Summary
Ce protocole démontre des méthodologies pour un modèle de souris des dommages traumatiques de cerveau de crâne ouvert et de la transplantation des cellules pluripotentes pluripotentes de cellules souches induites cultivées dans le site de blessure. Les essais comportementaux et histologiques des résultats de ces procédures sont également décrits en bref.
Abstract
Les lésions cérébrales traumatiques (ITC) sont l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. La pathologie de la maladie due à l'ITC progresse de l'insulte mécanique primaire aux processus secondaires de dommages, y compris l'apoptose et l'inflammation. La modélisation animale a été utile dans la recherche pour démêler les mécanismes de blessures et évaluer les thérapies neuroprotectrices potentielles. Ce protocole décrit le modèle d'impact cortical contrôlé (ICC) de TBI focal à tête ouverte. Plus précisément, des paramètres pour produire une blessure corticale unilatérale douce sont décrits. Les conséquences comportementales de l'ICC sont analysées à l'aide du test d'élimination du ruban adhésif de l'intégration sensorimotrice bilatérale. En ce qui concerne la thérapie expérimentale pour la pathologie de TBI, ce protocole illustre également un processus pour transplanter des cellules cultivées dans le cerveau. Les cultures de cellules neurales dérivées des cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSCs) ont été choisies pour leur potentiel pour montrer la restauration fonctionnelle supérieure dans les patients humains de TBI. La survie chronique des hiPSCs dans le tissu de cerveau de souris d'hôte est détectée utilisant un processus immunohistochemical modifié de DAB.
Introduction
Les lésions cérébrales traumatiques (ITT) sont un terme général dénonçant les lésions acquises au cerveau en raison de forces mécaniques indirectes (accélération/décélération ou contre-coup) de coups à la tête ou de dommages directs causés par des objets ou des ondes de souffle. TBI a été estimé à être la cause d'environ 9% des décès dans le monde et observé dans environ 50 millions de cas par an1,2. Un rapport 2017 des Centers for Disease Control and Prevention a estimé qu'en 2013, il y avait un total de 2,8 millions de visites à l'hôpital et de décès dus à l'ITC aux États-Unis3. De nombreux TTB plus légers ne sont pas déclarés chaque année. TBI grave peut mener à l'affaiblissement à vie de la cognition, de la fonction motrice, et de la qualité globale de vie. Les conséquences de l'ITC léger, en particulier le TBI répétitif lié au sport, n'ont été appréciées que récemment pour leurs effets insidieux sur la santé4,5.
La modélisation préclinique est un élément essentiel du développement de nouvelles connaissances mécanistes et d'une thérapie réparatrice potentielle pour le TBI. Le modèle d'impact cortical contrôlé (ICC) de TBI est un modèle à tête ouverte de dommages mécaniques de contusion au cortex. Les paramètres d'impact peuvent être modifiés pour produire des blessures de l'ICC qui vont de légères à sévères6. Les blessures de l'ICC sont focales plutôt que diffuses, comme on le voit avec d'autres modèles fermés de TBI. L'ICC peut être effectuée pour induire une blessure unilatérale, de sorte que le cortex contralatéral peut servir de comparateur interne. Ce protocole démontre les caractéristiques d'un CCI doux à une partie du cortex qui englobe les régions somatosensorielles et motrices primaires. Cette zone corticale a été choisie pour son implication dans les comportements sensorimoteurs pour lesquels de nombreux tests de comportement peuvent détecter les déficits induits par les blessures7. Des améliorations comportementales dues aux interventions thérapeutiques pour tBI peuvent également être détectées.
Une caractéristique de TBI est le dysfonctionnement neural répandu dans la région blessée. Les neurones blessés subissent la mort cellulaire, et la connectivité réseau neuronale est perturbée8,9. TBI perturbe le recrutement de cellules souches endogènes, ce qui conduit à d'autres déficits de comportement en aval10,11. La transplantation de cellules souches neurales et de cellules dérivées de cellules souches a été explorée comme possibilité de rétablir la fonction dans le cerveau blessé. En plus du potentiel de reconstituer les circuits neuronaux endommagés, les cellules transplantées exercent des effets paracrine qui favorisent la survie neuronale et la récupération fonctionnelle de TBI12. Une variété de types de cellules ont été transplantés preclinically pour évaluer leur potentiel réparateur dans des modèles des désordres neurologiques13,14,15. La popularisation récente de la technologie des cellules souches pluripotentes induites16 a facilité le développement de nombreuses lignées de cellules souches humaines à des fins expérimentales. L'essai préclinique avec des cellules hiPSC-dérivées est une première étape importante pour caractériser l'efficacité thérapeutique potentielle d'une lignée de cellules donnée contre des maladies humaines. Ce laboratoire a développé des protocoles pour différencier les hiPSC aux phénotypes neuronaux17 à la poursuite de cellules transplantables pour faciliter le rétablissement des lésions cérébrales traumatiques.
Les expériences dans ce protocole emploient un CCI unilatéral pour induire TBI au cortex somatosensory et moteur gauche des souris adultes. Une blessure légère d'ICC a comme conséquence un déficit fonctionnel soutenu dans le avant-paw droit qui est employé pour suivre les effets de l'engraftment de cellules neurales hiPSC-dérivé sur la récupération fonctionnelle. Les essais sensorimoteurs de forepaw dans ce protocole ont été adaptés de la méthodologie établie par Bouet et ses collègues18 et démontrée précédemment par Fleming et ses collègues19. Ce protocole décrit un flux de travail complet pour effectuer une lésion cérébrale expérimentale, la transplantation thérapeutique des cellules hiPS, et l'analyse comportementale et histologique des mesures expérimentales de résultats.
