med 70% ethanol. Dæk dyret med en fenestreret kirurgisk drapere, så toppen af hovedet er synlig, men øjnene er dækket.
- Lav en midterlinje indsnit (1,5-2 cm) på hovedbunden ved hjælp af en skalpel eller saks. Brug sterile vatpinde til at rense såret og rydde fascia til venstre for midterlinjen ved bregma.
- Brug slag-sonden til at identificere craniectomy-stedet.
- Indstil det stereotaxiske referencepunkt (X = 0, Y = 0) til bregma. Juster sonden sidelæns til 2 mm til venstre for midterlinjen. Omrids en cirkel med en diameter på 5 mm rundt om sonden med en kirurgisk sikker markør med fin spids. Løft og drej slaganordningen ud af positionen.
- Brug den høje hastighed roterende mikromotor kit håndværktøj til at gøre et åbent hul i kraniet ved hjælp af en round-tip 0,6 mm eller 0,8 mm Burr bore bit på ~ 70%-80% maksimal hastighed. Påfør let tryk på kraniet, mens du borer langs den 5 mm circumferentielle kontur for at tynde denne grænse.
- Anvend ikke overskydende tryk under boring. Dette kan forårsage kortikale skader på grund af vibrationer, komprimering, eller utilsigtet penetration. Tillad bore bitets hastighed til at udføre arbejdet.
- Du må ikke bore i et givet sted for længe for at undgå overskydende friktion opvarmning af kraniet. Skyl craniektomi lejlighedsvis med steril saltvand for at fjerne snavs og reducere opvarmning fra rotationsværktøjet.
- Vær meget opmærksom, mens du borer over den koronale sutur linje, da disse punkter er sårbar over for blødning.
- Brug et par fine pincet til at fjerne kraniet, når kranie kappen er tilstrækkeligt udtyndet. Tag fat i flappen, og løft og træk forsigtigt sideværts med en radial bevægelse.
- Du må ikke beskadige dura mater, når du løfter klappen; Dette kan forårsage alvorlig skade og blødning.
- Udfør en mild kontrolleret kortikale kollisionsskade
- Rengør slag-sonden med en steril sprit forberedelses pude. Flyt slaglegemets sonde tilbage på plads over den udsatte cortex. Sænk sonden, indtil den rører ved dura mater-overfladen. Marker denne position som Z = 0.
- Træk stemplet ud, og Flyt til Z =-1,0 mm. aflade stemplet for at påvirke cortex.
- Løft hurtigt stemplet og Flyt armen ud af position. Anvende generøse mængder af saltvand til at vande cortex efter skade. Skyl operationsstedet med saltvand efter behov, og sutur hovedbunden indsnit ved hjælp af simple afbrudt masker med 5,0 silke sutur.
- Udføre postoperative pleje på musen
- Seponér anæstesi. Lever CsA ved subkutan injektion i Scruff ved 10 mg/kg dosis. Placer musen i en ren og præ-varmet postoperative bur.
- Give acetaminophen analgetikum i drikkevandet ved 1,0 mg/mL.
Bemærk: Giv analgesi i henhold til den relevante IACUC-standard driftsprocedure og under hensyntagen til eksperimentelle resultatvariabler (f. eks. sedation, neuroinflammation). - Give fugtet Chow mad i en opvarmet Recovery bur til støtte i rehydrering og nyttiggørelse.
- Fortsæt fra afsnit 2 til afsnit 4 ovenfor, når du udfører craniectomy-only (Sham) kontrol.
2. stereotaxisk transplantation af cellesuspension
- Begynd celle transplantations proceduren ca. 24 timer efter kraniektomi.
- Forbered celle transplantations udstyr og kirurgiske forsyninger
- Fyld en 1 mL glide spids sprøjte med steril saltvand til sårvanding. Fastgør en 25 G nål til sprøjten for at kontrollere kunstvanding.
- Fyld en 1 mL slip-tip-sprøjte med CsA-opløsning til immunsuppression. Fastgør en 25 G nål eller større til CsA-sprøjten. Fyld CsA-sprøjten efter behov mellem operationer.
- Forbered glas nåle fra 1,0 mm OD borosilicat glas kapillar pipetter ved hjælp af standardmetoder.