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Protocol
Toutes les expériences décrites dans ce protocole ont été examinées et approuvées par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux de l'Uniformed Services University.
1. Craniectomy et impact cortical contrôlé
- Préparation du dispositif d'impact cortical contrôlé et des fournitures chirurgicales.
- Chargez une seringue de 1 ml avec 0,5 ml de salin stérile pour l'irrigation des plaies. Fixez une aiguille de 25 G à la seringue pour contrôler l'irrigation.
- Préparer une solution diluée de CsA dans DMSO à la concentration finale de 1 mg/mL. Chargez une deuxième seringue de 1 ml avec 0,5 mL de solution de cyclosporine A (CsA) pour l'immunosuppression. Fixez une aiguille de 25 G ou plus à la seringue CsA.
- Fixez le piston d'impact cortical contrôlé à un bras sur un cadre stéréotaxique et régliez-le à un angle de 15 degrés. Fixez une sonde d'impacteur de 3 mm au piston.
- Fixez la vitesse d'impact à 1,5 m/s et l'impact habite le temps à 0,1 s pour produire une légère blessure corticale.
- Effectuer une craniectomy unilatérale
- Placez la souris dans une chambre d'induction d'anesthésie reliée à un vaporisateur d'isoflurane avec source d'oxygène comprimé. Induire l'anesthésie avec 3% d'isoflurane à 0,7 L/min d'oxygène. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie par l'absence de réponse à l'orteil-pinch.
- Raser le cuir chevelu à l'aide de tondeuses électriques et essuyer toute fourrure lâche.
- Placez la souris dans un cadre stéréotaxique avec cône de nez anesthésique attaché.
- Placez un coussin et un coussin chauffant réglé à 37 oC sur le cadre stéréotaxique sous la souris pour maintenir la température corporelle sous anesthésie. Fixer la tête en place avec des barres d'oreilles et une barre de morsure et orienter la tête de telle sorte que l'os frontal du crâne est horizontale. Maintenir l'anesthésie à 1,5%-2% isoflurane pour la durée de la chirurgie.
- Pour effectuer des soins préopératoires et une préparation chirurgicale aseptique, appliquer un onguent ophtalmique antibiotique sur les yeux à l'aide d'un coton-tige stérile. Appliquer une solution à base d'iode sur la zone du cuir chevelu rasé. Retirez-le avec 70 % d'éthanol. Couvrir l'animal d'un drapé chirurgical fenestré de sorte que le haut de la tête soit visible mais que les yeux soient couverts.
- Faire une incision médiane (1,5-2 cm) sur le cuir chevelu à l'aide d'un scalpel ou de ciseaux. Utilisez des cotons-tiges stériles pour nettoyer la plaie et effacer le fascia gauche de la ligne médiane à bregma.
- Utilisez la sonde impacteur pour identifier le site craniectomy.
- Définir le point de référence stéréotaxique (X '0, Y '0) à bregma. Ajustez la sonde latéralement à 2 mm à gauche de la ligne médiane. Décrivez un cercle de 5 mm de diamètre autour de la sonde à l'aide d'un marqueur à pointe fine et sans danger pour la chirurgie. Soulevez et faites pivoter l'impacteur hors de sa position.
- Utilisez l'outil à main rotatif à micromoteur à grande vitesse pour faire un trou ouvert dans le crâne à l'aide d'une pointe ronde de 0,6 mm ou 0,8 mm de foret de bavure à une vitesse maximale de 70 % à 80 %. Appliquez une pression légère sur le crâne pendant le forage le long du contour circonférence de 5 mm pour éclaircir cette bordure.
- N'appliquez pas de pression excessive pendant le forage. Cela peut causer des blessures corticales dues à des vibrations, compression, ou la pénétration accidentelle. Laissez la vitesse de la partie de forage pour faire le travail.
- Ne percez pas à un endroit donné trop longtemps pour éviter l'excès de frottement du crâne. Irriguer la craniectomy de temps en temps avec la saline stérile pour enlever des débris et pour réduire le chauffage de l'outil rotatif.
- Portez une attention particulière lors du forage au-dessus de la ligne de suture coronale car ces points sont vulnérables à l'hémorragie.
- Utilisez une paire de pincettes fines pour enlever le rabat du crâne lorsque le contour craniectomy est suffisamment éclairci. Saisir le rabat médially, et soulever doucement et tirer latéralement avec un mouvement radial.
- Ne pas endommager le dura mater lors du levage du rabat; ceci peut causer des dommages graves et une hémorragie.
- Effectuer une légère blessure à impact cortical contrôlée
- Nettoyez la sonde de l'impacteur à l'eau avec un tampon stérile de préparation à l'alcool. Replacées la sonde de l'impacteur au-dessus du cortex exposé. Abaissez la sonde jusqu'à ce qu'elle touche la surface de dura mater. Marquez cette position en tant que Z 0.
- Retirez le piston et déplacez-vous vers Z -1,0 mm. Déchargez le piston pour avoir un impact sur le cortex.
- Soulevez rapidement le piston et déplacez le bras hors de position. Appliquer de généreuses quantités de salin pour irriguer le cortex après une blessure. Rincer le site de la chirurgie avec salin au besoin et suturer l'incision du cuir chevelu à l'aide de simples stiches interrompus avec 5,0 suture de soie.
- Effectuer des soins postopératoires sur la souris
- Interrompre l'anesthésie. Délivrez l'ACs par injection sous-cutanée dans des éraflures à une dose de 10 mg/kg. Placez la souris dans une cage postopératoire propre et préchauffée.
- Fournir un analgésique acétaminophène dans l'eau potable à 1,0 mg/mL.
REMARQUE : Fournir l'analgésie selon la procédure d'opération standard appropriée de l'IACUC et en tenant compte des variables expérimentales de résultats (par exemple, sédation, neuroinflammation). - Fournir de la nourriture de chow humidifiée dans une cage de récupération réchauffée pour aider à la réhydratation et à la récupération.
- Passez de la section 2 à la section 4 ci-dessus lorsque vous effectuez des contrôles craniectomy-only (faux).
2. Transplantation stéréotaxique de la suspension cellulaire
- Commencer la procédure de transplantation cellulaire environ 24 h après craniectomy.
- Préparer l'équipement de transplantation cellulaire et les fournitures chirurgicales
- Remplissez une seringue de 1 ml de saline stérile pour l'irrigation des plaies. Fixez une aiguille de 25 G à la seringue pour contrôler l'irrigation.
- Remplissez une seringue de 1 ml avec la solution CsA pour l'immunosuppression. Fixez une aiguille de 25 G ou plus à la seringue CsA. Remplissez la seringue CsA au besoin entre les chirurgies.
- Préparer les aiguilles en verre à partir de 1,0 mm OD borosilicate verre pipettes capillaires en utilisant des méthodes standard.
- Utilisez une pince fine pour casser les pointes d'aiguille à environ 200 m de diamètre. Assurez-vous que l'arbre cylindrique de l'aiguille ne mesure pas plus de 2,5 cm.
- Calibrer la pompe à seringues pour une utilisation avec une seringue de 10 l. Entrez un débit de 0,2 L/min pour livrer un volume total de 2,0 l.
- Préparer la suspension des cellules souches pluripotentes induites par l'homme (iPSC).
- Effectuez toute la manipulation cellulaire dans une hotte BSL-2 de culture cellulaire en utilisant des techniques de manipulation stériles standard.
- Préparer les cultures cellulaires à l'avance selon les conditions standard définies pour le type de cellule. Se référer à Lischka et coll.17 à titre d'exemple.
REMARQUE : Les expériences montrées dans cette démonstration ont employé diverses cellules neurales de phénotype dérivées des hiPSCs. - Dissocier doucement les cellules en une suspension unicellulaire à l'aide d'une solution de détachement cellulaire ou d'autres moyens enzymatiques ou chimiques préférés.
- Comptez les cellules en suspension, puis diluez la suspension à 5 x 104 cellules/L dans un milieu de culture cellulaire minimal (p. ex., DMEM) dans un tube à essai de 1,7 ml.
- Observez les notes suivantes pour la transplantation :
- Maintenir les cellules en suspension à 37 oC pendant toute la durée des procédures.
- Chargez la seringue seulement immédiatement avant d'effectuer l'injection intraparenchymale (étape 4.5 ci-dessous).
REMARQUE : La gravité peut faire en sorte que la suspension de la cellule se dépose ou s'accroche au côté de la seringue si elle est posée sur le côté. Cela conduit à des irrégularités dans le nombre de cellules injectées. - Attribuer 5 x 105 cellules (suspension de 10 l) par souris si vous effectuez plusieurs procédures de transplantation cellulaire en une journée.
- Effectuer une chirurgie de transplantation stéréotaxique
- Placez la souris dans une chambre d'induction d'anesthésie reliée à un vaporisateur d'isoflurane avec source d'oxygène comprimé. Induire l'anesthésie avec 3% d'isoflurane à 0,7 L/min d'oxygène.
- Placez la souris dans un cadre stéréotaxique avec cône de nez anesthésique attaché.
- Fixer la tête en place avec des barres d'oreilles et une barre de morsure et orienter la tête de telle sorte que l'os frontal du crâne est horizontale. Maintenir l'anesthésie à 1,5%-2% isoflurane pour la durée de la chirurgie.
- Effectuer des soins préopératoires et une préparation aseptique
- Appliquer un onguent ophtalmique hydratant contenant un antibiotique sur les yeux à l'aide d'un coton-tige.
- Laver le site d'incision avec saline stérile pour nettoyer le site et desserrer les sutures. Appliquer délicatement 70% d'éthanol avec un coton-tige pour stériliser le site d'incision.
- Enlever les sutures à l'aide d'une pince fine et de ciseaux ophtalmiques. Irriguer le site de chirurgie et le craniectomy avec le salin stérile abondant.
- Considérez l'animal pour l'exclusion si le cortex affiche des caractéristiques disqualifiantes comprenant l'hernie excessive, la décoloration, la vascularisation perturbée, ou l'hémorragie.
- Chargez la seringue de greffe de cellules
- Déplacez la suspension cellulaire de l'incubateur de 37 oC à une hotte de biosécurité de culture cellulaire. Remuez doucement ou appuyez sur le tube pour assurer une suspension cellulaire homogène.
- Utilisez un micro pipettor pour charger la suspension cellulaire de 7,5 l dans la seringue Hamilton par l'extrémité du piston.
- Maintenez la seringue à un angle de 120 degrés avec l'extrémité du piston vers le bas. Insérez le piston, en prenant soin de ne pas introduire une bulle d'air entre la suspension et la pointe du piston.
- Fixez l'ensemble à l'aiguille de pipette, puis attachez l'aiguille à la seringue.