- Brug fine pincet til at bryde nåle spidserne til ca. 200 μm diameter. Sørg for, at nålens cylindriske aksel ikke er længere end 2,5 cm.
- Kalibrer sprøjtepumpen til brug med en 10 μL sprøjte. Angiv en strømningshastighed på 0,2 μL/min for at levere et samlet volumen på 2,0 μL.
- Forbered menneskelig induceret pluripotente stamcelle (iPSC) suspension.
- Udfør al celle håndtering i en cellekultur BSL-2 Hood ved hjælp af standard sterile håndteringsteknikker.
- Forbered cellekulturer på forhånd i henhold til de standardbetingelser, der er defineret for celle typen. Se Lischka et al.17 som eksempel.
Bemærk: eksperimenter vist i denne demonstration brugt forskellige neurale fænotype celler afledt af hipscs. - Dissociér forsigtigt cellerne i en enkelt cellesuspension ved hjælp af en celle løsrivelse eller andre foretrukne enzymatiske eller kemiske midler.
- Tæl cellerne i suspension, derefter fortyndes suspensionen til 5 x 104 celler/μl i minimalt cellekulturmedium (f. eks. DMEM) i et 1,7 ml flip top-testrør.
- Overhold følgende bemærkninger til transplantation:
- Cellerne i suspensionen holdes ved 37 °C i hele behandlingsperioden.
- Ilæg kun injektionssprøjten umiddelbart før intraparenchymal injektion (trin 4,5 nedenfor).
Bemærk: tyngdekraften kan medføre, at cellesuspensionen afregnes eller klamrer sig til siden af sprøjten, hvis den er lagt på siden. Dette fører til uregelmæssigheder i antallet af injicerede celler. - Allot ~ 5 x 105 celler (10 μl suspension) pr. mus, hvis de udfører flere celle transplantations procedurer på en dag.
- Udføre stereo taxic transplantation kirurgi
- Placer musen i en anæstesi induktion kammer forbundet til en isofluran vaporizer med komprimeret ilt kilde. Inducere anæstesi med ~ 3% isofluran ved ~ 0,7 L/min ilt.
- Placer musen i en stereotaxisk ramme med vedhæftet bedøvelses næse kegle.
- Fastgør hovedet på plads med øre barer og en bid bar og orientere hovedet sådan, at kraniet frontal benet er vandret. Vedligehold anæstesi på ~ 1.5%-2% isofluran for varigheden af operationen.
- Udføre præoperativ pleje og aseptisk tilberedning
- Anvend hydrerende oftalmisk salve, der indeholder antibiotika til øjne ved hjælp af en vatpind.
- Skylning indsnit site med steril saltvand til at rense stedet og til at løsne suturer. Påfør forsigtigt 70% ethanol med en vatpind for at sterilisere incisionsstedet.
- Fjern suturer ved hjælp af fine pincet og oftalmisk saks. Vanding kirurgi sted og kraniektomi med rigelige sterile saltvand.
- Overvej dyret for udelukkelse, hvis cortex viser diskvalificerende egenskaber, herunder overdreven herniation, misfarvning, forstyrret vaskularisering, eller blødning.
- Ilægning af celle transplantations sprøjten
- Flyt cellesuspensionen fra 37 °C-inkubator til en cellekultur-biosikkerheds hætte. Hvirvl forsigtigt eller TAP røret for at sikre en homogen cellesuspension.
- Brug en Micro pipette til at indlæse ~ 7,5 μl cellesuspension i Hamilton-sprøjten gennem stempel enden.
- Hold sprøjten i en vinkel på 120 ° med stempel enden nedad. Indsæt stemplet, og pas på ikke at indføre en luftboble mellem affjedrings-og stempelspidsen.
- Fastgør pakningen til pipette nålen, og fastgør derefter nålen til sprøjten.
- Tryk stemplet for at flytte cellesuspensionen ind i pipette nålen. Hvis der er modstand mod affjedrings udstrømning, skal du bruge fine pincetter til at bryde nålens spids for at forstørre diameteren.
- Fastgør sprøjten til den stereo taxiske sprøjtepumpe. Stemplet på forhånd for at sikre, at sprøjtepumpe modulet fungerer korrekt.
- Bevæg kanylen ind i koordinaterne til injektion.