- Poussez le piston pour déplacer la suspension cellulaire dans l'aiguille de pipette. S'il y a résistance contre l'écoulement de suspension, utilisez des pinces fines pour casser la pointe de l'aiguille pour agrandir le diamètre.
- Fixez la seringue à la pompe à seringue stéréotaxique. Avancez le piston pour vous assurer que l'assemblage de la pompe à seringue fonctionne correctement.
- Déplacez l'aiguille dans les coordonnées pour l'injection.
- Alignez la pointe de l'aiguille sur bregma. Définir les coordonnées X et Y à 0. Déplacez ensuite la pointe de l'aiguille sur la craniectomy à 2,0 mm latérale et -1,0 mm postérieure à bregma. Touchez la pointe de l'aiguille à la surface dura mater et fixez la coordonnées stéréotaxiques à Z '0.
- Poussez le piston pour s'assurer que la suspension cellulaire coule correctement avant d'introduire l'aiguille dans le cerveau.
- Introduire l'aiguille dans le cerveau à une profondeur de Z -1,4 mm. Ces coordonnées stéréotaxiques placent la greffe à la bordure de matière grise de matière blanche du cortex profond20.
- Démarrer la pompe à seringues pour infuser la suspension cellulaire. Fixez la minuterie de banc de laboratoire à 15 min et commencez la minuterie. Utilisez un microscope à longue distance de travail pour surveiller l'écoulement de la suspension cellulaire.
- Irriguer le site de la chirurgie avec saline stérile pendant l'injection pour maintenir l'hydratation des tissus.
- À 15 min, retirez lentement l'aiguille de transplantation. Irriguer le site de la chirurgie avec saline et fermer l'incision avec des sutures.
- Effectuer des soins postopératoires
- Interrompre l'anesthésie. Délivrez l'ACs par injection sous-cutanée dans des éraflures à une dose de 10 mg/kg. Placez la souris dans une cage postopératoire propre et préchauffée.
- Fournir un analgésique acétaminophène dans l'eau potable à 1,0 mg/mL.
REMARQUE : Fournir l'analgésie selon le protocole d'exploitation standard approprié de l'IACUC (SOP) et en tenant compte des variables expérimentales des résultats. - Fournir une cage de récupération alimentaire de chow humidifiée pour aider à la réhydratation et à la récupération.
- Continuer les injections quotidiennes de CsA à 10 mg/kg pendant toute la durée de survie de la souris.
3. Test de suppression de bande adhésive de l'intégration sensorimotrice
- Couper le ruban électrique en bandes de 3 mm x 5 mm à l'aide d'un petit couteau à rasoir avant d'effectuer le test de comportement. Utilisez une surface en verre lisse pour couper les bandes adhésives.
REMARQUE: Utilisez la paperasserie et la paperasserie, car les souris ont de la difficulté à distinguer entre ces couleurs21.- Sélectionnez un petit miroir qui s'adapte bien à l'intérieur de la boîte en plastique transparent.
- Fixez le miroir en place à un angle d'environ 45 degrés avec de l'argile de modélisation ou du ruban adhésif afin de voir le comportement animal d'en bas.
- Placez la boîte et l'assemblage miroir sur un banc dans une salle d'essai de comportement calme dédiée. Disposer le cylindre sur la boîte en plastique au-dessus du miroir.
- Disposez le tissu de manipulation, les pinces et les bandes adhésives sur le banc à côté de la boîte d'essai de comportement.
- Nettoyez la boîte et le cylindre avec 70 % d'éthanol et de papier essuie-tout. Laisser les surfaces bien sécher.
- Amenez les souris dans la salle d'essai de comportement. Laissez les souris s'acclimater à la salle d'essai pendant au moins 30 minutes avant les tests de comportement.
- Retirez l'approvisionnement en eau des cages pour minimiser les événements de miction pendant les essais, ce qui peut nuire à l'efficacité des tests.
- Sélectionnez un petit miroir qui s'adapte bien à l'intérieur de la boîte en plastique transparent.
- Effectuer le test d'élimination de l'adhésif
REMARQUE: Ce test de comportement est mieux effectué par deux à trois chercheurs: un pour faire fonctionner les chronomètres, et un ou deux pour manipuler les souris et observer le comportement.- Utilisez chaque pince à épiler pour éplucher une bande adhésive de chaque couleur.
- Choisissez la couleur de bande qui correspond à laquelle l'avant-garde et restez cohérente tout au long de l'essai.
- Utilisez le chiffon de manipulation pour retenir une souris par le éraflure du cou et du dos de telle sorte que la souris tient les pattes avant loin de son corps et de sa tête.
- Utilisez une pince à épiler pour placer une bande adhésive sur la surface plantaire de chaque patte avant. Utilisez une pression délicate et cohérente pour fixer les bandes aux pattes.
- Placez rapidement la souris dans le cylindre en plastique. Démarrez les deux chronomètres lorsque la souris a les quatre pattes sur la boîte en plastique.
- Utilisez les deux chronomètres pour enregistrer les latences pour les quatre événements suivants : avis de patte gauche, retrait de patte gauche, avis de patte droite, retrait de la patte droite.
- Enregistrez un événement d'avis lorsque l'animal fait une reconnaissance sans ambiguïté de la bande adhésive en secouant ou en bronchant la patte ou en mordant la bande.
- Enregistrez un événement d'enlèvement lorsque l'animal enlève efficacement la bande de la surface plantaire de l'avant-patte.
REMARQUE : L'événement d'enlèvement n'est pas disqualifié par la réadhérence de bande ou si la bande s'accroche à la surface latérale du patte avant. - Arrêtez la minuterie à 120 s si la bande correspondante n'a pas été enlevée.
- Enregistrez les temps écoulés pour les quatre événements sur la fiche de données.
- Effectuer un deuxième essai sur chaque souris
- Prévoyez un minimum de 5 min pour s'écouler entre les essais pour une souris individuelle afin de réduire le stress, ce qui peut interférer avec les performances efficaces sur le test.
- Nettoyez l'appareil avec des essuie-tout entre les souris d'essai pour éliminer les déchets lors de l'essai de plusieurs souris à partir d'une seule cage.
- Nettoyez soigneusement l'appareil avec 70 % d'éthanol et de papier essuie-tout lorsque vous testez des souris à partir de plusieurs cages.
- Inverser l'ordre de placement couleur-patte pour le deuxième essai de la session pour randomiser tout effet de couleur.
- Calculez la latence moyenne de chaque événement entre deux essais par session quotidienne pour chaque animal.
- Utilisez chaque pince à épiler pour éplucher une bande adhésive de chaque couleur.
- Nettoyez soigneusement l'appareil et le tissu de manutention avec de l'eau, remplacez les réserves d'eau de la cage et retournez les souris à leur installation de détention.
- Répéter les étapes 3.1-3.2 sur les chronomoments expérimentaux successifs pour une conception d'essai de mesures répétées.
REMARQUE : Répétez les étapes 3.2.1-3.2.5.3 tous les jours pendant 5 jours avant toute collecte de données pour acclimater les animaux à la tâche. L'acquisition de données de base avant la chirurgie est recommandée.
4. Analyse immunohistochimique de la diaminobenzidine (DAB) de la survie de greffe et de la pathologie de blessure
- Euthanasier les animaux et effectuer une perfusion transcardique.
- Préparer des solutions de saline tamponnée par phosphate de 0,1 M (PBS) et de 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans PBS. Équilibrez le pH des deux solutions à 7,4.
- Placez les deux solutions sur la glace dans une hotte à fumée. Placez une pompe péristatique dans le capot de fumée, et exécutez la pompe pour remplir le tube avec PBS. Définir le débit de la pompe à 7 ml/min. Connectez une aiguille de 25 G au tube de sortie de la pompe.
- Placer un plateau de drainage avec un substrat souple dans le capot. Soulevez une extrémité du plateau à un léger angle de sorte que les fluides de perfusion s'écoulent vers l'extrémité inférieure.
- Placer une souris dans une chambre d'induction d'anesthésie. Remplissez la chambre avec 4% isoflurane en utilisant le gaz comprimé 100% de véhicule d'oxygène.
- Déplacez la souris anesthésié de la chambre à un cône de nez d'anesthésie. Diminuer l'isoflurane à 2%.
- Effectuer une thoracotomie pour exposer le cœur. Interrompre l'anesthésie, car la thoracotomie provoque l'euthanasie.
- Placez soigneusement l'aiguille de sortie de la pompe à perfusion dans le ventricule gauche le long du long axe du cœur. Ne pas percer le septum du cœur, car cela causera une perfusion pauvre.
- Utilisez de petits ciseaux pour couper l'atrium droit, puis allumez immédiatement la pompe péristatique.
- Continuer le flux de PBS jusqu'à ce que le liquide quittant l'atrium droit s'écoule du sang.
- Éteignez la pompe. Déplacez le tube d'intake de pompe au récipient de PFA. Redémarrez la pompe. Continuer à persiner le PFA jusqu'à ce que l'animal soit suffisamment rigide ou jusqu'à ce qu'un volume de 20 ml ait été pompé à travers.
- Éteignez la pompe. Retirez l'aiguille sortante du cœur. Déplacez le tube d'intake du PFA au PBS, et rincer complètement PFA de la tuyauterie.
- Retirez le cerveau du crâne par dissection soigneuse. Placez le cerveau dans un petit récipient rempli de 4 % de paraformaldéhyde, et laissez le cerveau post-fixer pendant la nuit à 4 oC.
- Le lendemain de la fixation, remplacer le P par PBS et 0,1% d'azide de sodium. Conserver les cerveaux dans cette solution jusqu'à la préparation de la section histologique.
- Recueillir des sections de 40 à 50 m de tissu cérébral fixée au formaldéhyde par l'intermédiaire d'un microtome congeler ou d'un vibratome à température ambiante.
- Pretreat tissus dans 0,3% de peroxyde d'hydrogène dans l'eau pour inactiver peroxidases endogènes, qui peuvent produire des taches non spécifiques.
- Effectuer la récupération d'antigène à l'aide d'un tampon d'acide citrique (10 mM de citrate de sodium, 0,05 % de polysorbate-20, pH 6,0) à 60 oC pendant 30 min.
- Effectuer l'étiquetage des anticorps par des méthodes standard. Se référer à Lundell et al. rapport22 de ce laboratoire pour plus de détails.
- Utilisez un kit de neutralisation IgG de souris (voir Tableau des matériaux) pour réduire la réactivité croisée avec des anticorps endogènes. Incuber les tissus dans le tampon de neutralisation IgG pendant au moins 1 h à température ambiante (RT), en suivant les instructions du fabricant.
- Utilisez un anticorps primaire antigène nucléaire anti-humain de souris (hNA ; 1:500 dilution) en transplantant des cellules humaines iPSC-dérivées pour localiser les cellules transplantées. Incuber les tissus avec l'anticorps primaire à 4 oC pendant 48-72 h en utilisant une agitation douce.