- Ret nålens spids til bregma. Indstil X-og Y-koordinaterne til 0. Bevæg derefter nålespidsen over kraniektomi til 2,0 mm lateral og-1,0 mm posterior til bregma. Berør nålens spids til dura mater-overfladen, og Indstil stereotaksisk-koordinaten til Z = 0.
- Tryk stemplet for at sikre, at cellesuspensionen flyder tilstrækkeligt, før nålen indføres i hjernen.
- Introducere nålen i hjernen til en dybde på Z =-1,4 mm. Disse stereotaxiske koordinater placere transplantatet på den grå substans-hvide stof grænsen af den dybe cortex20.
- Start sprøjtepumpen for at indgyde cellesuspension. Indstil laboratorie bænk timeren til 15 min og start timeren. Brug et langt mikroskop til at overvåge celle affjedrings udstrømningen.
- Skyl operationsstedet med sterilt saltvand under injektionen for at opretholde vævs hydrering.
- Ved 15 min, trække langsomt transplantations nålen. Skyl operationsstedet med saltvand og luk snittet med suturer.
- Udføre postoperative pleje
- Seponér anæstesi. Lever CsA ved subkutan injektion i Scruff ved 10 mg/kg dosis. Placer musen i en ren og præ-varmet postoperative bur.
- Give acetaminophen analgetikum i drikkevandet ved 1,0 mg/mL.
Bemærk: give analgesi i henhold til den relevante IACUC standard Operations protokol (SOP) og i betragtning af eksperimentelle resultater variabler. - Give fugtet Chow fødevarer opsving bur til støtte i rehydrering og nyttiggørelse.
- Fortsæt med daglige CsA-injektioner ved 10 mg/kg under hele musens overlevelses varighed.
3. tape fjernelse test af sensorimotor integration
- Skær den elektriske tape i 3 mm x 5 mm strimler ved hjælp af en lille barberkniv før udførelse af adfærds testen. Brug en glat glasoverflade til skæring af klæbestrimler.
Bemærk: Brug gult og rødt tape, da mus har svært ved at skelne mellem disse farver21.- Vælg et lille spejl, der passer godt ind i den klare plastik boks.
- Fix spejlet på plads på en nogenlunde 45 ° vinkel med modellering ler eller tape for at se dyrs adfærd nedefra.
- Placer kassen og spejl samling på en bænk i et roligt dedikeret opførsel test værelse. Anbring cylinderen på plastik boksen over spejlet.
- Arranger håndtering klud, pincet, og klæbende strimler på bænken ved siden af opførsel test boks.
- Rengør æsken og cylinderen med 70% ethanol og papirhåndklæder. Lad overfladerne tørre grundigt.
- Bring musene ind i opførsel testrummet. Lad musene acclimere til testrummet i mindst 30 min før adfærd test.
- Fjern vandforsyningen fra burene for at minimere urinladnings hændelser under testen, hvilket kan forstyrre en effektiv test ydeevne.
- Vælg et lille spejl, der passer godt ind i den klare plastik boks.
- Udfør testen til fjernelse af klæbemiddel
Bemærk: denne funktionstest udføres bedst af to til tre efterforskere: en til at betjene stopure, og en eller to til at håndtere musene og observere opførsel.- Brug hver pincet til at skrælle en klæbende strimmel af hver farve.
- Vælg, hvilken strimmel farve der svarer til hvilken brystben og forbliver konsistent under hele retssagen.
- Brug håndtering klud til at begrænse en mus ved skruff af halsen og ryg sådan, at musen holder forpoterne væk fra sin krop og hoved.
- Brug pincet til at placere en klæbestrimmel på plantar overfladen af hver forepaw. Brug delikat og konsekvent fingertryk for at sikre strimlerne til poterne.
- Placer hurtigt musen i plastik cylinderen. Start de to stopure, når musen har alle fire poter på plastik kassen.
- Brug de to stopure til at optage ventetid for følgende fire begivenheder: venstre pote varsel, venstre Paw fjernelse, højre pote varsel, højre Paw fjernelse.
- Optag en meddelelse begivenhed, når dyret gør utvetydig anerkendelse af den klæbende strimmel ved at ryste eller vige pote eller bide strimlen.
- Optag en fjern hændelse, når dyret effektivt fjerner strimlen fra brystben plantar overfladen.