- Après avoir rincé la solution primaire d'anticorps, incuber des tissus avec l'anticorps secondaire anti-souris HRP-conjugué à 1:250 dilution pendant 2 h à RT.
- Effectuer la réaction chromogène DAB par des méthodes standard pour révéler l'immunolabeling. Permettre à la réaction DAB de se développer pendant 5 à 10 min à RT.
- Fixez les tissus tachés aux glissières et appliquez des feuillets de couverture en utilisant des méthodes standard.
- Quantifiez le nombre de cellules étiquetées à l'aide d'une stéréologie impartiale telle que décrite précédemment23,24. Effectuer une analyse à l'aide de sections optiques de 20 m et d'un intervalle de trois entre les sections.
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Representative Results
La chirurgie craniectomy facilite les dommages de cerveau expérimentaux et la transplantation thérapeutique de cellules : le modèle cortical commandé d'impact des dommages de cerveau et la thérapie suivante de transplantation de cellules exigent l'enlèvement soigneux du crâne sus-lying. La craniectomy peut être exécutée sur n'importe quelle surface dorsal du crâne pour permettre des manipulations à la région de cerveau d'intérêt. Le diagramme de la figure 1 représente un schéma craniectomy de 5 mm de diamètre pour découvrir les cortices somatosensoriels et moteurs primaires (figure1A). À 24 h après craniectomy, une deuxième chirurgie a été exécutée pour injecter la suspension neurale d'iPSC-dérivée humaine de cellules dans les couches profondes du cortex (figure 1B). Un certain oedème cérébral est normal le premier jour suivant la craniectomy, et particulièrement après CCI. Cependant, l'épargnant cérébral de vascularisation pendant toutes les phases de cette procédure est crucial pour la survie du cortex. La figure 2 illustre la procédure de transplantation de cellules dans une souris avec l'hernie cérébrale minimale, le saignement minimal, et la vascularisation corticale étendue. Ces dispositifs sont de bons indicateurs pronostiques d'une chirurgie réussie.
Les essais adhésifs d'enlèvement de bande révèlent des déficits sensorimoteurs après des dommages de cerveau unilatéraux : les paramètres du modèle de dommages de cerveau décrits ci-dessus ont été prévus pour affecter la fonction sensorielle et motrice de membre antérieur. Le test adhésif de suppression de bande a été choisi pour évaluer la sévérité des déficits fonctionnels de membre antérieur, et les avantages thérapeutiques potentiels de la transplantation de cellules. Les souris ont été formées sur la procédure d'essai pendant 5 jours, puis autorisées à se reposer pendant deux jours avant l'essai de conduite de ligne de base. Des chirurgies ont été exécutées le jour suivant l'essai de ligne de base. Des essais de comportement dans cette étude ont été exécutés les jours postopératoires 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35, et 42. La figure 3 montre les résultats d'une expérience pilote dans laquelle la fonction des membres antérieurs chez les souris atteintes de craniectomy seule (faux) et avec des lésions de l'ICC a été comparée à la fonction des membres antérieurs chez les souris naïves (n 11 naïfs, 12 faux, 11 CCI). Les souris qui ont subi la chirurgie ont exhibé les latences accrues transitoires pour remarquer des stimulus adhésifs pendant 1-3 jours immédiatement après chirurgie (figure 3A,B). Les souris ont montré des déficits postopératoires transitoires dans l'enlèvement adhésif du patte avant ipsilateral aussi bien (figure 3C). Cependant, les souris qui ont subi l'ICC ont montré des déficits significatifs dans la performance motrice dans le contre-pied contralatéral aux dommages comparés aux souris naïves dehors au jour postopératoire 28 (figure 3D). Ces données décrivent également la sévérité inattendue de la perte sensorimotrice dans les souris craniotomized sans CCI, indiquant que la craniectomy chirurgicale à ce secteur induit également des déficits neurofonctionnels TBI-connexes.
Immunodétection des greffes de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (iPSC) dans les sections du cerveau de souris : des expériences ont été réalisées pour déterminer si les cellules neurales dérivées de l'iPSC humains survivraient à la transplantation à long terme dans le cerveau de la souris. Les cellules souches neurales humaines (CNS) dérivées des iPSC ont été différenciées en neurones immatures ou en astrocytes in vitro à l'aide de méthodes établies17. Les greffes de chacun des trois phénotypes des cellules neurales ont été testées dans notre modèle CCI de lésions cérébrales traumatiques à l'aide de la procédure décrite ci-dessus et représentée à la figure 2. Les souris ont été euthanasiées pour l'analyse histologique à 7 jours après la transplantation. Des sections de cerveau de souris ont été immunostained pour l'antigène nucléaire humain (hNA). Les greffes de cellules humaines pourraient être clairement distinguées des tissus hôtes en chirurgie fictive et dans les cerveaux de l'ICC (figure 4). Les greffes d'astrocytes (n - 3 faux, 2 CCI) ont montré une faible survie par rapport aux CNS (n - 12 faux, 15 CCI) et les neurones (n - 11 faux, 10 CCI), et n'ont pas été considérés pour les expériences futures.