Bemærk: hændelsen fjernelse er ikke diskvalificeret af Strip readherence, eller hvis strimlen klammer sig til den laterale overflade af forepaw. - Stop timeren ved 120 s, hvis den tilsvarende strimmel ikke er blevet fjernet.
- Registrer de forløbne tider for de fire hændelser i databladet.
- Udfør et andet forsøg på hver mus
- Lad mindst 5 min for at forløbe mellem forsøg for en individuel mus til at reducere stress, som kan forstyrre effektiv ydeevne på testen.
- Rengør apparatet med papirhåndklæder mellem test af mus for at fjerne spild, når du tester flere mus fra et enkelt bur.
- Rengør apparatet grundigt med 70% ethanol og papirhåndklæder, når du tester mus fra flere bure.
- Vend farve-pote placerings rækkefølgen for den anden prøveversion af sessionen for at randomisere enhver effekt af farve.
- Beregn den gennemsnitlige ventetid for hver hændelse mellem to forsøg pr. daglig session for hvert dyr.
- Brug hver pincet til at skrælle en klæbende strimmel af hver farve.
- Rengør apparatet og håndklæde klud grundigt med vand, Udskift burene og returner musene til deres Holding anlæg.
- Gentag trin 3.1-3.2 på flere på hinanden følgende eksperimentelle tidspunkter for et forsøgsdesign med gentagne målinger.
Bemærk: Gentag trin 3.2.1-3.2.5.3 dagligt i 5 dage før enhver dataindsamling for at akkliere dyrene til opgaven. Det anbefales at erhverve baselinedata før operationen.
4. diaminobenzidin (DAB) immunohistokemisk analyse af transplantat overlevelse og skade patologi
- Euthanize dyrene og udføre en transcardial perfusion.
- Forbered opløsninger af 0,1 M fosfat-bufferet saltvand (PBS) og 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS. Balancere pH i begge opløsninger til 7,4.
- Placer de to opløsninger på is i en stinkhætte. Placer en peristaltisk pumpe i røghætten, og Kør pumpen for at fylde slangen med PBS. Indstil pumpens strømningshastighed til ~ 7 ml/min. Tilslut en 25 G nål til pumpens udstrømnings slange.
- Anbring en dræn bakke med et blødt substrat i hætten. Løft den ene ende af bakken i en lille vinkel, så perfusions væsker flugten til den nedre ende.
- Placer en mus i en anæstesi induktions kammer. Fyld kammeret med 4% isofluran ved hjælp af komprimeret 100% Oxygen Vehicle gas.
- Flyt den bedøvede mus fra kammeret til en anæstesi næse kegle. Nedsætte isofluran til 2%.
- Udfør en thoracotomi at udsætte hjertet. Ophøre anæstesi, som thoracotomi forårsager eutanasi.
- Placer forsigtigt perfusions pumpens udstrømnings kanyle i venstre ventrikel langs den lange akse i hjertet. Må ikke punkteres hjertet septum, da dette vil forårsage dårlig perfusion.
- Brug en lille saks til at klippe det rigtige atrium, og tænd straks den peristaltiske pumpe.
- Fortsæt PBS-flowet, indtil væsken, som forlader det højre atrium, løber tør for blod.
- Sluk for pumpen. Flyt pumpe indsugningsrøret til beholderen på PFA. Genstart pumpen. Fortsæt perfusing PFA, indtil dyret er tilstrækkeligt stift, eller indtil der er pumpet 20 mL volumen igennem.
- Sluk for pumpen. Fjern udstrømnings nålen fra hjertet. Flyt indsugningsrøret fra PFA til PBS, og skyl PFA grundigt ud af slangen.
- Fjern hjernen fra kraniet ved omhyggelig dissektion. Placer hjernen i en lille beholder fyldt med 4% PARAFORMALDEHYD, og lad hjernen efter fastsætte natten over ved 4 °C.
- På dagen efter optagelsen, Udskift P med PBS og 0,1% natriumazid. Opbevar hjernen i denne opløsning indtil forberedelse til histologisk skæring.
- Saml 40-50 μm sektioner af formaldehyd-fast hjernevæv via en frysende mikrotom eller stuetemperatur vibratome.
- Forbehandl væv i 0,3% hydrogenperoxid i vand for at inaktivere endogene peroxidaser, som kan producere uspecifik farvning.
- Udfør antigen hentning ved hjælp af citronsyre buffer (10 mM natriumcitrat, 0,05% Polysorbat-20, pH 6,0) ved 60 °C i 30 min.
- Udfør antistof mærkning ved standardmetoder. Se Lundell et al.' s rapport22 fra dette laboratorium for flere detaljer.
- Brug en mus IgG neutralisering Kit (Se tabel over materialer) for at reducere Cross-reaktivitet med endogene antistoffer. Væv i IgG-neutraliserings buffer inkubates i mindst 1 time ved stuetemperatur (RT) efter fabrikantens anvisninger.
- Brug en mus anti-humant nukleare antigen primære antistof (hNA; 1:500 fortynding) ved transplantation af humane iPSC-afledte celler for at lokalisere de transplanterede celler. Væv med det primære antistof ved 4 °C i 48-72 h ved hjælp af blid agitation.
- Efter skylning væk primære antistof opløsning, inkubatvæv med HRP-konjugeret anti-mus sekundært antistof ved 1:250 fortynding for 2 h ved RT.
- Udfør DAB kromogen reaktion ved standardmetoder til at afsløre immunolabeling. Lad DAB-reaktionen udvikle 5 til 10 minutter ved RT.
- Vedhæft farvede væv til slides og anvende følgesedler ved hjælp af standardmetoder.
- Kvantificere antallet af mærkede celler ved hjælp af objektiv Stereologi som beskrevet tidligere23,24. Udfør analyse ved hjælp af 20 μm optiske sektioner og et mellem sektions interval på tre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Craniektomi kirurgi letter eksperimentel hjerneskade og terapeutisk celletransplantation: den kontrollerede kortikale indvirkning model af hjerneskade og efterfølgende celletransplantation terapi kræver omhyggelig fjernelse af overliggende kraniet. Kraniektomi kan udføres på enhver dorsale overflade af kranie at tillade manipulationer til hjernen region af interesse. Diagrammet i figur 1 viser en 5 mm diameter craniectomy skematisk for at afdække primære somatosensoriske og motor kortices (figur 1a). Ved 24 timer efter kraniektomi blev der udført en anden operation for at injicere humant iPSC-afledt neurale cellesuspension i dybe lag af cortex (figur 1B). Nogle cerebral ødem er normalt på den første dag efter kraniektomi, og især efter CCI. Men, cerebral Vaskulaturen besparende i alle faser af denne procedure er afgørende for overlevelse af cortex. Figur 2 illustrerer celletransplantation procedure i en mus med minimal cerebral herniation, minimal blødning, og omfattende kortikale vaskularisering. Disse funktioner er gode prognostiske indikatorer for en vellykket kirurgi.
Tape fjernelse test afslører sensoriske underskud efter ensidig hjerneskade: parametrene for hjernen skade model beskrevet ovenfor blev forudsagt at påvirke forbimb sensorisk og motorisk funktion. Den klæbende tape fjernelse test blev valgt til at evaluere sværhedsgraden af abduktion af forben funktionelle underskud, og de potentielle terapeutiske fordele ved celletransplantation. Mus blev uddannet på testproceduren i 5 dage, derefter lov til at hvile i to dage før baseline adfærd test. Operationer blev udført på dagen efter baselinetest. Adfærds tests i dette studie blev udført på postoperative dage 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35 og 42. Figur 3 viser resultater fra et piloteksperiment, hvor abduktion af forben funktion i mus med craniektomi alene (Sham) og med CCI-skade blev sammenlignet med abduktion af forben-funktionen hos naive mus (n = 11 naive, 12 Sham, 11 CCI). Mus, der gennemgik kirurgi udstillet forbigående øget ventetid at lægge mærke til klæbe stimuli for 1-3 dage umiddelbart efter operationen (figur 3A, B). Mus viste forbigående postoperative underskud i klæbemiddel fjernelse fra den ipsilaterale brystben samt (figur 3C). Men mus, der gennemgik CCI udviste betydelige underskud i motorisk ydeevne i brystben kontralateral til skade i forhold til naive mus ud til postoperative dag 28 (figur 3D). Disse data beskriver også den uventede sværhedsgrad af sensorimotorisk tab i craniotomized mus uden CCI, hvilket indikerer, at kirurgisk kraniektomi til dette område også inducerer TBI-relaterede neurofunktionelle underskud.