Figure 1 : Coordonner les paramètres des manipulations chirurgicales. Représentations de dessin animé des régions de cerveau de souris d'intérêt. Les cercles rouges indiquent une craniectomy de 5 mm de diamètre. Une croix rouge indique le point central de craniectomy 2 mm latéral au bregma. (A) La région ombragée du cortex cérébral dans le diagramme supérieur est affectée par l'ICC doux quand une craniectomy est exécutée comme indiqué dans le diagramme inférieur. (B) La flèche bleue dans le diagramme supérieur indique l'emplacement approximatif des injections de cellules à 1,4 mm de profondeur de la surface corticale. La croix bleue dans le diagramme inférieur indique le placement de l'injection cellulaire 2 mm latérale et 1 mm postérieure à bregma. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Surveillance peropératoire de l'injection de suspension cellulaire. Photographie prise par un microscope à longue distance de travail pendant l'injection intraparenchymal de cellules. Les caractéristiques anatomiques sont annotées pour plus de clarté. Le cuir chevelu obscurcit partiellement le site de chirurgie pour réduire au minimum la déshydratation pendant la procédure. Des saignements mineurs peuvent se produire pendant la pénétration de l'aiguille comme indiqué, ce qui n'est pas préoccupant si les grands vaisseaux corticaux restent intacts. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Évaluation comportementale de l'intégration sensorimotrice après une lésion cérébrale. Les souris qui ont subi la craniectomy et l'ICC ont été comparées aux contrôles naïfs et aux souris qui ont subi seulement la chirurgie de faux (n ' 11 naïf, 12 faux, 11 CCI). Les données sont présentées comme des latences moyennes de groupe, avec des barres d'erreur indiquant SEM. (A) Les souris qui ont subi l'ICC ont montré une latence accrue pour reconnaître les stimulus adhésifs appliqués à l'avant-garde ipsilateral le premier jour postopératoire. (B) Les souris qui ont subi la craniectomy ou l'ICC ont exhibé la latence sensiblement accrue pour remarquer des stimulus adhésifs appliqués au patte antérieur contralatéral les jours postopératoires 1 et 3. (C) Les souris qui ont subi la craniectomy ou l'ICC ont exhibé la latence sensiblement accrue pour enlever des stimulus adhésifs du patte avant ipsilateral les jours postopératoires 1 et 3. (D) Les souris qui ont subi la craniectomy ou l'ICC ont exhibé la latence sensiblement accrue pour enlever des stimulus adhésifs du patte antérieur contralatéral les jours postopératoires 1-5. Les déficits moteurs chez les souris atteintes d'ICC ont persisté fortement pendant 28 jours après les blessures. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Immunohistochemistry de DAB pour des greffes humaines de cellules dans des cerveaux de souris. Les iPSC humains ont été différenciés en cellules souches neurales (NSC), neurones, ou astrocytes in vitro. Les cultures cellulaires ont été transplantées dans des cerveaux de souris avec ou sans CCI. Des souris ont été euthanasiées pour l'analyse histologique sept jours après la transplantation de cellules. Les micrographies représentent les résultats représentatifs de la coloration de l'antigène nucléaire humain. Les insets noirs représentent des marqueurs pour la quantification stéréologique du nombre cellulaire (cyan) et du volume de greffe (rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'ICC légère comme système modèle pour tester la thérapie régénérative expérimentale
Le modèle de l'ICC est un outil précieux pour étudier les mécanismes de dysfonctionnement tissulaire après des blessures mécaniques au cortex. L'adabilité des paramètres de blessure est une caractéristique attrayante de ce modèle. Modifier la profondeur d'impact Z, la vitesse ou le temps d'occupation peut augmenter ou diminuer la gravité de la blessure comme le souhaite l'enquêteur10,25. Le modèle doux d'ICC des dommages de cerveau contusive, une fois exécuté correctement, devrait causer la mort corticale modeste de cellules et la cavitation minimale. La craniectomie et l'enlèvement des ailerons du crâne doivent être effectués avec beaucoup de soin. Une force excessive vers le bas appliquée lors du forage de la tranchée de craniectomy peut causer des dommages corticaux dus au chauffage et aux vibrations. La perturbation mécanique du mater de dura pendant l'enlèvement d'aileron de crâne prédit presque uniformément des dommages corticaux graves. La perturbation des principaux vaisseaux sanguins corticaux est susceptible d'entraîner une lésion excessive du cortex et est un motif pour exclure l'animal de l'expérience. Malheureusement, les signes d'une blessure exacerbée peuvent être subtils le lendemain de la chirurgie. Ni l'œdème ni la rupture de petit vaisseau cortical ne sont nécessairement des indicateurs négatifs. Les hématomes et la coloration anormale due à l'ischémie sont des indicateurs plus clairs de complication chirurgicale. La documentation des événements peropératoires et des complications de corrélation avec des résultats histopathologiques sont cruciales pour affiner la bonne technique de craniectomy.
Il convient de noter que la modélisation mTBI chez les animaux est livré avec certaines mises en garde. Il existe de nombreux modèles précliniques de mTBI autres que le modèle présenté ici. Le TBI expérimental peut être induit par des forces mécaniques, des ondes de souffle dans l'air, ou une combinaison de ces forces26,27,28. Les blessures légères à graves sont jugées par une combinaison de résultats histopathologiques et comportementaux (compte-rendu dans Petraglia29 et Siebold30). Les déficits de comportement chez les rongeurs peuvent se résorber en quelques jours à31 semaines tandis que les déficits des patients atteints de l'ITM peuvent persister pendant des mois sous la forme du syndrome post-concussif32. Bien qu'aucun modèle unique ne soit un analogue complet pour le mTBI clinique, l'essai préclinique révèle des mécanismes physiologiques qui ne peuvent pas être évalués dans la condition humaine.