Immunodetektion af menneskelig induceret pluripotente stamcelle (IPSC)-afledte celletransplantationer i musehjerne sektioner: eksperimenter blev udført for at afgøre, om humane IPSC-afledte neurale celler ville overleve langsigtet transplantation i muse hjernen. Humane neurale stamceller (NSCs) afledt af iPSCs blev differentieret til enten umodne neuroner eller astrocytter in vitro ved hjælp af etablerede metoder17. Transplantationer af hver af de tre neurale celle fænotyper blev testet i vores CCI model af traumatisk hjerneskade ved hjælp af den procedure, der er beskrevet ovenfor og afbildet i figur 2. Musene blev aflives til histologisk analyse ved 7 dage efter transplantation. Musens hjerne sektioner var immun farvede for det humane nukleare antigen (hNA). Humane celletransplantationer kunne tydeligt skelnes fra værts vævet i Sham-kirurgi og CCI-hjerner (figur 4). Astrocyt grafts (n = 3 Sham, 2 CCI) viste dårlig overlevelse sammenlignet med NSCs (n = 12 Sham, 15 CCI) og neuroner (n = 11 Sham, 10 CCI), og blev ikke taget i betragtning til fremtidige eksperimenter.
Figur 1 : Koordiner parametrene for kirurgiske manipulationer. Tegneserie skildringer af mus hjernen regioner af interesse. Røde cirkler indikerer en ~ 5 mm diameter craniectomy. Et rødt Kors indikerer kraniektomi central punkt 2 mm lateral til bregma. (A) den skraverede region hjernebarken i det øvre diagram påvirkes af milde CCI, når en kraniektomi udføres som vist i nederste diagram. (B) den blå pil i øverste diagram indikerer den omtrentlige placering af celle indsprøjtninger ved 1,4 mm dybde fra kortikal overflade. Det blå kryds i det nederste diagram indikerer placeringen af celle injektion 2 mm lateral og 1 mm posterior til bregma. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Intraoperativ monitorering af cellesuspension injektion. Fotografi taget gennem et langdistance mikroskop under intraparenchymal celle injektion. Anatomiske funktioner er kommenteret for klarhed. Hovedbunden skjuler delvist operationsstedet for at minimere dehydrering under proceduren. Mindre blødning kan forekomme under nåle indtrængning som vist, hvilket ikke giver anledning til bekymring, hvis store kortikale fartøjer forbliver intakt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Adfærdsmæssig evaluering af sensorimotor integration efter hjerneskade. Mus, der gennemgik kraniektomi og CCI blev sammenlignet med naive kontroller og mus, der gennemgik kun Sham kirurgi (n = 11 naive, 12 Sham, 11 CCI). Data præsenteres som gruppe Mean latorer, med fejllinjer indikerer SEM. (A) mus, der gennemgik CCI udviste øget ventetid for at genkende klæbende stimuli anvendes til ipsilaterale brystben på den første postoperative dag. B) mus, der gennemgik kraniektomi eller CCI udviste væsentligt forøget ventetid for at bemærke klæbe stimuli anvendt på den kontralaterale brystben på postoperative dage 1 og 3. (C) mus, der gennemgik kraniektomi eller CCI udviste væsentligt øget ventetid for at fjerne klæbe stimuli fra ipsilaterale brystben på postoperative dage 1 og 3. (D) mus, der gennemgik kraniektomi eller CCI udviste væsentligt øget ventetid for at fjerne klæbe stimuli fra den kontralaterale brystben på postoperative dage 1-5. Motoriske underskud i mus med CCI varede kraftigt i 28 dage efter skaden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : DAB immun histokemi for humane celletransplantationer i musehjerner. Humane iPSCs blev differentieret i neurale stamceller (NSCs), neuroner, eller astrocytter in vitro. Cellekulturer blev transplanteret i musehjerner med eller uden CCI. Mus blev aflives til histologisk analyse syv dage efter celletransplantation. Mikrografer skildrer repræsentative resultater af menneskelige nukleare antigen farvning. Sorte indsætninger skildrer markører for stereologisk kvantificering af celle tal (cyan) og transplantat volumen (rød). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mild CCI som model system til test af eksperimentel regenerativ behandling
CCI-modellen er et værdifuldt værktøj til undersøgelse af mekanismer til vævs dysfunktion efter mekanisk skade på cortex. Den tunbarhed af skaden parametre er et attraktivt træk ved denne model. Ændring af Z-dybden af virkningen, hastigheden eller opholdstid kan øge eller mindske sværhedsgraden af skaden som ønsket af investigator10,25. Den milde CCI model af kontusive hjerneskade, når de udføres korrekt, bør forårsage moderat kortikale celledød og minimal kavitation. Craniectomy og kraniet flap fjernelse skal udføres med stor omhu. Overdreven nedadgående kraft anvendes under boring af kraniektomi grøften kan forårsage kortikale skade på grund af opvarmning og vibrationer. Mekanisk afbrydelse af dura mater under kraniet flap fjernelse næsten ensartet forudsiger alvorlig kortikale skade. Afbrydelse af større kortikale blodkar vil sandsynligvis resultere i overdreven læsion af cortex og er grund til at udelukke dyret fra forsøget. Desværre, tegnene på en forværret skade kan være subtile på dagen efter operationen. Hverken ødem eller lille kortikale fartøj ruptur er nødvendigvis negative indikatorer. Hæmatomer og unormal farvning på grund af iskæmi er klarere indikatorer for kirurgisk komplikation. Dokumentere intraoperativ hændelser og korrelation komplikationer med histopatologiske resultater er afgørende for at raffinere god craniectomy teknik.
Det skal bemærkes, at mTBI modellering i dyr kommer med visse forbehold. Der er talrige prækliniske modeller af mTBI andre end den model, præsenteret her. Eksperimentel TBI kan induceres gennem mekaniske kræfter, blast bølger gennem luften, eller en kombination af disse kræfter26,27,28. Milde til svære kvæstelser bedømmes ved en kombination af histopatologiske og adfærdsmæssige udfald (gennemgået i Petraglia29 og Siebold30). Opførsel underskud i gnavere kan løse inden for dage til uger31 hvorimod humane MTBI-patienters underskud kan vare ved i månedsvis i form af post-konkussive syndrom32. Selv om ingen enkelt model er en komplet analog for klinisk mTBI, prækliniske test afslører fysiologisk mekanismer, der ikke kan vurderes i den menneskelige tilstand.
De vigtigste trin i celle transplantations proceduren er håndtering og injektion af cellesuspensionen. Grov håndtering forårsager cellelyse, fører til frigivelse af klæbrig genomisk DNA og aggregering af de overlevende suspenderede celler. Nålens spids diameter skal være bred nok til at muliggøre en smidig udstrømning af suspensionen; begrænset flow forårsager diskontinuerlig levering som suspension sedimenter inde i nålen. Når du følger denne protokol og undgår de faldgruber, der diskuteres her, var robuste transplantationer synlige efter 7-dages overlevelses tider (figur 4). Langvarig transplantat overlevelse i en præklinisk model er nøglen til at bestemme potentiel terapeutisk effekt af denne tilgang.
Anvendelse af klæbebånd fjernelse test til kontusive hjerneskade modellering
Den klæbende fjernelse test afslører positive Neuro logiske underskud i form af øget ventetid for at fjerne de klæbende stimuli. Den største potentielle ulempe ved denne test er sandsynligheden for inhiberet ydeevne på grund af faktorer, der ikke er relateret til skade. Håndtering stress kan reducere musens sonderende adfærd33, så det er afgørende, at dyrene gennemgår omfattende tilbageholdenhed akklikalsering forud for baselinedata indsamling. Det er vigtigt at fjerne vandforsyningen mindst 30 min før testning for at afbøde urination-relaterede frysning begivenheder. Endelig skal testapparatet rengøres ofte, da dyrene kan blive distraheret i investigatorisk sniffing af lugt signaler fra ukendte dyr.