Les étapes les plus importantes dans la procédure de transplantation cellulaire sont la manipulation et l'injection de la suspension cellulaire. La manipulation brutale provoque la lyse cellulaire, conduisant à la libération d'ADN génomique collant et l'agrégation des cellules suspendues survivantes. Le diamètre de la pointe de l'aiguille doit être suffisamment large pour permettre une sortie lisse de la suspension; l'écoulement restreint provoque la livraison discontinue pendant que les sédiments de suspension à l'intérieur de l'aiguille. En suivant ce protocole et en évitant les pièges discutés ici, les greffes robustes étaient visibles après les temps de survie de 7 jours (figure 4). La survie à long terme de greffe dans un modèle préclinique est essentielle pour déterminer l'efficacité thérapeutique potentielle de cette approche.
Application du test d'enlèvement de bande adhésive à la modélisation contusive de dommages de cerveau
Le test de suppression adhésive révèle des déficits neurologiques positifs en termes de latence accrue pour enlever les stimuli adhésifs. Le principal inconvénient potentiel de ce test est la probabilité d'une performance inhibée en raison de facteurs non liés aux blessures. La manipulation du stress peut réduire le comportement exploratoire de la souris33, il est donc crucial que les animaux subissent une acclimatation importante de contention avant la collecte de données de base. Il est important d'enlever l'approvisionnement en eau au moins 30 minutes avant les essais afin d'atténuer les événements de congélation liés à la miction. Enfin, l'appareil d'essai doit être nettoyé souvent car les animaux peuvent être distraits dans l'enquête reniflant des indices d'odeur des animaux inconnus.
Les résultats présentés ici montrent des déficits moteurs de prépaw significatifs contralatéral à l'ICC doux jusqu'à 28 jours après blessure. En revanche, les essais simultanés à l'aide de l'essai de cylindre34 et l'accélération rotarod3 ont montré des déficits fonctionnels causés par des blessures qui ont résolu dans les 5 à 10 jours (données non montrées). Suppression de bande adhésive a été utilisé dans une variété d'expériences évaluant les déficits unilatéraux dans le comportement intégrateur sensorimoteur7,35. L'essai a également été récemment employé pour évaluer le rétablissement de fonction de moteur suivant l'intervention régénératrice pour le dommage cervical de moelle épinière36. La plage dynamique de performance de ce test peut être réglée pour la latence ou la variation des espèces en sélectionnant des adhésifs de force différente. Ici, il est suggéré que le ruban électrique 3M est un stimulus optimal pour les souris en fonction de la disponibilité, la durabilité, et la latence considérablement accrue pour enlever les stimuli après l'ICC doux. Bien que les expériences préliminaires présentées ici ne combinent pas la transplantation cellulaire et les tests de comportement, les expériences en cours dans notre laboratoire évalueront la survie de la greffe et les effets concomitants sur la récupération comportementale sensorimotrice des lésions cérébrales à 56 jours après la transplantation.
Raffinement à l'immunodétection DAB des greffes de cellules humaines
L'immunohistochimie de DAB a été choisie afin de produire l'étiquetage fort et persistant des cellules humaines dans le tissu de souris pour la quantification stéréologique suivante. Le prétraitement avec le peroxyde d'hydrogène est crucial pour réduire la coloration non spécifique dans le tissu cérébral due aux peroxidas endogènes dans les érythrocytes. La coloration non spécifique dans ces expériences a été encore réduite à l'aide d'un kit de neutralisation IgG de souris. Ce kit utilise des produits chimiques exclusifs pour réduire l'antigénicité des IgGs de souris endogènes, qui peuvent extravasate dans le tissu cérébral après TBI37. Les premières tentatives ont employé une combinaison de l'anticorps primaire anti-hNA de souris, des anticorps secondaires biotin-conjugués, et de l'étiquetage tertiaire tertiaire conjugué de streptavidin-HRP utilisant le kit ABC de laboratoires de vecteur. Le conjugaison d'ABC a exhibé la coloration non spécifique étendue de DAB dans le cortex ipsilateral à la craniectomy (données non montrées). Les essais ultérieurs de coloration ont employé des anticorps secondaires directement conjugués avec HRP. Ce protocole modifié produit des taches nucléaires à haute résolution avec un fond considérablement réduit pour tous les types de cellules dérivées de l'hiPS et les conditions de chirurgie (figure 4). Des expériences non publiées de ce laboratoire utilisant cette technique modifiée de coloration DAB détectent des cellules hNA-positives dans les cerveaux de souris 56 jours après l'ICC doux. Dans l'ensemble, une procédure d'étiquetage des anticorps binaires a permis d'économiser du temps et a produit une immunostaining plus claire par rapport à la procédure traditionnelle d'étiquetage tertiaire ABC kit. Ce protocole pourrait être utile pour d'autres études précliniques de cellules humaines transplantées dans le système nerveux central de souris.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par une subvention du Center for Neuroscience and Regenerative Medicine (CNRM, numéro de subvention G170244014). Nous apprécions l'aide de Mahima Dewan et Clara Selbrede dans les études pilotes d'enlèvement d'adhésif. Kryslaine Radomski a effectué des lésions cérébrales préliminaires et des chirurgies de transplantation cellulaire. Amanda Fu et Laura Tucker, du laboratoire de base des études précliniques de l'USU CNRM, ont fourni des conseils précieux sur les chirurgies animales et les tests de comportement, respectivement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 - K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures - 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
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