Resultaterne præsenteres her viser signifikante brystben motoriske underskud kontralateral til mild CCI op til 28 dage efter skaden. Derimod viste samtidige test ved hjælp af cylinder testen34 og accelererende rotarod3 skade inducerede funktionelle underskud, der forsvandt inden for 5-10 dage (data ikke vist). Tape fjernelse har været anvendt i en række forskellige eksperimenter evaluere ensidige underskud i sensorimotor Integrative adfærd7,35. Testen blev også for nylig anvendt til at vurdere motorens funktion opsving efter regenerativ intervention for cervikal rygmarvsskade36. Det dynamiske præstationsområde på denne test kan justeres for ventetid eller Arts variation ved at vælge klæbemidler af forskellig styrke. Her er det antydet, at 3M elektrisk tape er en optimal stimulus for mus baseret på tilgængelighed, holdbarhed, og væsentligt øget ventetid for at fjerne stimuli efter mild CCI. Selv om de indledende eksperimenter, der er vist her ikke kombinere celletransplantation og adfærd test, igangværende eksperimenter i vores laboratorium vil vurdere transplantation overlevelse og samtidige virkninger på sensorimotor adfærdsmæssige opsving fra hjerneskade på 56 dage efter transplantation.
Raffinement til DAB immunodetektion af humane celletransplantationer
DAB Immunhistokemi blev valgt for at producere stærk, vedvarende mærkning af humane celler i muse vævet til efterfølgende stereologisk kvantificering. Forbehandling med hydrogenperoxid er afgørende for at reducere uspecifik farvning i hjernevæv på grund af endogene peroxidaser i erythrocytter. Ikke-specifik farvning i disse eksperimenter blev yderligere reduceret ved hjælp af en mus IgG neutralisering kit. Dette kit bruger proprietære kemikalier til at reducere antigenicitet af endogene mus IgGs, som kan ekstravasate i hjernevæv efter TBI37. Tidlige forsøg anvendte en kombination af mus anti-hNA primært antistof, biotin-konjugeret sekundære antistoffer, og streptavidin-HRP konjugat tertiær mærkning ved hjælp af vektor laboratorier ABC kit. ABC-konjugat udviste omfattende uspecifik DAB-farvning i cortex ipsilaterale til kraniektomi (data ikke vist). Efterfølgende farvnings forsøg anvendte sekundære antistoffer, som var direkte konjugeret med HRP. Denne modificerede protokol producerer høj opløsning nuklear farvning med stærkt reduceret baggrund for alle hiPS-afledte celletyper og kirurgi betingelser (figur 4). Upublicerede eksperimenter fra dette laboratorium ved hjælp af denne modificerede DAB-farvningsteknik detekterer hNA-positive celler i musehjerner 56 dage efter mild CCI. Samlet, en binær antistof mærkning procedure sparet tid og produceret klarere immun farvning i forhold til den traditionelle tertiære mærkning ABC kit procedure. Denne protokol kan være nyttig for andre prækliniske undersøgelser af humane celler, der er transplanteret ind i musens central nervesystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra Center for Neuroscience og regenerativ medicin (CNRM, Grant Number G170244014). Vi sætter pris på hjælp fra Mahima Dewan og Clara Selbrede i klæbe fjernelses pilotundersøgelser. Kryslaine Radomski udførte indledende hjerneskade og celletransplantation kirurgi. Amanda Fu og Laura Tucker fra USU CNRM prækliniske studier har givet værdifuld rådgivning om dyre operationer og adfærds testning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 - K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures - 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
References
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).
- Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013. Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).
- Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage. Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).
- Kulbe, J. R., Hall, E. D. Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology. Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).
- Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. , e51781 (2014).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Mishra, A. M., et al. Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat. PloS ONE. 9, 95280 (2014).
- Sours, C., et al. Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study. Brain Research. 1537, 201-215 (2013).
- Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice. BMC Neuroscience. 14, 142 (2013).
- Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus. Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).
- Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548, 592-596 (2017).
- Kondo, T., et al. Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice. Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).
- Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Lischka, F. W., et al. Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture. Glia. 66, 725-748 (2018).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).
- Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. , e50303 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , Elsevier Academic Press. (2004).
- Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment. Science. 315, 1723-1725 (2007).
- Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, 493-495 (1997).
- Piltti, K. M., et al. Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury. Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).
- Yu, S., et al. Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits. Brain Research. 1287, 157-163 (2009).
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Namjoshi, D. R., et al. Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration). Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).
- Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232 (2014).
- Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75, Suppl 4 34-49 (2014).
- Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model. Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).
- Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research. Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).
- Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis. Brain Injury. 29, 798-803 (2015).
- Hurst, J. L., West, R. S.
- Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).
- Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine. Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).
- Al-Ali, H., et al. The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).
- Pleasant, J. M., et al. Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies. Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).
